1-046大腸桿菌檢查法標準操作程序

1、1 口的：規(guī)范大腸桿菌檢查操作，保證檢驗結(jié)果準確。2范圍：木程序適用于藥品大腸桿菌的檢杳。3責任者：qc員、qc復核人員、qc主任。4程序：4. 1試藥與試液除特別注明外，試驗中所用的試劑均為分析純試劑，水為純化水。4. 1. 1 0. 9%無菌氯化鈉溶液取氯化鈉nacl9. 0g,加水使溶解成1000ml, 121°c滅菌20分鐘。4. 1. 2無菌磷酸鹽緩沖溶液(ph72)取磷酸氫二鈉na2hp04 121120 25. 8g 和磷酸二氫鈉naii2p04 11204. 4g,加水 使溶解至1000ml, 121°c滅菌20分鐘。4. 1.3 a 蔡酚乙醇試液取u 蔡酚

2、6. 0g,加無水乙醇溶解使成100ml o4. 1.4 40 %氫氧化鉀試液取氫氧化鉀40g,加水溶解使成100ml o4. 1.5靛基質(zhì)試液取對二甲氨基苯甲醛c9hlln0lg,加入95%乙醇c2h5oh95ml,充分振搖,使 完全溶解后，取濃鹽酸hcl20ml徐徐滴入，邊加邊振搖，以免驟熱導致溶液色 澤變深，置冰箱保存，備用。4. 1.6甲基紅試液取甲基紅c15h15n302j0. lg,加95%乙醇c2h50h300m 1與水適量，使溶解,再 加水至500ml,即得。4. 1.7 v-p 試液取a-蔡酚c10h70hj6. 0g,加無水乙醇c2ii50ii使溶解成100mlo另取氫氧化

3、鉀40. 0g,加水使溶解成100mlo分別將試藥與各溶劑混合即得。4. 1.8革蘭染色液4.1.8.1沙黃染液取沙黃0. 25g,加95%的乙醇c2h50h10ml,使完全溶解后,加水至100ml«standard operating procedure部門：題目：大腸桿菌檢查法標準操作程序共10頁第2頁編號：s/s0p/qc-046-0起草：部門審核：質(zhì)量部審核：批準：實施日期:4. 1.8.2結(jié)晶紫染液取結(jié)晶紫c25h30cln31.0g,加95%的乙醇c2h50h20ml,使溶解,加1%的草酸 鍍?nèi)芤?0ml,混勻。靜置48小時使用，置密閉棕色瓶中儲存。4. 1.8.3碘試液

4、取碘化鉀ki2.0g,加水35ml使溶解,加入碘片i21.0g,使全部溶解后,加 水稀釋至300ml,置密閉棕色瓶中儲存。4. 1.8.4 95% 乙醇。4.1.9浪麝香草酚藍指示液4.2培養(yǎng)基的種類4.2. 1營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基4.2.2營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4.2.3膽鹽乳糖培養(yǎng)基（bl）4.2.4 4-甲基傘形酮葡糖甘酸培養(yǎng)基（mug）4.2.5乳糖培養(yǎng)基4. 2. 6 5%乳糖培養(yǎng)基4.2.7蛋白豚水培養(yǎng)基4.2.8磷酸鹽葡萄糖豚水培養(yǎng)基4.2.9枸橡酸鹽培養(yǎng)基4. 2. 10曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基（emb）43對照用菌液取大腸桿菌cmcc （b） 44102的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5ml營

5、養(yǎng) 肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，36±1°c培養(yǎng)1824小時后，用0. 9%無菌氯化鈉溶液稀釋至1:106, 使對照菌液加入量含菌50100個（一般用量為0. lml）,其菌數(shù)在做陽性對照的 同時用營養(yǎng)瓊脂注皿或平板涂布，經(jīng)培養(yǎng)后計數(shù)確定。4. 4儀器與設備4. 4. 1菌檢室。4. 4.2凈化工作臺，恒溫培養(yǎng)箱（36±1°c）,微波爐，恒溫水?。?5±1°0 ,高 壓蒸汽滅菌器，電冰箱，勻漿儀，離心機（5004000轉(zhuǎn)/分鐘），顯微鏡（1500standard operating procedure部門：題目：大腸桿菌檢查法標準操作程序共10頁第

6、3頁編號：s/s0p/qc-046-0起草：部門審核：質(zhì)量部審核：批準：實施日期:倍），紫外燈（366nm）o4. 4. 3薄膜過濾裝置：微孔濾膜直徑約50mm,孔徑0. 45±0. 02pm。8.4錐形瓶（250300ml,內(nèi)裝玻璃珠若干），研缽（陶瓷制，直徑1012cm）、 培養(yǎng)皿（9cm）,量筒（100ml）,試管（18x180mm）及塞，吸管（lml分度0.01, 10ml分度0. 1）,注射器（20ml或30ml）,注射針頭,載玻片，蓋玻片、玻璃消 毒缸（帶蓋）。4.4.4玻璃器血用前應洗滌干凈，無殘留抗菌物質(zhì)。吸管口上端距0.5cni處塞入 約2cm的適宜疏松棉花，置吸管

