激光共聚焦顯微鏡的原理與應(yīng)用范圍

1、激光共聚焦顯微鏡的原理與應(yīng)用范圍 激光掃描共聚焦顯微鏡是采用激光作為光源， 在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上采用共軛 聚焦原理和 裝置，并利用計(jì)算機(jī)對(duì)所觀察的對(duì)象進(jìn)行數(shù)字圖象處理的一套觀察、 分析和輸出系統(tǒng)。把光學(xué)成像的分辨率提高了 30%40%，使用紫外或可見光激 發(fā)熒光探針， 從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像， 在亞細(xì)胞水平上觀 察生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化，成為形態(tài)學(xué)，分子生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)，藥理學(xué)， 遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代的研究工具。1 激光掃描共聚焦顯微鏡（ LSCM ）的原理從基本原理上講 ,共聚焦顯微鏡是一種現(xiàn)代化的光學(xué)顯微鏡 ,它對(duì)普通光鏡從技術(shù) 上作了以下幾點(diǎn)改進(jìn) :11 用激光做光

2、源因?yàn)榧す獾膯紊苑浅：?,光源波束的波長相同 ,從根本上消除 了色差。 1 2 采用共聚焦技術(shù)在物鏡的焦平面上放置了一個(gè)當(dāng)中帶有小孔的擋 板 ,將焦平面以外的雜散光擋住 ,消除了球差 ;并進(jìn)一步消除了色差 13 采用點(diǎn)掃描技術(shù)將樣品分解成二維或三維空間上的無數(shù)點(diǎn) ,用十分細(xì)小的激 光束（點(diǎn)光源 ）逐點(diǎn)逐行掃描成像 ,再通過微機(jī)組合成一個(gè)整體平面的或立體的像。 而傳統(tǒng)的光鏡是在場光源下一次成像的 ,標(biāo)本上每一點(diǎn)的圖像都會(huì)受到相鄰點(diǎn)的 衍射光和散射光的干擾。這兩種圖像的清晰度和精密度是無法相比的。14 用計(jì)算機(jī)采集和處理光信號(hào) ,并利用光電倍增管放大信號(hào)圖 在共聚焦顯微鏡中 ,計(jì)算機(jī)代替了人眼或

3、照相機(jī)進(jìn)行觀察、攝像 ,得到的圖像是數(shù) 字化的 ,可以在電腦中進(jìn)行處理 ,再一次提高圖像的清晰度。而且利用了光電倍增 管 ,可以將很微弱的信號(hào)放大 ,靈敏度大大提高。由于綜合利用了以上技術(shù)?？梢?說LSCM是顯微鏡制作技術(shù)、光電技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)的完美結(jié)合，是現(xiàn)代技術(shù)發(fā)展的必然產(chǎn)物。2 LSCM在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用目前，一臺(tái)配置完備的LSCM在功能上已經(jīng)完全能夠取代以往的任何一種光學(xué) 顯微鏡,它相當(dāng)于多種制作精良的常用光學(xué)顯微鏡的有機(jī)組合 ,如倒置光學(xué)顯微 鏡、紫外線顯微鏡、熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡 （PH）、微分干涉 差顯微鏡（DIC ）等，因此被稱為萬能顯微鏡，通過它所得到的精

4、細(xì)圖像可使其他 的顯微鏡圖像無比遜色。2.1觀察活細(xì)胞、活組織LSCM在不損傷細(xì)胞的前提下 ，對(duì)活組織、活細(xì)胞進(jìn) 行觀察和測(cè)量，這不僅省去了繁瑣的樣品前期處理過程 （如脫水、脫蠟、染色等 ）; 而且觀察過的樣品還可以繼續(xù)用于其他的研究。 這種功能對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)、 轉(zhuǎn)基因 研究尤為重要。這可以說是LSCM最大的優(yōu)勢(shì)。2. 2 生化成分精確定位觀察配合專用的分子探針 ,對(duì)于要檢測(cè)的成分不僅可以定 位到細(xì)胞水平 ,還可以定位到亞細(xì)胞水平和分子水平2. 3 動(dòng)態(tài)觀察在同一樣品平面上隨時(shí)間進(jìn)行連續(xù)掃描 ,就可分析細(xì)胞結(jié)構(gòu)、 內(nèi)含、 和標(biāo)記等動(dòng)力學(xué)變化。目前在這方面做得最多的是使用LSCM觀察心肌或平滑 肌

