淺論黃孢原毛平革菌產(chǎn)木素過氧化酶

1、淺論黃孑旬原毛平革菌產(chǎn)木素過氧化酶文章標(biāo)題：淺論黃鞄原毛平革菌產(chǎn)木素過氧化酶摘要：本實驗先采用正交設(shè)計法對黃胞原毛平革菌產(chǎn)木素過氧化物酶的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，再通過放大實驗對最佳培養(yǎng)條件進行驗證，最終得出結(jié)果：最佳培安 0.2g/l、吐溫-80： 0. 2g/lo養(yǎng)條件主要參數(shù)為：ph4.5、葡萄糖:10g/l、酒石酸關(guān)鍵詞：黃砲原毛平革菌，木素過氧化酶黃?s原毛平革菌，(phanerochaetechrysospor i um,簡 稱p. chrysospor i um)是一種絲狀真菌，區(qū)別于單細胞 微生物。菌對底物進行降解時，其次生代謝活動對反應(yīng) 環(huán)境的要求較為苛刻，需要一定的營養(yǎng)組分和嚴(yán)格

2、的 偏酸環(huán)境(ph約4. 5左右)。其對底物(染料)的降解 主要是依靠其次生代謝產(chǎn)物一一胞外木素分解酶系。 胞外木素分解酶系的發(fā)現(xiàn)是利用黃砲原毛平革菌降解 木質(zhì)素研究的重大進展。該酶系是一組同功酶，由兩 類酶構(gòu)成：木素過氧化物酶(ligninperoxidases,簡 稱 lip)和猛過氧化物酶(mndependentperoxidases, 簡稱mnp)o kirktk1小組于1983年首次從黃抱原毛 平革菌培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)木素過氧化物酶，并發(fā)現(xiàn)該酶與賴猛酶(mnp)、漆酶(laccase)構(gòu)成木素降解酶體系,該酶系有一個很重要的特點，就是它對底物的氧化是高度非特異性的，廣泛研究表明，該菌可以降

3、解多種 染料，包括偶氮類、三苯甲烷類、雜環(huán)類、聚合染料 等，在染料廢水處理方面具有廣泛的應(yīng)用前景2,目 前該菌已成為這類研究的模型菌種。在國外，利用黃 鞄原毛平革菌降解各種結(jié)構(gòu)各異的污染有機物已經(jīng)成為一個非常熱門的研究方向，他們已在木素降解酶系的生產(chǎn)、酶系的性質(zhì)、酶系的分子生物學(xué)研究和利用 酶系降解有機污染物方面作了大量的工作。而我們國 內(nèi)的研究卻起步比較晚，開始于九十年代初，主要在 木素過氧化物酶的生產(chǎn)條件和木素酶漂白紙漿廢水方面進行了一些探索。3past i 4已完成了 p. chrysospor i um 產(chǎn)生的 l i p 對 22 種偶氮染料的氧化速率的測定。而且在整個合成階段lip

4、的合成量要比mnp大得多，再加上lip能降解木質(zhì)素的模型物，因此lip在木質(zhì)素的降解中起著主導(dǎo)作用，成為后來的主要研究酶。5本文主要通過對黃砲原毛平革菌培養(yǎng)條件進行優(yōu)化一正交設(shè)計法對培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化，再通過放大實驗對最佳培養(yǎng)基條件進行驗證比較。從而最終確定對黃抱原毛平革菌產(chǎn)木素過氧化酶最有利的培養(yǎng)基方案。1材料和方法1.1材料1.1.1試驗材料菌種黃孑句原毛平革菌（中國科學(xué)院微生物所5. 776) o斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（pda培養(yǎng)基）：馬鈴 薯煮汁10ooml,蔗糖20g,瓊脂20g，ph4. 86. 0?；九囵B(yǎng)基：葡萄糖，酒石酸錢，吐溫-80,以上成分的量按正交表設(shè)計添加。醋酸

5、緩沖液10mmol/l(ph4. 5), kh2p042g/l, vb11mg/l, 0. 5m 藜蘆醇溶液1.0ml/100ml,微量元素混合液70ml/l,注意此時分不同 ph 值（4.0、4.5、6.0）o微量元素混合液（l-1 ）：氨基乙酸:0. 5g, mgs04 -7h20： 3g, naci： 11g, fes04 7h20： 0. 1g, cos04： 0. 1g,caci2 2h20： 0. 1g, zns04 7h20： 0. 19g, cus04 5h20：0. 01g, aik (s04) 2 12h20： 0. 01g, h2b03： 0. 01g,na2mo 2h2