7、桶內(nèi)或牛皮紙袋屮。錐形瓶、量筒、試管均應加 棉塞或硅膠塞，若用振蕩器制備混懸液時，訶需用玻璃紙包裹瓶塞，以免振蕩時 供試液污染瓶塞，再用牛皮紙包扎。玻璃器皿，均于160°c干熱滅菌2小時或高 壓蒸汽121°c滅菌30分鐘,烘干備用。4. 4.5大、小橡皮乳頭（放于干凈帶蓋的容器屮，并應定期用7075%乙醇溶液 浸泡）。4. 4.6無菌衣、帽、口罩、手套。洗凈后配套，用牛皮紙包嚴，滅菌，備用。 4.4.7接種環(huán)（口鐵金或銀銘合金，環(huán)徑45mm、氏度610cm）,乙醇燈，乙醇 棉球或碘伏棉球，滅菌剪刀或滅菌手術(shù)刀和滅菌躡子，滅菌鋼錐，滅菌稱樣紙， 不銹鋼藥匙，試管架，火柴，記號

8、筆，口瓷盤，洗手盆，陶瓦蓋（12cm）等。所冇進入無菌室的物品必須經(jīng)過消毒或滅菌，應嚴格按照菌檢室物品進出 標準操作程序（sop qc-003-00）進行操作。4.5準備4. 5. 1供試品的檢驗量4. 5. 1. 1所冇劑型的檢驗量均需取2個以上包裝單位。4. 5. 1. 2固體制劑檢驗量為10go4. 5. 1. 3液體制劑檢驗量為10ml o4. 5.1.4特殊貴重或微量包裝的藥品，檢驗量可酌減。除另有規(guī)定外，口服固 體制劑不低于3g,液體制劑采用原液者不得少于6ml,采用供試液者不得少于 3ml,夕卜用藥品不得少于5g。4. 5.2供試液的制備standard operating pr

9、ocedure部門：題目：大腸桿菌檢查法標準操作程序共10頁第4頁編號：s/s0p/qc-046-0起草：部門審核：質(zhì)量部審核：批準：實施日期:4. 5. 2. 1液體供試品。取供試品10ml,置滅菌錐形瓶中，加入90ml稀釋劑， 搖勻，作為1:10供試液。4. 5. 2. 2固體供試品。稱取供試品10g,置于勻漿杯或適當滅菌容器中，加入 0.9%無菌氯化鈉溶液100ml,用勻漿儀，振蕩器或乳缽研磨等方法分散混勻。4. 5. 2. 3含抑菌成分供試品。供試品按常規(guī)檢查法，加入規(guī)定量的對照菌。不 能檢岀時，該供試液須按以下方法之一或兩種以上方法聯(lián)合處理后，依法檢查。 同時做陽性和陰性對照。4.

10、5. 2. 3. 1稀釋法。取規(guī)定量的供試液種入較大體積的培養(yǎng)基中，使該供試液 稀釋至不具抑菌作用的濃度。4. 5. 2. 3. 2離心沉淀集菌法。取規(guī)定量的供試液于無菌刻度離心管屮,3000轉(zhuǎn) /分鐘離心30分鐘，移去上清液，留底部集菌液約2沁，并稀釋該供試液至原規(guī) 定量。如冇不溶性藥渣，可先以500傳/分鐘離心5分鐘，取全部上層液，再按 上述方法集菌處理。4. 5. 2. 3. 3薄膜過濾法。取規(guī)定量的供試液于稀釋劑100ml屮，搖勻，以無菌 操作加入裝有直徑約50mm.孔徑不大于0. 45±0. 02 u m微孔濾膜的薄膜過濾器 內(nèi)，過濾，用稀釋劑沖洗濾膜，每次不少于100ml

11、,將培養(yǎng)基加入濾器或取岀濾 膜，加入增菌培養(yǎng)基中。4. 5. 2. 3. 4沉降法。取規(guī)定量供試液，自然沉降5分鐘，取上層液于100ml增 菌液中，本法適用于難溶于水的抗菌制劑。檢驗程序standard operating procedure報告報告4.7液,增菌培養(yǎng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基(bl) 3瓶，每瓶各100mlo其中1瓶加入對照菌50100個作陽性對照，笫3瓶加入與供試液等量的稀瓶分別加入規(guī)定量的供試部門：題目：大腸桿菌檢查法標準操作程序共10頁第5頁編號：s/s0p/qc-046-0起草：部門審核：質(zhì)量部審核：批準：實施日期:4.6釋劑作陰性對照。37°c培養(yǎng)1824小時(必要