5、細(xì)胞內(nèi)游離鈣、鈉、鉀離子濃度或pH的動(dòng)態(tài)變化。2. 4 數(shù)據(jù)、圖像的數(shù)字化用計(jì)算機(jī)代替了普通的照相機(jī) ,得到的圖像是數(shù)字化的 , 可及時(shí)輸出或長期儲(chǔ)存 ,而且還可進(jìn)一步加工處理。2. 5 定量測(cè)量首先應(yīng)用專一的熒光探針對(duì)樣品進(jìn)行染色 ,樣品的熒光強(qiáng)度和所測(cè) 成分的含量呈正比 ,如果其余條件固定 ,通過對(duì)比各組樣品之間的熒光強(qiáng)度值 ,可 得出特定成分的含量比。3 激光掃描共聚焦顯微鏡的使用（ cAMP 在體測(cè)量為例）3. 1 樣品制備3. 1. 1 切片 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本要求單層，并能很好地貼附在樣品池中。所以，組織標(biāo) 本無論是石蠟切片還是冰凍切片， 均為越薄越好。 常用的貼附劑有： 多聚賴氨酸， 伴刀

6、豆球蛋白，蛋清，瓊脂明膠 cell-Tak, vectabond 等。3. 1. 2 培養(yǎng)細(xì)胞 培養(yǎng)細(xì)胞可以滿足要求，如果用購置儀器時(shí)所帶的薄底培養(yǎng) 瓶進(jìn)行培養(yǎng)則更佳3. 1. 3 激光共聚焦觀察樣品處理注意事項(xiàng) 首先要盡量保持生物材料的天然狀態(tài)， 避免贗像、 變形和失真， 因此須將生物材 料做固定處理； 制片必須薄而透明， 才能在顯微鏡下成像， 除將材料切成薄片或 通過輕壓或其他手段使之分散外， 還需采用其他方法使它透明和染色， 以便更好 地觀察到結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)。需長期保存的制片， 還應(yīng)進(jìn)行脫水和封固。 顯微制片法一般包括切片法、 整體封片法、 涂片法和壓片法 4 類。3. 2 熒光探針的選擇熒

7、光探針的發(fā)展非常迅速，目前僅美國Molecular Probes公司就可提供1800多種 熒光探針 3，每年該公司還不斷推出新的熒光探針。通常每項(xiàng)檢測(cè)內(nèi)容或被測(cè)物 質(zhì)都有幾種或幾十種有關(guān)的或特異的熒光探針。 選擇合適的熒光探針是有效地進(jìn) 行實(shí)驗(yàn)并獲取理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果的保障。熒光探針的選擇主要從以下幾個(gè)方面考慮： (1)現(xiàn)有儀器所采用的激光器。如我校購進(jìn)的激光掃描共聚焦顯微鏡(ACASULTMA312，美國Meridian公司產(chǎn)品)采用氬離子激光器，激發(fā)波長為 351 364nm, 488nm, 514nm,可激發(fā)多種熒光探針； 熒光探針的光穩(wěn)定性和光漂 白性。在進(jìn)行熒光定量和動(dòng)態(tài)熒光監(jiān)測(cè)時(shí)， 要求

8、熒光探針有較好的光穩(wěn)定性越高 越好，也可通過減少激光掃描次數(shù)或降低激光強(qiáng)度的方法， 來減輕光漂白的程度。 但在進(jìn)行膜流動(dòng)性或細(xì)胞間通訊檢測(cè)時(shí)則需要熒光探針既有一定的光穩(wěn)定性又 要有一定的光漂白性； (3)熒光的定性或定量。僅做熒光定性或僅是觀察熒光動(dòng) 態(tài)變化時(shí)， 選擇單波長激發(fā)探針， 無需制作工作曲線。 做定量測(cè)量時(shí)最好選用雙 波長激發(fā)比率探針，利于制定工作曲線；(4)熒光探針的特異性和毒性。盡量選用毒性小、特異性高的探針；(5)熒光探針適用的pH。大多數(shù)情況下細(xì)胞的pH 在生理?xiàng)l件下，但當(dāng) pH 不在此范圍時(shí)，考慮適用該環(huán)境 pH 的熒光探針是有必 要的。同時(shí)應(yīng)注意染液自身的 pH 值會(huì)影響

