細胞生物學(xué)實驗指導(dǎo)標準

1、實驗一葉綠體的分離與熒光觀察1. 實驗?zāi)康牧私馊~綠體分離的一般原理和方法，并熟悉應(yīng)用熒光顯微鏡方法觀察葉綠體 熒光現(xiàn)象。2. 實驗原理葉綠體是植物細胞中較大的一種細胞器，能發(fā)生特有的能量轉(zhuǎn)換。利用低速 離心機可以分離葉綠體，其分離在等滲溶液(o.35mol/l氯化鈉或0.4mol/l蔗糖溶 液)中進行，目的是為了防止?jié)B透壓的改變引起葉綠體的損傷。將勻漿液在 1000r/min離心，去除其中的組織殘渣和一些未被破的完整細胞，然后，3000r/min 離心，可獲得沉淀的葉綠體(混有部分細胞核)。在室溫下進行分離要迅速。某些物質(zhì)在一定短波長的光(如紫外光)的照射下吸收光能進入澈發(fā)態(tài)，從 激發(fā)態(tài)回到基

2、態(tài)時，就能在極短的時間內(nèi)放射出比照射光波長更長的光(如可見 光)，這種光就稱為熒光。若停止供能，熒光現(xiàn)象立即停止。有些生物體內(nèi)的物質(zhì) 受激發(fā)光照射后，可直接發(fā)出熒光(稱為自發(fā)熒光)，如葉綠素的火紅色熒光。有 的生物材料本身不發(fā)熒光，但它吸收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光(稱為間接熒 光)，如葉綠體吸附口丫喘橙后可發(fā)橘紅色熒光本實驗利用熒光顯微鏡對發(fā)熒光的葉 綠體進行觀察。3. 實驗材料、用品(1) 實驗材料：菠菜葉片(2) 實驗藥品：蒸餡水，0.35mol/l氯化鈉溶液，0.01%口丫啜橙。(3) 實驗儀器：普通離心機，組織搗碎機，天平，熒光顯微鏡，顯微鏡，載玻 片，蓋玻片，鑲子，接種針，目鏡測微

3、尺，物鏡測微尺，恒溫箱，培養(yǎng)皿，濾紙, 試管，試管架，移液管，滴管，燒杯，無熒光載片，蓋玻片，離心管。4. 實驗步驟(1) 選取新鮮的菠菜嫩葉，洗擦干后去除葉梗及粗脈，稱3g于0.35mol/l氯化 鈉溶液15ml中置組織搗碎機或研缽中。(2) 利用組織搗碎機低速(5000r/min )勻漿，35min,或研磨成勻漿。(3) 用6層紗布過濾，濾液盛于燒杯中。(4) 取濾液4ml在1000r/min下離心2min,棄去沉淀。(5) 將上清液在3000r/min下離心5min,棄去上清液，沉淀即為葉綠體(混有 部分細胞核)。(6) 沉淀用0.35mol/l氯化鈉溶液懸浮。(7) 取葉綠體懸液1滴置

4、于載玻片上，加蓋玻片后用普通光學(xué)顯微鏡觀察。使 用熒光顯微鏡觀察時，將葉綠體懸液滴在無熒光的載玻片上，再滴加1滴0.01%叮 啜橙熒光染料，蓋上無熒光的蓋玻片后即可觀察。(8) 觀察葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、測量l5個葉綠體的長軸和短軸、葉綠體發(fā)射熒光 的現(xiàn)象。5. 實驗報告(1) 觀察葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，測量5j0個葉綠體的長軸和短軸求其平均值。(2) 記錄熒光顯微鏡下觀察的葉綠體自發(fā)熒光和次生熒光現(xiàn)象，分析結(jié)果。6. 思考題(1) 分離葉綠體實驗的原理是什么？操作過程中應(yīng)注意什么？(2) 普通光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡的原理有何異同點？實驗二 線粒體和液泡系的超活染色與觀察活體染色是能使生活有機體的細胞

5、或組織特異性著色但對活樣品又沒有毒害 作用的一種活體染色方法，其目的是顯示生活細胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細胞 的生命活動和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細胞的死亡?；铙w染色技術(shù)可用 來研究生活狀態(tài)下的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。通常把活體染色分為體內(nèi)活體染色與體外活體染色兩類。體外活體染色又稱 超活染色，它是由活的動、植物分離出部分細胞或組織小塊，以染料溶液浸染， 染料被選擇固定在活細胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色?；铙w染料之所以能固定、堆積在 細胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是靠染料的“電化學(xué)”特性。堿性染料的膠粒表面 帶陽離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子 或陽離子，這樣

6、，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活 體染色，理論上應(yīng)選擇那些對細胞無毒性或毒性極小的染料，且使用時需要配成 稀淡的溶液。一般說來，最為適用的是堿性染料，這可能是因為它具有溶解在類 脂質(zhì)(如卵磷脂、膽固醇等)的特性，易于被細胞吸收。詹納斯綠b仃anus green b) 和中性紅(neutral red)兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對于線粒體 和液泡系的染色分別具有專一性。1實驗?zāi)康?1) 觀察動、植物活細胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布；(2) 學(xué)習(xí)一些細胞器的超活染色技術(shù)。2. 實驗原理線粒體是細胞內(nèi)一種重要細胞器，是細胞進行呼吸作用的場所。細胞的各項活

