顯微鏡的原理

1、顯微鏡的原理、構造、調(diào)試和使用       顯微鏡是人類認識物質(zhì)微觀世界的重要工具，是現(xiàn)代科學研究工作不可缺少的儀器之一。顯微鏡自1666年問世以來已有300多年的歷史了，其間隨著科學技術不斷發(fā)展，顯微鏡的品種不斷增加，結構和性能逐步得到完善和提高。 根據(jù)不同的使用用途，光學顯微鏡可分為普通光學顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡、倒置顯微鏡、體視顯微鏡、偏光顯微鏡等10多種。目前，世界上許多國家都可以生產(chǎn)光學顯微鏡，牌名、種類繁雜，其中德國、日本等國制造的顯微鏡品質(zhì)、數(shù)量占優(yōu)勢，但價格昂貴。 對于現(xiàn)代的光學顯微鏡，包括各種簡單的常規(guī)檢

2、驗用顯微鏡、萬能研究以及萬能照相顯微鏡等，首先要認識其構造及各部件的功能，同時要掌握正確的調(diào)試、使用和保養(yǎng)方法，才能在實際應用中面對各種要求時以不同的顯微鏡檢方法，充分發(fā)揮顯微鏡應有的功能，提高常規(guī)檢驗工作效率.光學顯微鏡的原理和構造    隨著科學技術的發(fā)展，顯微鏡檢方法由最傳統(tǒng)的明視野、暗視野發(fā)展出了相差法、偏光方法；熒光方法也由透射光激發(fā)進展為落射光激發(fā)，使熒光效率大為提高；微分干涉相襯方法基于偏光方法，而巧妙地利用了微分干涉棱鏡，使之能應用于醫(yī)學與生物學的樣品，又能應用于金相樣品的分析與檢驗。 下面以德國ZEISS公司生產(chǎn)的Axioplan萬能研究用顯微鏡，簡單介紹

3、萬能顯微鏡的基本組成部件。 1. 顯微鏡主機體（stand）顯微鏡的主機體設計成金字塔形，而底座的截面呈T字形，使顯微鏡的整體相當穩(wěn)固。顯微鏡的光學部件和機構調(diào)節(jié)部件、光源的燈室、顯微照相裝置、電源變壓穩(wěn)壓器等，都可安裝在主機體上或主機體內(nèi)。 2. 顯微鏡的底座（base）底座和主機體通常組成一個穩(wěn)固的整體。底座內(nèi)通常裝有透射光照明光路系統(tǒng)（聚光、集光和反光）部件，光源的濾光片組，粗/微調(diào)焦機構，光源的視場光闌也安裝在底座上。 3. 透射光光源（tranilluminator）透射光光源由燈室（lamp housing）、燈座（lamp socket）、鹵素燈（halogen lamp）、集光

4、與聚光系統(tǒng)（lamp collector and lamp condenser）及其調(diào)整裝置組成。 4. 透射光光源與反射光光源的轉(zhuǎn)換開關（toggle switch）這是新一代AXIO系列顯微鏡特有的裝置，透射光和反射光可通用。當具有透/反兩用的配置時，利用這一轉(zhuǎn)換開關能方便而又迅速的使透射光和反射光互相轉(zhuǎn)換。在純透射光的配置中，這一開關就改為電源開關。 5. 電源開關（mains switch）與亮度調(diào)節(jié)旋鈕（brightness control）電源開關用來接通或切斷顯微鏡所需用的交流電源。電源開關旋鈕也可調(diào)節(jié)照明光源的亮度，使所觀察的視域可隨時獲得適當?shù)牧炼?，可調(diào)范圍為3-12V。作顯

5、微照相時，可根據(jù)曝光以及彩色底片色溫的要求來調(diào)節(jié)燈光的亮度。當準備關掉電源之前，應先將亮度調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)到最小。 6. 粗、微調(diào)焦旋鈕（coaxial coarse/fine focusing controls）調(diào)焦旋鈕轉(zhuǎn)動時帶動燕尾導板上下移動，而導板上則裝有物臺托架和聚光鏡托架，從而使物臺趨向或遠離物鏡達到調(diào)焦的效果。 7. 透射光用的濾光片選擇按鈕（push buttons for filter magazine）透射光顯微鏡檢方法所需用的一組濾光片已安裝在顯微鏡的底座內(nèi)，通過底座外的按鈕就可以根據(jù)不同的需要來選擇適用的一塊或一組濾光片。通常的濾光片配套有： (1) 藍色色溫轉(zhuǎn)換濾光片：用來