9、帶電荷的熒光探針與胞內(nèi)組份之間的 結(jié)合，因此在染液的配備時(shí)需加以考慮。不同的熒光探針在不同標(biāo)本的效果常有差異， 除綜合考慮以上因素以外， 有條件 者應(yīng)進(jìn)行染料的篩選， 以找出最適的熒光探針。 此外，許多熒光探針是疏水性的， 很難或不能進(jìn)入細(xì)胞，需使用其乙酰羥甲基酯 (acetoxymethyl,AM)形式，也就是 熒光探針與 AM 結(jié)合后變成不帶電荷的親脂性化合物方易于通過質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞， 在細(xì)胞內(nèi)熒光探針上的 AM 被非特異性酯酶水解，去掉 AM 后的熒光探針不僅 可與細(xì)胞內(nèi)的靶結(jié)構(gòu)或靶分子結(jié)合且不易透出質(zhì)膜，從而能有效的發(fā)揮作用。 321 細(xì)胞內(nèi)游離鈣 美國分子公司提供的鈣熒光探針有 20多

10、種，激光掃描共聚焦顯微鏡常用的有 Fluo-3、Rhod-1、Indo-1、Fura-2等，前兩者為單波長激光探針，利用其單波長 激發(fā)特點(diǎn)可直接測(cè)量細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)態(tài)變化，為鈣定性探針；后兩者為雙波長激 發(fā)探針，利用其雙波長激發(fā)特點(diǎn)和比率技術(shù)，能定量細(xì)胞內(nèi)Ca2+ i，為鈣定量探針322 DNA 和 RNA核酸的熒光探針有 50 多種 2，用于激光掃描共聚焦顯微鏡的主要有 AcridineOrange吖啶橙，AO)、Propidium lodide(碘化丙啶，PI)。323 膜電位DiBAC4(3)為最常用的膜電位熒光探針5, DiBAC4(3)為帶負(fù)電荷的陰離子慢 反應(yīng)染料。該探針本身無熒光

11、， 當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞與胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合后才發(fā)出熒光， 測(cè)量時(shí)要求細(xì)胞浸在熒光染料中。 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加即膜電位增加示細(xì)胞去 極化；反之，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低即膜電位降低示細(xì)胞超極化。 Rhodamine 123 主要用于線粒體膜電位測(cè)量6。Rhodamine123是一種親脂性陽離子熒光探針， 當(dāng)線粒體膜內(nèi)側(cè)負(fù)電荷增多時(shí)，熒光強(qiáng)度增加，與 DiBAC4(3) 的表示形式相反。324 pH 值常用于偏中性pH即細(xì)胞胞漿pH檢測(cè)的熒光探針有SNARF類 (SNARF-1SNARF-calcein)、SNAFL 類(SNAFL-1、SNAFL-calcein)、BCECF 等, 這些探針均為疏水性探針，

12、需使用其 AM形式。FITC-dextran則適用于pH范圍 46之間7，如溶酶體pH的檢測(cè)，該探針也不能透過質(zhì)膜，但可通過細(xì)胞 胞飲作用進(jìn)入溶酶體，因此應(yīng)選擇分子量稍小的Dextra n(葡聚糖)。325 細(xì)胞內(nèi)活性氧基活性氧(active oxygen species可影響細(xì)胞代謝，與蛋白質(zhì)、核酸、脂類等發(fā)生反 應(yīng)，有些反應(yīng)是有害的， 因此測(cè)量活性氧在毒理學(xué)研究中有一定的意義。 根據(jù)檢 測(cè)活性氧的不同可選擇不同的熒光探針。常用熒光探針有Dichlorodihydrof-luorescein diacetate(2， 7-二氯二氫熒光素乙酰乙酸、 H2DCFDA) 2，其原理是不發(fā)熒光的 H