7、 動所需要的能量，主要是通過線粒體呼吸作用來提供的?；铙w染色是應(yīng)用無毒或 毒性較小的染色劑真實地顯示活細胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)而又很少影響細胞生命活動的一 種染色方法。詹納斯綠b是線粒體的專一性活體染色劑。線粒體中細胞色素氧化 酶使染料保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài))呈藍綠色，而在周圍的細胞質(zhì)中染料被還原， 成為無色狀態(tài)。中性紅為弱堿性染料，對液泡系(即高爾基體)的染色有專一性，只將活細胞中 的液泡系染成紅色，細胞核與細胞質(zhì)完全不著色，這可能是與液泡中某些蛋白質(zhì) 有關(guān)。3. 實驗用品(1) 器材顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、鑲子、雙面刀片、解剖盤.載玻片、 凹面載玻片、蓋玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙。

8、(2) 試劑%1 ringer溶液：氯化鈉0. 85g (變溫動物用0. 65g)氯化鉀025g氯化鈣0. 03g蒸餡水100ml%1 10%、1/3000中性紅溶液：稱取05g中性紅溶于50ml ringer液，稍加熱(30-40°c)使之很快溶解，用濾 紙過濾，裝入棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，失去染色能力。臨用前，取 已配制的1%中性紅溶液lml,加入29ml ringer溶液混勻，裝入棕色瓶*備用。%1 1%、1/5000詹納斯綠b溶液稱取50mg詹納斯綠b溶于5ml ringer溶液中，稍加微熱(30-40°c),使之溶 解，用濾紙過濾后，即為1%原液。取1%

9、原液1 ml加入49ml ringer溶液，即成 1/5000 x作液裝入瓶中備用。最好現(xiàn)用現(xiàn)配，以保持它的充分氧化能力。材料人口腔上皮細胞，洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，黃豆(擬南芥)幼根根尖。4. 實驗方法4. 1人口腔粘膜上皮細胞線粒體的超活染色與觀察(1) 清潔載玻片放在37°c恒溫水浴鍋的金屬板上。(2) 滴2滴1/5000詹納斯綠b染液。(3) 用牙簽口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細胞。(4) 刮下的粘液狀物放大載玻片的染液滴中。(5) 染色10-15min (注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液)。(6) 蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察。注意：a、實驗者用牙簽寬頭在自己口腔頰粘膜處稍用力刮取

10、上皮細胞，將刮下的粘 液狀物放入載玻片的染液滴中，染色10-15min (注意不可染液干燥，必要時可再加 滴染液)，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢了的染液，置顯微鏡下觀察。b、在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細胞，換高倍鏡或油鏡進行觀察?？梢?扁平狀上皮細胞的核周圍胞質(zhì)中，分布著一些被染成藍綠色的顆粒狀或短棒狀的 結(jié)構(gòu)，即是線粒體。4. 2洋蔥鱗莖表皮細胞線粒體的超活染色觀察用吸管吸取1/5000詹納斯綠b染液，滴1-2滴于干凈的載玻片上，然后， 撕取一小片洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，置于染液中，染色10-15min.(2) 用吸管吸去染液，加一滴ringer液，注意使內(nèi)表皮組織展平，蓋上蓋玻片 進行觀察。

11、(3) 在高倍鏡下，可見洋蔥表皮細胞中央被一大液泡所占據(jù)，細胞核被擠至一 側(cè)貼細胞壁處.仔細觀察細胞質(zhì)中線粒體的形態(tài)與分布。4. 3植物細胞液泡系的超活染色與觀察(附加實驗) 取豆芽的根尖用刀片縱切根尖，放入中性紅染液滴中，染色5-10mino(2) 吸去染液，滴一滴ringer液。(3) 蓋上蓋玻片進行鏡檢(鍛子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察。 在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長點的細胞，可見細胞質(zhì)中散在很多大 小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長點向延 長區(qū)觀察，在一些已分化長大的細胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。 在成熱區(qū)細胞中，一般只有一個淡

12、紅色的巨大液泡，占據(jù)細胞的絕大部分，將細 胞核擠到細胞一側(cè)貼近細胞壁處。(5)從以上的觀察結(jié)果，想想標題物細胞液泡系的形態(tài)演進情況。5. 實驗結(jié)果6. 實驗報告繪口腔上皮細胞示線粒體的形態(tài)與分布。實驗三線粒體的分離與觀察1. 實驗?zāi)康挠貌钏匐x心法分離動、植物細胞線粒體。2. 實驗原理線粒體(mitochondria)是真核細胞特有的，是能量轉(zhuǎn)換的重要細胞器。細 胞中能源物質(zhì)一脂肪、糖、部分氨基酸在此進行最終的氧化，并通過耦聯(lián)磷酸化 生成atp,供給細胞生理活動之需。對線粒體結(jié)構(gòu)與功能的研究通常是在離體的線 粒體上進行的。制備線粒體采用組織勻漿在懸浮介質(zhì)中進行差迷離心的方法。在一給定的離 心場中