6、把光源的色溫由3200K轉(zhuǎn)換成日光型彩色底片所需 的5500K色溫； (2) 綠色濾光片：用來增強相差觀察方法中成像的反差，或者以黑白底片作顯微照相時，可以提高片成像的反差； (3) 淺灰色濾光片：是透光率為50%的中性減光濾光片，可把視野的亮度減弱一半； (4) 灰色濾光片：是透光率為25%的中性減光濾光片，可把視野的高度減弱75%； (5) 透光率僅為6%的中性減光濾光片，可把視野的亮度變得相當暗，95%以上的光都已被吸收掉。 8. 光源的視場光闌（luminuos field diaphragm）視場光闌是顯微鏡照明光路系統(tǒng)中的重要部件之一，它只能按照庫勒照明系統(tǒng)的要求來進行調(diào)節(jié)，視場光

7、闌不可以任意開大，但要根據(jù)使用的物鏡倍數(shù)來調(diào)節(jié)適當?shù)拇笮　Ｒ晥龉怅@的主要功用有： (1) 控制雜散光在成像光路系統(tǒng)中的影響，特別是免除雜散光對照相系統(tǒng)的干擾，使顯微照相的底片不至于蒙上一層灰霧； (2) 控制照明光束的大小，使所觀察的視域能受到均勻的照明； (3) 在熒光顯微鏡檢方法中，可以把激發(fā)光限制在所需激發(fā)樣品的視域范圍內(nèi)，以防止視域外的樣品過早受到激發(fā)。 9. 聚光鏡系統(tǒng)（condenser system）聚光鏡系統(tǒng)是照明光路系統(tǒng)中的重要部件之一，它也只能按照庫勒照明系統(tǒng)的調(diào)整要求來進行調(diào)節(jié)。聚光鏡系統(tǒng)調(diào)整的好壞，可以直接影響顯微鏡視域中照明的均勻性，也可影響顯微鏡的分辨力，還可以直接

8、控制顯微照相底片上的反差。聚光鏡系統(tǒng)通常由以下幾個部件組成： (1) 聚光鏡本體（condenser）可以是簡單的阿貝聚光鏡，也可以是消球差-消色差的優(yōu)質(zhì)聚光鏡，另外還有一種是消除了內(nèi)應力的偏光聚光鏡。聚光鏡的重要參數(shù)之一是數(shù)值孔徑（NA），通常為0.32；這樣的數(shù)值孔徑太小，只能與以下的物鏡配合使用，因此需配用前端透鏡來提高數(shù)值孔徑，以便與不同倍數(shù)的物鏡靈活配合使用； (2) 前端透鏡（front lens）前端透鏡本身的數(shù)值孔徑通常為0.63、0.90、1.30或1.40，它要附裝在聚光鏡本體上，可以方便地擺進或擺出光路。最常用的前端透鏡數(shù)值孔徑為0.90，當它擺入光路時，可以和10

9、15;及以上的物鏡配用，擺出光路時可以和10×以下的物鏡如6.3×、5×及2.5×等物鏡配用； (3) 聚光鏡的孔徑光闌（aperture diaphragm）孔徑光闌實際上是一個可變光圈，它是顯微鏡照明光路系統(tǒng)中的又一個重要部件，在透射光明視野法、微分干涉相襯法以及偏光法所使用的聚光鏡中，都裝有孔徑光闌。它可以影響顯微鏡在作觀察時的分辨力；直接控制顯微照相底片上的反差；可用來調(diào)節(jié)聚光鏡的數(shù)值孔徑，配合所用物鏡的數(shù)值孔徑，以取得最佳的分辨本領，或最大的分辨本領；還可以使光源的發(fā)光體成像于孔徑光闌所在的平面上，從而滿足庫勒照明系統(tǒng)的前提條件。 在實際操作中

10、，調(diào)節(jié)聚光鏡孔徑光闌可以改變顯微鏡中所觀察到的視野亮度，這是由于歷史上對聚光鏡孔徑光闌的誤解所造成的錯誤用法。這里要特別強調(diào)：不應該用聚光鏡的孔徑光闌來調(diào)節(jié)視野中的亮度、更不應該用調(diào)節(jié)聚光鏡位置高低的方法來調(diào)節(jié)視野中的亮度！以往的錯誤用法希望能在實際操作中糾正過來。 (4) 轉(zhuǎn)盤（turret）在多用途聚光鏡系統(tǒng)中，為方便才把明視野的孔徑光闌、暗視野的中央光擋、相差法所需用的各種不同直徑的環(huán)狀光圈、微分干涉相襯法用的DIC棱鏡及其孔經(jīng)光闌等部件裝在轉(zhuǎn)盤上再嵌入到聚光鏡本體的座子內(nèi)，使用時轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)盤就可以選用不同顯微鏡檢法所適用的聚光鏡，方便而又快捷。 聚光鏡系統(tǒng)有兩個調(diào)節(jié)裝置：a. 聚光鏡的調(diào)中