13、2DCFDA 進(jìn)入細(xì)胞后能被存在的過氧化物、氫過 氧化物等氧化分解為dichlorofluoresce in (DCF)而產(chǎn)生熒光，其反應(yīng)靈敏到 10-12mole水平，熒光強(qiáng)度與活性氧的濃度呈線性關(guān)系。326 細(xì)胞間通訊激光掃描共聚焦顯微鏡可采用熒光光漂白恢復(fù)FRAP技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞縫隙連接通訊，該方法的原理是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的熒光分子被激光漂白或淬滅，失去發(fā)光能力。 而臨近未被漂白細(xì)胞中的熒光分子可通過縫隙連接擴(kuò)散到已被漂白的細(xì)胞中， 熒 光可以逐漸恢復(fù)。 由于光漂白過程是不可逆的， 因此可通過觀察已發(fā)生熒光漂白 細(xì)胞其熒光恢復(fù)過程的變化量來判斷細(xì)胞縫隙連接的通訊功能。 采用 FRAP 技術(shù) 檢測(cè)細(xì)

14、胞間通訊常用熒光探針是6-carboxyfluorescein diacetate(6羧基熒光乙酰乙 酸、CFDA)。需用其酯化形式CFDA-AM。該技術(shù)可用于研究胚胎發(fā)生、生殖發(fā) 育、神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤發(fā)生等過程中縫隙連接通訊的基本機(jī)制和作用。由于 某些毒性物質(zhì)尤是促癌物可影響縫隙連接介導(dǎo)的物質(zhì)運(yùn)輸， 因此該方法也可用于 鑒別對(duì)縫隙連接作用有潛在毒性的化學(xué)物質(zhì)。327 細(xì)胞膜流動(dòng)性采用熒光光漂白恢復(fù)(FRAP)技術(shù)還可對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性進(jìn)行研究9。利用 NBD-C6-HPC 熒光探針標(biāo)記細(xì)胞膜磷脂，然后用高強(qiáng)度的激光束照射活細(xì)胞膜 表面的某一區(qū)域(12卩m),使該區(qū)域的熒光淬滅或漂白，再用較弱的激

15、光束照 射該區(qū)域?？蓹z測(cè)到細(xì)胞膜上其它地方未被漂白的熒光探針流動(dòng)到漂白區(qū)域時(shí)的 熒光重新分布情況。 熒光恢復(fù)的速率和程度可提供有關(guān)的信息， 如用于觀察細(xì)胞 受體介導(dǎo)內(nèi)吞過程中膜磷脂流動(dòng)性的變化情況。 NBD-C6-HPC 在溫度稍高時(shí)可 能會(huì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因此熒光染色和測(cè)量時(shí)應(yīng)在低于常溫的環(huán)境下進(jìn)行。 328細(xì)胞結(jié)構(gòu)、受體、蛋白質(zhì)、酶等 激光掃描共聚焦顯微鏡可獲得較一般普通光學(xué)顯微鏡分辨率高的細(xì)胞內(nèi)線粒體、 高爾基復(fù)合體、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、 溶酶體等細(xì)胞器圖象， 同時(shí)還可動(dòng)態(tài)觀察活細(xì)胞狀態(tài)下 細(xì)胞器的形態(tài)學(xué)變化情況，此外還可通過光學(xué)切片即斷層掃描技術(shù)進(jìn)行三維重 建，顯示細(xì)胞器的空間關(guān)系及其變化。適用于線

16、粒體的熒光探針較多，如Mitotracker、 DA SPMI、 DA SPEI、 JC-1、 Rhodamine 123等。高爾基復(fù)合體常用 的熒光探針有 NBD ceramide、BODIPY ceramide。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要用 Dil、DiOC6(3)。 溶酶體的熒光探針有DAMP、neutral rec。有報(bào)道選用NBC-PC標(biāo)記細(xì)胞膜、 Mitotracker標(biāo)記線粒體、Hoechst 33342標(biāo)記細(xì)胞核DNA，同時(shí)顯示細(xì)胞的三部 分結(jié)構(gòu)。33 激光掃描共聚焦顯微鏡的使用331 根據(jù)標(biāo)本選擇的熒光探針對(duì)激發(fā)波長選擇激光器類型。332 根據(jù)熒光探針的發(fā)射波長選擇相應(yīng)的濾片，K 凌鏡無濾片