13、(對于所使用的離心機，就是選用一定的轉(zhuǎn)速)，球形顆粒的沉降速度取決 于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的粘度。在一均勻懸浮介質(zhì)中離心一定時間內(nèi)，組 織勻漿中的各種細胞器及其它內(nèi)含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位 置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在 離心管底部，從而分批收集。細胞器中最先沉淀的是細胞核，其次是線粒體，其 它更輕的細胞器和大分子可依次再分離。懸浮介質(zhì)通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細胞質(zhì)的分散相，在一定程度 上能保持細胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性，在ph7. 2的條件下，亞細胞組分不容易重新 聚集，有利于分離。整個操作過程應(yīng)注意使樣品保持4°c,

14、避免酶失活。線粒體的鑒定用詹納斯綠活染法。詹納斯綠b (janusgreenb)是對線粒體專一 的活細胞染料，毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸引堆積在線 粒體膜上。線粒體的細胞色素氧化酶使該染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍綠色從而使 線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無色。本實驗介紹大鼠肝和玉米線粒體的分離。i、大鼠肝線粒體的分離1-1.實驗用品材料：大鼠肝臟試劑生理鹽水。1 %詹納斯綠b染液，用生理鹽水配制。0. 25mol /l 蔗糖+0.01 mol/l tris-鹽酸緩沖液（pii7. 4）0. 1 mol/l三經(jīng)甲基氨基甲烷(tris)10ml0. 1 mol /l 鹽酸8.

15、4ml加重蒸水到100ml加蔗糖到025 niol/l。蔗糖為密度梯度離心用d(+)蔗糖(4) 0. 34mol /l 蔗糖+0. 01 mol /ltris-鹽酸緩沖液(pii7. 4)(5) 固定液：甲醇-冰醋酸(9： 1)(6) 姬姆薩染液：giemsa粉05克，甘油33ml,純甲醇33ml。先往giemsa 粉中加少量甘油在研缽中研磨至無顆粒，在將剩余甘油倒入混勻，56°c,左右保 溫2小時令其充分溶解，最后加甲醇混勻，成為姬姆薩原液，保存于棕色瓶。用 時吸出少量用l/15mol/l磷酸鹽緩沖液作10-20倍稀釋。l/15mol/l磷酸鹽緩沖液(ph68):1 /15 mol

16、 /l kh2p0450ml1 / 15 mol /lna2hp0450ml器材高速離心機、解剖刀剪、小燒杯、冰浴、漏斗、尼龍織物、玻璃勻漿器。i -2.實驗方法(1)制備大鼠肝細胞勻漿。實驗前大鼠空腹12h,擊頭處死，剖腹取肝，迅速 用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干。稱取肝組織2g,剪碎，用預(yù)冷到0-4°c的0. 25mol 兒緩沖蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后在0-4°c條件下，按每克肝加9ml冷的0. 25 mol 兒緩沖蔗糖溶液將肝組織勻漿化，蔗糖溶液應(yīng)分數(shù)次添加，勻漿用雙層尼龍織物 過濾備用。注意盡可能先充分剪碎肝組織，縮短勻漿時間，整個分離過程不宜過 長，以保持組分生理活

17、性。 差速離心。先將911110. 34mol/l緩沖蔗糖溶液放人離心管，然后沿管壁 小心地加入9ml肝勻漿使其覆蓋于上層。用冷凍控溫高速離心機按圖1順序進行 差速離心。(3) 分離物鑒定。%1 細胞核：取細胞核沉淀一滴涂片，人甲醇-冰醋酸液固定15min,充分吹 干，滴姬姆薩染液(原液10-20倍稀釋)染色10mino自來水沖洗，吹干，鏡檢。結(jié) 果：細胞核紫紅色，上面附著的少量胞質(zhì)為淺藍色碎片。%1 線粒體：取線粒體沉淀涂片(注意勿太濃密)，不待干即滴加1 %詹納斯綠 b染液染20min,覆上蓋玻片，鏡檢。線粒體藍綠色，呈小棒狀或啞鈴狀。實驗注意事項如果使用不帶冷凍控溫的普通高速離心機操作，

18、應(yīng)盡量縮短操作時間、注意 樣品的冷凍，保持其生理活性。i -3作業(yè)將線粒體沉淀作一涂片，用姬姆薩染色，檢查是否混雜細胞核和胞質(zhì)碎片， 估計分離所得線粒體的純度。根據(jù)你的實際體會，寫出操作注意事項及改進方法。 i -4.思考題1分離介質(zhì)025mol /l及0. 34mol兒緩沖蔗糖溶液哪一種在下層?有什么作用？ 2分離出的線粒體立即用詹納斯綠b染色和放置室溫2h后再染色，比較二者著色 的差異。ii.玉米線粒體的分離從植物細胞分離線粒體，除了作線粒體功能測定外，在植物細胞遺傳工程中， 常用于分離核外基因一線粒體dna等目的。分離線粒體的方法仍采用均勻介質(zhì)中的差速離心。介質(zhì)中0. 25mol /l蔗