6、0： 0.01g, mns04 h20： 0.01g。0.1標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：準(zhǔn)確稱取1g無水葡萄糖（預(yù)先于100105 °c烘干）,用水溶解,加5ml濃鹽酸,水定容至woomlo斐林試劑1.1.2儀器設(shè)備溫控搖床，太倉市華美生化儀器廠； 紫外可見分光光度計（uv-9100），北京市瑞利分析儀器公司。1.2. 1基本培養(yǎng)條件pda培養(yǎng)基培養(yǎng)5d的菌絲體加入到無菌水當(dāng)中，適當(dāng)攪拌，進行胞子計數(shù)。然后按照不同的量接入到250ml三角瓶中，三角瓶裝液量100ml,接種量（以抱子計）1.0x106ml-1；培養(yǎng)溫度：37°c,轉(zhuǎn)速：150r/min,培養(yǎng) 6d。1.2.2酶活測定方法

7、木素過氧化物酶（lip）活力的測定（用氧化黎蘆醇的速率表示）。1ml反應(yīng)液中含0. 2ml藜蘆醇溶液、0. 4mi酒石酸緩沖 液（250mmol/l, ph3. 0）、0. 4ml 培養(yǎng)液或稀釋液、20 u lh202 溶液（20mmol/l）,于 30°c反應(yīng) 2min,測 310nm 波長下的吸光度（e ）變化。一個酶活力單位（u）定 義為每分鐘氧化黎蘆醇產(chǎn)生1 u mol/l黎蘆醛所需的 酶量。1.2.3葡萄糖殘?zhí)菧y定（斐林法）61.2. 4菌體干重測在1 2發(fā)酵過程中，每隔一天時間從發(fā)酵罐中取一定體積的發(fā)酵液，用已稱重的干燥濾紙進行過濾。而后將濾紙（連帶菌體）在100

8、6;c左右烘箱中烘至恒重，減去濾紙重量，即得菌體干重。1.2.5放大培養(yǎng)利用最優(yōu)方案及比擬放大對該最佳方案進行放大試驗，記錄整個過程中ph、d02、殘?zhí)橇俊⒕w干重、木素過氧化酶酶活的變化。2結(jié)果與討論2.1確定最佳培養(yǎng)時間在靜置和搖床培養(yǎng)條件下測定黃砲原毛平革菌5. 776產(chǎn)木素過氧化物酶(lip)活力隨培養(yǎng)時間的變化，結(jié)果如圖1, lip活力在第6d出現(xiàn)峰值，達到69. 1u/lo lip屬于次級代謝產(chǎn)物，與菌體生長不同步7,且lip的合成與菌體生長是非偶聯(lián)的。由此確定第6d是研究培養(yǎng)條件改變對lip活力影響最適時間。8圖1：對照酶活變化曲線2. 2正交表的選擇選取ph、葡萄糖、酒石酸錢、

9、吐溫-80為考察因素，每個因素取3個水平，按正交表l9(34)來設(shè)計實驗9，正交表如下：表1正交試驗因素水平的安排10因素水平phb葡萄糖(g/l)酒石酸鍍(g/l)吐溫-80 (g/l)133.04. 56. 02. 05. 010. 00. 20. 51.00. 20. 51.02. 3數(shù)據(jù)分析從上述結(jié)果可以做出判斷：在其它條件相同的情況下,培養(yǎng)基中碳源(葡萄糖)豐富時更有利于黃砲原毛平革菌產(chǎn)木素過氧化酶，相比其他，其酶活性高出23倍。同時，根據(jù)喻國策等11的研究也表明，木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生受氮濃度條件影響，低氮濃度有利于酶的產(chǎn)生，高氮濃度則抑制酶的產(chǎn)生。2. 3.1數(shù)據(jù)處理與分析表2正交試

10、驗結(jié)果分析表因素水平abcdxi酶活力(u/l)12345678. 181.0lip含量k1k2k3sk1k2k3r136. 7159. 8135. 5125. 145. 653. 345. 28. 1115. 665. 4250. 06106. 838. 521.883. 761. 9157.4126. 9147. 7161.952. 542. 349. 210. 2172. 3128. 6131. 1401.557. 442. 943. 714. 5總和432st二6795. 32. 3. 2變量分析表3li p活力方差分析表方差來源平方和自由度均方f值顯著性abcd125. 065977

11、.51161.89418. 98262. 532988. 7680. 95204. 4947. 801.293.27*不顯著不顯著f0. 05 (2, 2) =19.0； f0. 025 (2, 2) =39. 01224確定最優(yōu)培養(yǎng)基方案2.4.1確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方從極差和方差分析中看出影響黃孑包原毛平革菌產(chǎn)木素過氧化物歧化酶的因素的主次順序為葡萄糖濃度（碳源）ph,其中酒石酸錢濃度和吐溫-80濃度對木素過氧化物歧化酶活力的增加的影響不明顯，葡萄糖濃度的影響則為很顯著。而ph對酶活力影響很小（誤差）。所以正交實驗的最佳培養(yǎng)基條件為a2b3c1d1,即ph在4. 5,葡萄糖（碳源）含量為10.