17、掃描則不需要這一步。最好根據(jù)現(xiàn)有儀器配制選擇熒光探針。333 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適當(dāng)軟件。一般儀器的軟件分靜息狀態(tài)度圖像分析 軟件、動(dòng)態(tài)測(cè)量軟件和特殊軟件。334 按軟件要求設(shè)置有關(guān)參數(shù)，進(jìn)行觀察和分析。4 激光掃描共聚焦顯微鏡的功能 激光掃描共聚焦顯微鏡的功能主要分圖像處理功能和細(xì)胞生物學(xué)功能兩個(gè)方面 41 圖層處理功能411 組織光學(xué)切片：激光掃描共聚焦成像利用照明點(diǎn)與探測(cè)點(diǎn)共軛特性，可 有效抑制同一焦點(diǎn)平面上非測(cè)量點(diǎn)的雜散熒光及來自樣品中非焦平面的熒光， 從 而獲得普通光鏡無法達(dá)到的分辨率。 同時(shí)具有深度識(shí)別率和縱向分辨率。 它以一 個(gè)微動(dòng)步進(jìn)馬達(dá)控制載物臺(tái)的升降，可以逐層獲得高反差、高

18、分辨率、高靈敏度的二維光學(xué)橫斷面圖像，從而對(duì) 活的或固定的細(xì)胞及組織進(jìn)行無損傷的系列“光學(xué)切片” (Optical sectioning),得 到各個(gè)層面的信息。這種功能也被稱為“細(xì)胞 CT”或“顯微CT”。412 三圖像重建：激光掃描共聚焦顯微鏡通過薄層光學(xué)切片功能,可獲得真 正意義上的三維數(shù)據(jù), 經(jīng)過計(jì)算機(jī)圖像處理及三維重建軟件,沿 X、Y 和 Z 軸或其它任意角度來觀察標(biāo)本的外形及剖面, 并得到三維的立體結(jié)構(gòu), 從而能十分靈 活、直觀地進(jìn)行形態(tài)觀察,并揭示亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。 §413 細(xì)胞物理會(huì)生物化學(xué)測(cè)定：激光掃描共聚焦顯微鏡可進(jìn)行低光探測(cè)、活 細(xì)胞定量分析和重復(fù)極佳的熒

19、光定量分析,從而能對(duì)單細(xì)胞或細(xì)胞群的溶酶體、 線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨架、結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)、 DNA、RNA 、酶和受體分子等細(xì) 胞特異結(jié)構(gòu)的含量、組份及分布進(jìn)行定性、定量、定時(shí)及定位測(cè)定；同時(shí)還可測(cè) 定分子擴(kuò)散、膜電位、氧化還原狀態(tài)和配體結(jié)合等生化反應(yīng)變化程度。另外, 還可以對(duì)細(xì)胞的面積、平均熒光強(qiáng)度、積分熒光強(qiáng)度、細(xì)胞周長、形狀因子及細(xì) 胞內(nèi)顆粒數(shù)等參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)測(cè)定。 §414 熒光的定量、定位分析：激光掃描共聚焦顯微鏡可對(duì)單標(biāo)記或雙標(biāo)記細(xì) 胞及組織標(biāo)本的共聚焦熒光進(jìn)行定量分析,并顯示熒光沿 Z 軸的強(qiáng)度變化；同 時(shí)還可自動(dòng)將熒光圖像與象差圖像重疊以顯示熒光在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的精確定位。 還

20、 可測(cè)量標(biāo)本深層的熒光分布。 也適用于高靈敏度的快速熒光測(cè)定, 準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)抗 原表達(dá)、熒光原位雜交斑點(diǎn)及細(xì)胞結(jié)合和殺傷的形態(tài)學(xué)特性,并作定量分析4.1.5 Ca2+、pH及其它細(xì)胞內(nèi)離子的實(shí)時(shí)定量測(cè)定：利用Flu-3、lndo-1、Fura-Red 等多種熒光探針，激光掃描共聚焦顯微鏡能完成活細(xì)胞生理信號(hào)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)各種離子（Ca2+、K+、Na+、Mg2+和pH）的比例及動(dòng)態(tài)變化作毫秒 級(jí)實(shí)時(shí)定量分析；可以定量探測(cè)胞質(zhì)中（Ca2+對(duì)腫瘤啟動(dòng)因子、化學(xué)因子、生長 因子及各種激素等刺激反應(yīng)；使用熒光探針Flu-3和SNARF可同時(shí)測(cè)定Ca2+和 pH值。4. 2細(xì)胞生物學(xué)功能4.