19、糖也 可以用0. 3mol /l甘露醇代替°edta整合二價陽離子，ca"除去后細胞間粘著解體, 促使組織分散成單個細胞。牛血清白蛋白(bsa)能包在細胞外面，并作為競爭性底 物削弱蛋白酶的作用。n-i.實驗用品材料玉米黃化幼苗(水稻、高粱等幼苗均可)。試劑(1) 分離介質(zhì)：0. 25mol/l蔗糖,50 mmol/ 1的tris-鹽酸緩沖液(ph7. 4), 3 mmol /l edta, 0. 75mg/ml 牛血清白蛋白(bsa)。50 mmol /l 的 tris-he 1 緩沖液(ph7. 4)配法：50ml 0. 1 mol/l 三務(wù)甲基 氨基甲烷(tris)溶

20、液與42ml 0. 1 mol兒鹽酸混勻后，加水稀釋至100ml o 保存液：0. 3mol/l甘露醇(ph7. 4)。(3) 20 %次氯酸鈉(naclo)溶液。鼠肝勻漿700g x離心lomin沉淀上清液、洗滌10ml預(yù)冷的0. 25mol兒緩沖蔗糖溶'合并液2次，每次loooxg離心15minji清液10000 x g 離心 lomin沉淀清液(線粒體)洗滌加10ml預(yù)冷的0. 25mol/l緩沖蔗糖溶液2次，每次10000 x g離心15min沉淀上清液(純化的線粒體)圖1差速離心順序圖(4) 1%詹納斯綠b染液，用生理鹽水配制。器材溫箱、冰箱、紗布、瓷研缽、冷凍控溫高速離心機

21、ii -2.實驗方法(1) 玉米種子用20%次氯酸鈉溶液浸泡lomin消毒，清水沖洗30min,再浸泡 清水15h。將種子平鋪在放有濕紗布的盤內(nèi)，保持濕度，置溫箱28°c于暗處培肓 2-3d。待芽長到1-2cm長時剪下約15g,放0-4°clhe(2) 加3倍體積分離介質(zhì)，在瓷研缽內(nèi)快速研磨成勻漿。(3) 用多層紗布過濾，濾液經(jīng)700 xg離心lomin。除去核和雜質(zhì)沉淀。 取上清液10 000 xg離心lomin,沉淀為線粒體。再同上離心洗滌一次。(5) 沉淀為線粒體，可存于0. 3mol/l甘露醇中。注意以上勻漿化及離心均 控制在0-4進行。n-3.實驗結(jié)果線粒體的觀察

22、：取線粒體沉淀涂在清潔的載玻片上，不待干立即滴加1%詹 納斯綠b染色20min,放上蓋玻片，用顯微鏡觀察，線粒體是藍綠色圓形顆粒。實驗四水稻懸浮細胞的培養(yǎng)1. 實驗?zāi)康纳钊肓私馑炯毎陔x體條件下的生長特性，掌握植物細胞懸浮系的建立以及 種細胞的篩選方法。2. 實驗原理利用固體瓊脂培養(yǎng)基對植物的離體組織進行培養(yǎng)的方法在植物遺傳實驗中已 經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。但這種方法在某些方面還存在一些缺點，比如在培養(yǎng)過程中， 植物的愈傷組織在生長過程中的營養(yǎng)成分、植物組織產(chǎn)生的代謝物質(zhì)呈現(xiàn)一個梯 度分布，而且瓊脂本身也有一些不明的物質(zhì)成分可能對培養(yǎng)物產(chǎn)生影響，從而導(dǎo) 致植物組織生長發(fā)育過程中代謝的改變而利用液體

23、培養(yǎng)基則可以克服這一缺點， 當(dāng)植物的組織在液體培養(yǎng)基中生長時，我們可以通過薄層震蕩培養(yǎng)或向培養(yǎng)基中 通氣用以改善培養(yǎng)基中氧氣的供應(yīng)。植物細胞的懸浮培養(yǎng)是指將植物細胞或較小 的細胞團懸浮在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中能夠保持良好的分散狀態(tài)。 這些小的細胞聚合體通常來自植物的愈傷組織。一般的操作過程是把未分化的愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。在培 養(yǎng)過程中不斷進行旋轉(zhuǎn)震蕩，一般可用100-120i7min的速度進行。由于液體培養(yǎng) 基的旋轉(zhuǎn)和震蕩，使得愈傷組織上分裂的細胞不斷游離下來。在液體培養(yǎng)基中的 培養(yǎng)物是混雜的，既有游離的單個細胞，也有較大的細胞團塊，還有接種物的死 細胞殘渣。在液體