12、時可延至48小時)。陰性對照應無 菌生長。搖勻上述bl增菌培養(yǎng)液，以滅菌吸管取供試品膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)液、供試standard operating procedure部門：題目：大腸桿菌檢查法標準操作程序共10頁第6頁編號：s/s0p/qc-046-0起草：部門審核：質(zhì)量部審核：批準：實施日期:品陽性對照培養(yǎng)液、陰性對照培養(yǎng)液各0.2ml,分別加入4-甲基傘形酮葡糖甘酸 培養(yǎng)基（mug）管，37°c培養(yǎng)4、24小時后，將各管置366nm紫外燈下觀察有無 藍口色熒光，然后靛基質(zhì)試液45滴于上述mug管內(nèi)，觀察液面顏色。mug陽性 （有熒光）、靛基質(zhì)陽性（玫瑰紅色），報告檢出大腸桿菌；mu

13、g陰性（無熒光）、 靛基質(zhì)陰性（無色），報告未檢出大腸桿菌。4. 8分離培養(yǎng)如mug陽性、靛基質(zhì)陰性或mug陰性、靛基質(zhì)陽性時，將上述供試品blo 增菌培養(yǎng)液輕輕搖動，以接種環(huán)沾取12環(huán)培養(yǎng)液劃線于emb平板上，培養(yǎng) 1824小時，觀察eib平板有無可疑大腸桿菌菌落生長。當陽性對照的平板呈典 型菌落生長時，供試品分離平板無菌落生長，或有菌落但不同于表1所列特征， 可判為供試品lg或51未檢出大腸桿菌。表1大腸桿菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落彤態(tài)曙紅亞屮藍瓊脂（emb）典型菌落呈紫黑色，1員1形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤, 有金屬光澤。非典型菌落呈淺紫色、粉紅色，或菌落中心紫色或 無明顯暗色中

14、心，無金屬光澤。麥康凱瓊脂典型菌落呈鮮桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。 非典型菌落呈微紅色，或菌落屮心呈紅色。當陽性菌對照平板未生長或生長菌落經(jīng)檢查不是大腸桿菌，應研究原因，重 新試驗或重新制備供試液，以消除供試品抑菌成分的影響。冇疑似菌落生長者, 挑取可疑菌落做革蘭染色、鏡檢、imvic試驗。4. 9純培養(yǎng)如生長菌落與表1所列特征相符或疑似者，以接種針輕輕接觸單個疑似菌落 的表而屮心，沾取培養(yǎng)物，應挑選23個以上疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜而, 培養(yǎng)1824小時,作以下檢查。如平板上無單個可疑菌落，但有可疑菌團（紫黑色，或冇金屈光澤），應沾 取可疑菌團培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培

15、養(yǎng)液劃線接種于emb瓊脂平板，培養(yǎng)standard operating procedure部門：題目：大腸桿菌檢查法標準操作程序共10頁第7頁編號：s/s0p/qc-046-0起草：部門審核：質(zhì)量部審核：批準：實施日期:1824小時，再挑選單個疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下檢查。4.10革蘭染色、鏡檢4. 10. 1以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營養(yǎng)瓊脂斜面 新鮮培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，口然或微溫干燥，再通過火焰23次（載玻片 不燙手）固定。4. 10. 2滴加結(jié)晶紫染液，染色1分鐘，水洗。4. 10. 3滴加碘液，媒染1分鐘，水洗，以濾紙吸干余水。4. 10. 4滴加95%乙

16、醇，脫色2030秒鐘,水洗。4. 10. 5滴加沙黃染液，復染1分鐘,待干后，鏡檢。4. 10. 6染色結(jié)果革蘭陽性菌呈藍紫色；革蘭陰性菌呈紅色。大腸桿菌為革蘭陰性短桿菌，或 球桿菌狀，亦冇桿菌狀。4. 10. 7注意事項4. 10. 7. 1玻片必須潔凈，涂片菌量宜少，菌不可濃。否則，菌細胞成堆或連成 片。染色反應難于判斷，菌細胞形態(tài)難于觀察。4. 10. 7. 2培養(yǎng)物的菌齡以1624小時為宜。培養(yǎng)時間過長的革蘭陽性菌易染成 紅色。4.10. 7. 3脫色是關(guān)鍵，脫色時間不足菌細胞易染成陽性，脫色時間過長易染成 陰性。4. 11生化試驗4.11.1乳糖發(fā)酵試驗 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于乳糖