21、2. 1熒光光漂泊恢復(fù)（FRAP）技術(shù)：激光掃描共聚焦顯微鏡能借助于高強(qiáng)度 脈沖式激光照射細(xì)胞的某一區(qū)域， 從而造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅，其周圍的 非淬滅熒光分子將以一定速率向受照區(qū)域擴(kuò)散，擴(kuò)散速率可直接進(jìn)行監(jiān)測(cè)，由此揭示細(xì)胞結(jié)構(gòu)和各種變化的機(jī)制，用于研究細(xì)胞骨架構(gòu)成、核膜結(jié)構(gòu)和大分子組 裝等。同樣作為第二信使，環(huán)腺嚓吟單核昔酸cAMP的研究也同樣為人們所關(guān) 注:Nagai等利用FRET來觀察cAMP誘導(dǎo)的磷酸化，得到了活細(xì)胞中蛋白激酶 A 的動(dòng)態(tài)變化曲線.在Cameleons-2的改造上，Pearce等利用Cameleons標(biāo)記金 屬硫蛋白（MT）,研究了一氧化氮刺激下 MT的功能.4.

22、2. 2胞間通訊的研究：激光掃描共聚焦顯微鏡通過測(cè)量細(xì)胞縫隙連接介導(dǎo)的 分子轉(zhuǎn)移，觀察相鄰細(xì)胞之間的胞間通訊。用于研究腫瘤啟動(dòng)子、生長因子以及 細(xì)胞內(nèi)Ca2+、pH和cAMP對(duì)縫隙連接和胞間通訊的影響。4. 2. 3細(xì)胞膜流動(dòng)性測(cè)定：激光掃描共聚焦顯微鏡可通過專用計(jì)算機(jī)軟件，對(duì) 細(xì)胞膜流動(dòng)性進(jìn)行定量和定性分析，在研究膜的磷脂酸組成分析、藥物效應(yīng)和作 用位點(diǎn)、溫度反應(yīng)測(cè)定及物種比較等方面有重要作用。4. 2. 4光活化技術(shù)：激光掃描共聚焦顯微鏡具有光活化測(cè)定功能，可以控制籠 鎖探針分解的瞬間光波長和照射時(shí)間，從而人為地控制多種生物活性產(chǎn)物及其它 化合物發(fā)揮作用的時(shí)間和空間，以此研究可形成籠鎖化合

23、物的許多重要活性物質(zhì)（如神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)第二信使 cAMP、核苷酸、Ca2+及某些熒光素等）在細(xì) 胞增殖、分化等生物代謝過程中的作用。通過上述介紹，共聚焦顯微鏡強(qiáng)大的功能已可見一斑。與其他的生物學(xué)技術(shù)（如免 疫組化技術(shù)、原位雜交技術(shù)等）相配合，它的檢測(cè)范圍進(jìn)一步擴(kuò)大。我們幾乎可利 用共聚焦顯微鏡定性、定量地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的任何一種生化成分激光共聚焦掃描顯微技術(shù)(Confocal laser scanning microscopy )是一種高分辨率的顯微成像技術(shù)。普通的熒光光學(xué)顯微鏡在對(duì)較厚的標(biāo)本(例如細(xì)胞)進(jìn) 行觀察時(shí)，來自觀察點(diǎn)鄰近區(qū)域的熒光會(huì)對(duì)結(jié)構(gòu)的分辨率形成較大的干擾。共聚焦顯微技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)在于，每次只對(duì)空間上的一個(gè)點(diǎn)(焦點(diǎn))進(jìn)行成像，再通 過計(jì)算機(jī)控制的一點(diǎn)一點(diǎn)的掃描形成標(biāo)本的二維或者三維圖象。在此過程中，來自焦點(diǎn)以外的光信號(hào)不會(huì)對(duì)圖像形成干擾，從而大大提高了顯微圖象的清晰度 和細(xì)節(jié)分辨能力。specimen圖1.共聚焦顯微鏡簡化原理圖圖1是一般共聚焦顯微鏡的工作原理示意圖。用于激發(fā)熒光的激光束(Laser)透過入射小孔(light source