24、懸浮培養(yǎng)過程中應(yīng)注意及時進行細胞繼代培養(yǎng)，因為當(dāng)培養(yǎng)物生長到 一定時期將進入分裂的靜止期。對于多數(shù)懸浮培養(yǎng)物來說，細胞在培養(yǎng)到第18-25d 時達到最大的密度，此時應(yīng)進行第一次繼代培養(yǎng)。在繼代培養(yǎng)時，應(yīng)將較大的細 胞團塊和接種物殘渣除去。若從植物器官或組織開始建立細胞懸浮培養(yǎng)體系，就 包括愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、單細胞分離和懸浮培養(yǎng)。目前這項技術(shù)已經(jīng)廣 泛應(yīng)用于細胞的形態(tài)、生理、遺傳、凋亡等研究工作，特別是為基因工程在植物 細胞水平上的操作提供了理想的材料和途徑。經(jīng)過轉(zhuǎn)化的植物細胞再經(jīng)過誘導(dǎo)分 化形成植株，即可獲得攜帶有目標基因的個體。懸浮培養(yǎng)是指將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培

25、養(yǎng)增殖的技 術(shù)。(1) 起始培養(yǎng)物的建立選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度激素濃度；必要的附加物質(zhì)。愈傷組織的要求：松散性好、增殖快、再生能力強懸浮系的建立(3) 懸浮細胞的生長與增殖懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)比較有三個優(yōu)點：一是增加培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)液的接觸面， 改善營養(yǎng)供應(yīng)；二是在振蕩條件下可避免細胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累而 對細胞自身產(chǎn)生毒害；三是振蕩培養(yǎng)可以適當(dāng)改善氣體的交換。(4) 影響懸浮細胞生長的因素起始愈傷組織的質(zhì)量接種細胞密度培養(yǎng)條件：方式、溫度繼代周期3. 實驗用品超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、磁力攪拌器、恒溫空氣搖床、 子

26、、錐形瓶、水稻種子4. 實驗方法4. 1配制培養(yǎng)基(1) 用于誘導(dǎo)水稻愈傷組織的培養(yǎng)基(n6),見表3-1。(2) 用于水稻懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，見表3-2。按照培養(yǎng)基配方取各種藥品，最后用蒸餡水定容到所需體積。所配制的培養(yǎng)基 經(jīng)高壓蒸汽滅菌后備用，固體瓊脂培養(yǎng)基分裝在250ml的錐形瓶內(nèi)，每瓶約分裝 30ml。4. 2水稻種子的消毒將種子置于無菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，以體積分數(shù)95 %的酒精消毒l-2mino取出后用無菌水沖洗2-3遍。將種子放入25. og/l的次氯酸鈉溶液中輕輕搖動后，浸泡60min。取出后用無菌水沖洗，將次氯酸鈉溶液充分洗凈。4. 3接種在超凈工作臺內(nèi)，將滅菌后的水稻種子接到誘導(dǎo)

27、愈傷組織的固體培養(yǎng)基上，每 個培養(yǎng)瓶接5-10粒種子。接種完畢后用封口膜將培養(yǎng)瓶封好，放在26°c的恒溫 培養(yǎng)箱中進行黑暗培養(yǎng)。5. 實驗結(jié)果成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系必須滿足三個條件：懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細胞團較小，一般在30-50個細胞以下，在實際培 養(yǎng)中很少有完全由單細胞組成的植物細胞懸浮系。均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆 粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般2-3天甚至更短時間便可增加一倍。思考題1. 一個好的懸浮細胞系有哪些特征？用于建立懸浮細胞系的愈傷組織有何要 求？2. 建立懸浮細胞系的關(guān)

28、鍵技術(shù)有哪些？表3 - 1用于誘導(dǎo)水稻愈傷組織的培養(yǎng)基大員元素(20x)kno356.6g/i2.83g/l(nh)so.9. 26g/l463mg/lkh2po4& og/l400mg/lmgsl), 7h,03. 7g/l185mg/lcacu 2hx()3 3g/ l166n)g/l微雷元*(200x)mnso< h,0660mg/l3.3mg/lznso4 7h,0300mg/ll 5mg/lh,bo)szomg1 l1.6mg/lki160mg zl0.8g/l鐵鹽(loox)fesoi 7h2o2. 8ga28mg/lna2edta3?g/l7rng/lftlldoo

29、x)煙酸sonig/l.0. 5mg/l維生累bilomg/l0. img/l維生素氏50mg/l.0.5mg/lh氈酸200mg/l2. omg/l肌原10g/i.loomg/l30g兒2. 4d4mg/l瓊脂log/lph=5.1mbtma表3-2用于水稻懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基成分母液濃度坦養(yǎng)基中的濃度大量元童(1oox)kh2po417.0elitomslmgs04 7&037.0el370ni£lcacl. 2h>044.0gl440mg l徼債元素(100x)xlnso. e：01.60gl16inz lznso< 7h>0s60ni£l&