12、 og/l,酒石酸胺（氮源）含量為0. 2g/l,吐溫-80含量為0. 2g/l時為最優(yōu)培養(yǎng)基方案。2. 4. 2放大試驗利用最優(yōu)方案對該實驗進行放大試驗，具體方案如下:培養(yǎng)液體積：3l、ph4.5、葡萄糖:10g/l、酒石酸鉉:0. 2g/l、吐溫-80： 0. 2g/l、醋酸緩沖液 10mmol/l (ph4. 5), kh2p042g/l, vb11mg/l, 0. 5m 藜蘆醇溶液 (va) 10ml/l,微量元素混合液70ml/l、溫度：37°c、接種量:1.0x109個孑句子/l、轉(zhuǎn)速：80r/min,培 養(yǎng)時間為8小測定酶活方法同上，同時，測定菌體干重、d02值、ph變

13、化以及殘?zhí)呛?，結(jié)果如下： 綜合上述兩圖（圖2和圖3）可知，黃胞原毛平革菌生 長的遲緩期很短，在曲線中基本上無法體現(xiàn)出來。不 過對于一般生產(chǎn)周期較短的真菌而言，這是比較正常 的。而菌體的對數(shù)生長期則較明顯（13d）,此過程 中黃鞄原毛平革菌以最大的速率生長和分裂，菌體數(shù) 量呈對數(shù)增加，而且菌體內(nèi)各成分也按照同樣的比例 有規(guī)律的增加，由于黃孑旬原毛平革菌是好氧微生物， 所以在生長的同時大量的消耗氧氣，導(dǎo)致d02值明顯 下降。隨著菌體的生長，也伴隨著生長代謝產(chǎn)物的生 成，對于黃范原毛平革菌來說，主要的代謝產(chǎn)物是過 氧化物酶和乙二醛氧化酶。隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，代 謝產(chǎn)物積累和ph等環(huán)境的變化，逐步不

14、宜黃抱原毛平革菌的生長，導(dǎo)致生長速率逐漸降低，從而進入穩(wěn)定 期，這個階段也就是黃鞄原毛平革菌產(chǎn)木素過氧化酶 的最佳時間，即培養(yǎng)過程中的47d,此階段木素過 氧化酶的酶活性最高，具體出現(xiàn)在培養(yǎng)的第7d,酶活 高達110u/l，比同時期搖床培養(yǎng)最高酶活（91.9u/l） 高接近20u/lo隨著氮源（酒石酸錢）的耗盡，菌體也開始死亡，自溶，從而造成ph和溶氧的回升。3結(jié)論黃砲原毛平革菌產(chǎn)木素過氧化酶的最佳培養(yǎng)條件為: 胺（氮源）含量為0. 2g/l,吐溫-80含量為0. 2g/lo 但在實驗過程中我們也發(fā)現(xiàn)，在氮源耗盡時還有相當(dāng)ph 在 4.5,葡萄糖（碳源）含量為10.0g/l,酒石酸量的葡萄糖存

15、在，約在6g/l左右，所以可考慮適當(dāng)降低培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，以減少資源浪費，增加效益。作者簡介：鄭銳東（1982-）,男，學(xué)士，揭陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系助教，主要從事微生物工程的相關(guān)工作。參考文獻：1 丁佐龍，邢邦啟木素過氧化物酶合成的部分影響因素j 合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）,1998,6（21） :1 2.2 章燕芳，李華鐘，華兆哲等黃抱原毛平革菌合成的 木質(zhì)素過氧化物酶、猛過氧化物酶及其菌球在染料脫 色過程中的作用j 過程工程學(xué)報,2002,3(2) :246.3 梁園園，張朝暉,周嘵云黃胞原毛平革菌木素降解酶系的研究進展j.工業(yè)微生物,2003,4(33) :4243.4 pa

16、st i mb, paszczynsk i a, goszczynsk i s,eta i. infl uenceofaromat i csubst i tut i onpatternsonazodyedeg radab i i i tybystretomycessp. andphanerochaetechry sospor i umj. app i. env i ron. microbiol. , 1992, 58 (11):36053613.5 張朝暉，夏黎明，林建平等黃鞄原毛平革菌培養(yǎng)合 成木素過氧化物酶研究j。浙江大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，1999,2(33) :132133.6 華南理工大學(xué)等工業(yè)發(fā)酵分析m 北京：中國輕工業(yè)出版社,2003. 1617.刀劉穩(wěn)，李楊，高培基等過氧化物酶研究進展j 纖維素科學(xué)與技術(shù),2000, 8(2) :5064.8 楊曉寬，杜連祥，路福平等.白腐菌產(chǎn)猛過氧化物酶