17、發(fā)酵管，培養(yǎng)2448 小時，觀察產(chǎn)酸（指示劑為酸性品紅者為紅色;指示劑為混麝香草酚藍者為黃色）, 產(chǎn)氣（小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無論大?。?。為避免遲緩發(fā)酵乳糖產(chǎn)生假陰性，亦可接種5%乳糖發(fā)酵管。絕大多數(shù)遲緩 發(fā)酵乳糖的細菌，可于24小時出現(xiàn)陽性?；蜻m當延氏培養(yǎng)時間。4. 11.2靛基質(zhì)試驗（1）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋口淼水培養(yǎng)基，培養(yǎng)2448小時，沿管壁加入 靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動試管，液而呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。standard operating procedure部門：題目：大腸桿菌檢查法標準操作程序共10頁第8頁編號：s/s0p/qc-046-0起草：部門審核：質(zhì)量部審核

18、：批準：實施日期:98%的大腸桿菌靛基質(zhì)試驗為陽性。一般24小時即可出現(xiàn)陽性結(jié)果，以無菌操作 先從管屮取岀1或2ml培養(yǎng)液進行檢查，如靛基質(zhì)是陰性，余下的蛋白陳水培養(yǎng) 物再培養(yǎng)24小時，作靛基質(zhì)試驗。4. 11.3甲基紅試驗（m）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖腺水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2小時， 于培養(yǎng)液屮加入甲基紅指示液23滴（約每ml培養(yǎng)液加指示液1滴），輕微搖動, 立即觀察，呈鮮紅色或桔紅色為陽性，呈黃色為陰性。4. 11. 4乙酰卬基卬醇生成試驗（v-p）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖腺水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2小時， 于2ml培養(yǎng)液屮加入a-荼酚乙醇試液ln

19、il,混勻，再加40%氫氧化鉀試液0. 4ml, 充分振搖，在4小時（通常在30分鐘）內(nèi)出現(xiàn)紅色應判為陽性，無紅色反應為 陰性。4. 11.5枸椽酸鹽利用試驗（c）取上述斜而培養(yǎng)物，接種于枸椽酸鹽培養(yǎng)基斜而上，培養(yǎng)24天，培養(yǎng)基斜 面有菌苔生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{色時為陽性，培養(yǎng)基顏色無改變、無菌苔生 長為陰性。4. 12結(jié)果判斷4. 12. 1當陰性對照試驗呈陰性，陽性對照試驗mug呈陽性，供試品mug陽性、 靛基質(zhì)陽性，報告lg或lml供試品檢出大腸桿菌o mug陰性、靛基質(zhì)陰性,報 告lg或lml供試品未檢岀大腸桿菌。4.12.2 mug陽性、靛基質(zhì)陰性、imvic試驗為- + - -、

20、革蘭陰性桿菌，報 告lg或lml供試品檢岀大腸桿菌；mug陰性、靛基質(zhì)陽性、imvic試驗為+ - -、革蘭陰性桿菌，報告lg或lml供試品檢出大腸桿菌。4. 12. 3供試品培養(yǎng)物檢查不符合9. 6. 2二項屮的任一項，報告lg或lml供試 品未檢出大腸桿菌。4. 12. 4當陰性對照有菌生長或陽性對照未生長或生長菌落不是大腸桿菌，不能 作出檢驗報告。4. 13注意事項standard operating procedure 0腸 題大o i1i共第頁頁d_ 號so 縊s/ 草 起i 準 批n4. 13. 1 mug法不必從混合菌中分離單個菌落。除大腸埃希菌外，|、的有部分志賀 菌屬、沙門菌

21、屬的菌株；以及少數(shù)革蘭陽性球菌、桿菌和芽陀菌，其mug為陽性。 因此，在mug培養(yǎng)基成分中增加丁去氧膽酸鈉，可排除革蘭陽性菌的干擾。至于 志賀菌、沙門菌在膽鹽乳糖培養(yǎng)基屮較難生長，即使有生長，本法能檢出。既然 藥品中不得檢出大腸桿菌，更不允許檢出志賀菌、沙門菌。4. 13. 2配制mug培養(yǎng)基時，務必校正ph值，滅菌后ph不得過7. 4,否則ph 值偏高，mug分解，本身則顯熒光；分裝mug培養(yǎng)基的試管應挑選，試管、蛋口 豚不得顯熒光。4. 13. 3培養(yǎng)時間供試品培養(yǎng)液接種于mug培養(yǎng)基屮的培養(yǎng)時間，一般在4小時、24小時觀 察是否產(chǎn)生熒光，如熒光很微弱，不能準確判斷時，可延長培養(yǎng)至48小時再觀 察結(jié)果。由丁大腸埃希菌各菌株間的gud的活性不完全相同，對底物和底物的濃 度反應的差異；培養(yǎng)基中選擇因子的影響；培養(yǎng)時間、溫度；ph的改變；大量 競爭菌和樣品本身物質(zhì)成分的干擾等，對結(jié)果的判斷亦有影響。4. 13.4結(jié)果觀察取供試品的mug試驗