30、amp; 6mglhbo*620nizl6.2mglkis3ms l83o«g.lcuso< 5h,02.5mgl25uglnamoo zhoo25mg l250iig,lcocl2 - 6已02.5mgl25昭lkcl2.94usl帙鹽(10ox)feso. 7e102.sel28inglna：edta3.7gl37mgl維生素(103x)煙酸50nigl0.5mgl堆生素bi50ms l0.5mgl堆生索b610ms lo.imzl肌醉ioeliooqiel氮基購(20x)谷氮醜胺17.7gl877mzl天冬毓腰5.322l266ni2l4.56gl2ssniz l甘氮炭1

31、.50 即l75mgl20g'l2. 4-d2.o1115 lph=5.s按照培養(yǎng)基配方取各種藥品，最后用蒸餡水定容到所需體積。所配制的培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅 菌后備用，固體瓊脂培養(yǎng)基分裝在250ml的錐形瓶內(nèi)，每瓶約分裝30ml。實驗五聚乙二醇誘導(dǎo)雞血細胞融合1. 實驗?zāi)康募毎诤鲜侵竷蓚€或兩個以上的細胞合并成為一個細胞的過程。在自然情況 下，體內(nèi)和體外培養(yǎng)的細胞均能發(fā)生自發(fā)融合現(xiàn)象。人工方法誘導(dǎo)細胞融合開始 于50年，現(xiàn)在這項技術(shù)已成為研究細胞遺傳、細胞免疫，腫瘤及細胞工程的重要 手段。通過實驗，了解細胞融合的原理，掌握細胞融合的基本方法。2. 實驗原理在誘導(dǎo)物(如仙臺病毒，聚乙二醇)

32、作用下，相互融合的細胞發(fā)生凝集，隨后 在質(zhì)膜接觸處發(fā)生質(zhì)膜成份的一系列變化，主要是某些化學(xué)鍵的斷裂與重排，最 后打通兩質(zhì)膜，形成雙核或多核細胞(此時稱同核體或異核體)。通過有絲分裂， 細胞核便發(fā)生融合，形成雜種細胞。3. 實驗用品(1) 器具：顯微鏡離心機天平離心管注射器細滴管載片、蓋片。(2) 試劑：%1 50%聚乙二醇(peg):稱取一定量的peg (mwm000)放入刻度試管，在酒精燈 火或沸水中加熱溶化。待冷至50°c時，加入等體積并預(yù)熱至50°c的gkn液混勻。%1 alsver液：葡萄糖2. 05g檸檬酸鈉0. 8g nacl 0. 42g,加重蒸水至looml

33、 gkn 液：nacl 8g, kc1 0. 4g, na2hp04. 2h2o 1. 77g, nah2po4. 2h2o 0. 69g,葡萄 糖2g,酚紅0. olg,溶于1000ml重蒸水中。%1 0. 85%nacl 液材料：一齡公雞靜脈血4. 實驗內(nèi)容及方法(1) 用注射器取2m 1 alsver液，再從翼下靜脈取雞血2ml,注入試管內(nèi)，再 加6ml alsver液，混勻后置4°c冰箱中可備作3-4天用。(2) 實驗時取 t”液lml于離心管中，加入4ml 0. 85%的nacl液，混勻平衡 后以1200r/min離心5分鐘。(3) 去上清液。再重復(fù)“2”兩次，最后一次離心

34、10分鐘。(4) 在沉降血球中加入lmlgkn液，混勻使之成為細胞懸液。(可加gkn液調(diào)節(jié)稀釋使每立方毫米含紅細胞3-4萬個)。_(5) 在“4”液中加入6-8滴(約0. 5ml )50%的peg液，迅速混勻，常溫下23min 滴片鏡檢。觀察時注意不同程度的融合現(xiàn)象。通常分為五個階段。兩細胞膜接觸，粘連; 細胞膜形成穿孔；兩細胞的細胞質(zhì)連通；通道擴大，兩細胞連成一體； 細胞完全合并，形成一個含有兩個或多個核的圓形細胞。(6) 計算融合率：融合率=融合細胞數(shù)/總細胞數(shù)5. 實驗報告1. 簡述動物細胞融合的基本過程。2. 選一理想視野，根據(jù)鏡下結(jié)果繪圖，并以圖列式計算融合率。實驗六動物細胞原代培養(yǎng)

35、1. 目的要求學(xué)習(xí)動物細胞原代培養(yǎng)的一般方法與步驟。學(xué)習(xí)培養(yǎng)細胞的觀察方法。掌握無菌操作技術(shù)。2. 實驗原理細胞培養(yǎng)是把生物體內(nèi)的細胞取出，模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度 和一定營養(yǎng)條件下，使其生存、生長，繁殖，借以觀察研究細胞的各種生命現(xiàn)象。 細胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴謹?shù)膶嶒灱夹g(shù)。要使細胞能在體外長期 生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細胞存活所必需的條件，如適量的水、 無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注 意外環(huán)境酸堿度與滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴格控制無菌條件。細胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)是指直接從有機體獲取細胞 立即進行培養(yǎng)。

36、任何動物細胞的培養(yǎng)均需從原代細胞培養(yǎng)做起。動物很多組織的 細胞，如動物的腎、肺、卵巢、精巢等組織的細胞較易培養(yǎng)，而神經(jīng)細胞等較難 培養(yǎng)。3. 實驗用品材料：孕鼠或新生乳鼠。器材：超凈工作臺，眼科剪，眼科鍛，平養(yǎng)皿，試管，培養(yǎng)方瓶，滴管， 橡皮頭，橡皮塞，恒溫箱，倒置顯微鏡。試劑：1640培養(yǎng)基，青霉素溶液100單位/ml, 0. 25%胰酶溶液，hank7 s 液，75 %酒精。3. 實驗方法在操作之前，各種用品需嚴格消毒，以保證清潔無菌，超凈工作臺需紫外線 照射20-30分鐘。操作者需用肥皂洗凈手，并用75%酒精擦試。整個操作過程應(yīng) 在超凈工作臺內(nèi)酒精燈火焰旁進行，以減少污染的可能性。(1)

37、 取材：取新生乳鼠一只，浸入75 %酒精中浸泡5秒鐘左右，攜入超凈工 作臺內(nèi)，置于消毒培養(yǎng)皿中，用hank's液洗滌2次，再剖開胸腹腔，剪取黃豆大 小的肺、腎、心、肝、皮膚等組織，分別置于無菌平皿中。(2) 清洗：用含雙抗的hank's液洗滌二次，并剔除脂肪、血液等。(3) 剪切：組織塊移入無菌短試管或青霉素瓶中，用眼科剪將組織塊剪成lmn? 大小的碎塊，再用hank's液洗滌2次，自然沉淀，棄去帶血的上清液。(4) 消化：加入0.25%胰蛋白酶液0. 2ml,消化5-10分鐘，吸去消化液，用 hankz s液洗一次；再用培養(yǎng)液洗一次。(5) 接種：用吸管將組織塊吸入方

38、形培養(yǎng)瓶內(nèi)，均勻分散于底壁上，將此面(有 標本的面)朝上，加入2-3ml培養(yǎng)液，塞好瓶塞，做好標記，置37。c溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)：4-5小時后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使有標本的瓶底壁朝下，使培養(yǎng)液浸泡 組織塊，繼續(xù)置37。c溫箱中培養(yǎng)。4. 實驗結(jié)果組織塊培養(yǎng)2-3天后開始，每天小心取出培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下進行觀察, 一般最先“長出”的是形態(tài)不規(guī)則的游走細胞，接著“長”出成纖維細胞或上皮 細胞，后逐漸出現(xiàn)細胞分裂，細胞數(shù)量增多，在組織塊周圍形成較大生長暈，隨 之細胞生長較快，可根據(jù)培養(yǎng)液顏色變化，補加和更換培養(yǎng)液。如細胞生長良好, 約10-15天可長成致密單層，這時可進行傳代培養(yǎng)。5. 思考題(1)簡述

39、細胞原代培養(yǎng)法的主要步驟。在細胞培養(yǎng)中怎樣防止污染?實驗七.人類染色體核仁組織區(qū)銀染技術(shù)1. 目的要求了解銀染顯示核仁形成區(qū)的原理和方法，加深理解核仁形成區(qū)的特性及其與 核仁形成、核糖體產(chǎn)生的關(guān)系。掌握人類染色體核仁形成區(qū)的銀染技術(shù)。2. 實驗原理成熟核糖體大小亞基中的28s、18s rrna和5. 8s rrna是由處在核仁中的rna 基因（rdna ）轉(zhuǎn)錄合成后加工而成。當(dāng)細胞進入分裂期時，28s+18s rrna基因所 在的dna分子參與組裝人類的5對近端著絲粒染色體（13、14、15、21、22號） 的著絲粒區(qū)。當(dāng)細胞分裂進入間期時，位于這些部位的rrna基因參與核仁的形成， 故將染色

40、體上與核仁形成有關(guān)的節(jié)段稱為核仁形成區(qū)（nor）。由于具轉(zhuǎn)錄活性或 已轉(zhuǎn)錄過的rrna基因往往伴有豐富的酸性蛋白質(zhì)，而且這類蛋自質(zhì)含有一 sh基 團和二硫鍵，易將硝酸銀中的ag*還原成ag顆粒，故有活性的核仁形成區(qū)常被硝 酸銀鍍上銀顆粒而呈現(xiàn)黑色。無轉(zhuǎn)錄活性的nor則不被著色。利用硝酸銀（agnos） 可將具轉(zhuǎn)錄活性的核仁形成區(qū)（rrna基因）特異性地染成黑色，人們將這種銀染 陽性的核仁形成區(qū)稱為ag 一 nor,它是具有轉(zhuǎn)錄活性的18s rrna和28s rrna基 因所在的部位。利用銀染核仁形成區(qū)技術(shù)還能準確地判斷人體細胞中是否存在近端著絲粒染 色體隨體的聯(lián)合（ag-aa）,這種聯(lián)合可能是

41、造成近端著絲粒染色體不分離、斷裂 和易位的原因。利用銀染技術(shù)可清楚地看到發(fā)生聯(lián)合的染色體間有銀染物質(zhì)相連, 故可將其作為近端著絲粒染色體隨體聯(lián)合的客觀標準。ag-nor的頻率是細胞中有 轉(zhuǎn)錄活性的rrna基因數(shù)的量值，而ag-aa的頻率則是rrna基因活性大小的量值。3. 材料用品（1）器材：光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴箱、培養(yǎng)皿、蓋玻片 標本：未染色的人類染色體標本（片齡一周以內(nèi)）（3）試劑：50%硝酸銀溶液、明膠顯影液4. 操作過程（1）取一張片齡在一周內(nèi)的染色體玻片標本（新鮮的標本片染色效果更好）， 在片上滴加2滴明膠顯影液，然后加4滴50%硝酸銀溶液，輕搖標本片，使兩液混 勻后，即蓋上蓋玻片。

42、_（2）將標本片放在6870° c恒溫水浴箱的金屬板上，當(dāng)片子上的彎出現(xiàn)大 量氣泡時輕搖片子，使染色均勻。這時，可見混合物很快變黃，待15一2分鐘后 即呈棕色。 取下標本片，用蒸餡水沖去蓋玻片及多余染液，自然晾干。（4）觀察分析：在顯微鏡下可見間期核和中期分裂相的染色體被染成黃色，核 仁被染成黑色，某些染色體上有銀染黑點，即核仁形成區(qū)。%1 ag-nor的計數(shù)：選擇銀染著色良好且d組和g組染色體數(shù)目完整的中期分 裂相，統(tǒng)計d組的6個和g組的4個近端著絲粒染色體的ag-nor數(shù)目。凡是nor 處有銀染點的近端著絲粒染色體，無論是單側(cè)或雙側(cè)，都計數(shù)為一個ag-ror。%1 ag-aa的計

43、數(shù)：凡近端著絲粒染色體之間有銀染物質(zhì)相連或連絲的，均計 為ag-aa。而近端著絲粒染色體之間雖然非常接近，但無銀染物質(zhì)相連或連絲的， 均不計為ag-aa。涉及兩條近端著絲粒染色體的聯(lián)合，計作1個ag-aa;涉及3條 近端著絲粒染色體的聯(lián)合，如未形成閉環(huán)，計為2個ag-aa; 3條近端著絲粒染色 體聯(lián)合且形成閉環(huán)者，計為3個ag-aa,余類推。在分析ag-aa時，應(yīng)區(qū)分是d-d、 d-g,還是g-g聯(lián)合。5. 作業(yè)與思考1. 計數(shù)10個人類染色體中期分裂相中ag-aa和ag-nor的數(shù)目。2. 繪一個油鏡下中期分裂相，注明ag-nor的位置、數(shù)目和形態(tài)。實驗八.植物愈傷組織的誘導(dǎo)和分化1 實驗?zāi)?/p>

44、的了解培養(yǎng)基的配制過程；掌握植物外植體的選擇和表面消毒方法；掌握無菌 條件下愈傷組織的誘導(dǎo)操作方法；了解植物組織脫分化過程中的形態(tài)變化特點。2. 實驗原理根據(jù)植物細胞的全能性，利用植物激素中的生長素和細胞分裂素等兩類重要 激素的不同配比，人為控制細胞的分裂和分化方向，實現(xiàn)對植物細胞和組織的脫 分化、再分化和生根等。本實驗以煙草葉片為外植體，進行愈傷組織的誘導(dǎo)，即 葉片組織的脫分化實驗，以便掌握基本的植物組織培養(yǎng)實驗操作方法。另外，自1973年基因工程誕生以來，煙草易于進行組織培養(yǎng)、容易得到轉(zhuǎn)化 植株而成為典型的基因工程模式植物，加之由于其蛋白含量高，被普遍認為是理 想的生物反應(yīng)器受體植物。通過

45、組織培養(yǎng)煙草將具有重要意義。3. 實驗材料，儀器和試劑(1) 實驗材料自然生長的煙草苗。(2) 實驗器具高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、光照培養(yǎng)箱、酒精燈、鍍子、脫脂棉、打火 機、量筒、移液管、錐形瓶(滅菌)、培養(yǎng)皿(滅菌)、無菌濾紙、封口膜、橡皮 筋、分析天平。(3) 實驗藥品和試劑70%酒精、20% naclo、無菌水，培養(yǎng)基配制用藥品見附件。4. 實驗步驟(1) ms培養(yǎng)基的配置煙草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：ms + 6-ba 2 mg/l + naa 2 mg/l +蔗糖30g/l + 瓊脂8 mg/l。煙草愈傷組織誘導(dǎo)所用的培養(yǎng)基為ms基本培養(yǎng)基。各種ms母液和激素母液均 按附件中的配方配制。煙草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基按下表配制:試劑用量(1000 ml )ms無機大量元素(20x )