11、螺絲（centering screws）調(diào)中螺絲通常為1對，位于聚光鏡托架前方的左右測。和環(huán)形燕尾槽中的調(diào)中螺絲成三足鼎立之勢，可以聚光鏡前后、左右調(diào)整，使聚光鏡的光軸與照明光路、成像光路合軸；b. 聚光鏡托架的上下調(diào)節(jié)裝置（vertical adjustment of condenser carrier）： 利用這個調(diào)節(jié)裝置，可使聚光鏡的位置作上下調(diào)動，使視場光闌經(jīng)過聚光鏡在樣品視野中的成像調(diào)到最為清晰，光闌像的位置也可利用托架上的調(diào)中螺絲來進行調(diào)中，從而滿足庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整的要求。 10. 機械移動式載物臺（specimen stage）載物臺可以承載樣品，裝有可在水平方向上作前后、左右移

12、動的調(diào)節(jié)裝置，有的還可以在水平方向上作大約100度的旋轉(zhuǎn)，以便使樣品能更好地與顯微照相的取景框相適配。 11. 物鏡轉(zhuǎn)換器（nosepiece）物鏡轉(zhuǎn)換器安裝在滑插式燕尾槽座上，已作了準確的對中?？裳杆俑鼡Q物鏡。常用的有6個、5個及4個孔位的物鏡轉(zhuǎn)換器。 12. 物鏡（objectives）物鏡是顯微鏡的核心光學部件，顯微鏡的放大倍數(shù)、分辨本領、色差與像差的校正狀況、工作距離等，都有直接由物鏡來決定。衡量物鏡質(zhì)量的基本參數(shù)主要有：a. 色差消正的程度（或級別）；b. 像場平坦的程度；c. 所使用的玻璃材料。數(shù)值孔徑（NA）是物鏡最重要的參數(shù)，數(shù)值孔徑越大，分辨率越高。目前物鏡的數(shù)值孔徑最大只有

13、1.30。按照物鏡色差和像差校正的程度，物鏡可以分為以下類別： (1) 消色差物鏡（achomats）通常對紅光與藍光兩種色光作了色差校正，但視域中像場的平坦程度并未作過完善的校正，因此只能作一般的觀察應用。在偏光顯微鏡中，由于需要消除物鏡內(nèi)各個鏡片的內(nèi)應力，反而需要利用這種鏡片數(shù)目不多的物鏡來做偏光物鏡。 (2) 有限平像場消色差物鏡（flat-field achromats）這也是對兩種色光作了校正的消色差物鏡，但視域范圍內(nèi)像場的平坦程度只作了有限范圍內(nèi)的校正，通常在顯微照相取景框范圍內(nèi)像場是平坦的，以確保顯微照相對焦的清晰，取景框范圍以外，往往不一定能保證同樣的清晰度。適用于常規(guī)檢驗而又

14、需要作顯微照相的工作中。 (3) 完善平像場消色差物鏡（plan-achromats）這也是對兩種色光作了校正的高級消色差物鏡，主要特點是像場在整個視域中作了完善的校正，適合于作要求較高的顯微鏡檢工作，特別是作顯微照相效果更好。由于這種物鏡仍采用常用的光學玻璃，不適宜作熒光等這一類弱光的觀察和照相。 (4) 螢石玻璃消色差物鏡（neofluar）這也是對兩種色光作了色差校正的消色差物鏡，其中全部或部分鏡片則采用了可透過近紫外光（波長約為365nm）的螢石玻璃（即氟化鈣晶體）來制造。因此特別適合于作熒光與相差方法的觀察與顯微照相，也可用在偏光顯微鏡中。 (5) 完善平像場復消色差物鏡（plan-

15、opo-chromats）這是最高一級的消色差物鏡，對紅、綠、藍3種顏色都作了很好的色差校正，而視域中的像也作了完善的校正，數(shù)值孔徑比螢石物鏡大，可應用于要求極高的顯微觀察與顯微照相中，但價格十分昂貴，由于所使用的鏡片數(shù)目多達12片，光能損失較大，不宜用作熒光觀察與照相。 (6) 已消除內(nèi)應力又可以調(diào)節(jié)中心的物鏡（pol Z objectives）這是一種適用于作偏光觀察的物鏡，是從以上所介紹的幾種物鏡中挑選出來的，在裝配時特別注意消除了其中的內(nèi)應力，以免內(nèi)應力所引起的干涉條紋干擾了偏光樣品中真正的干涉條紋。 (7) 完善平像場螢石消色差多種介質(zhì)浸沒式物鏡（ plan-neofluar imm

16、.）這是一種新型物鏡，采用螢石玻璃制造其中全部或部分鏡片，成像質(zhì)量特別明亮，反差十分好，色差接近于復消色差，因此又屬于半復消色差物鏡。數(shù)值孔徑特別大，透光能力強，而且分辨率十分好。最大的特點是可用好幾種浸沒介質(zhì)，如常用的浸沒油、甘油、蒸餾水等，既可使用權蓋玻片也可以不使用。這種物鏡制成干式物鏡時，可加上校正環(huán)，用來校正蓋玻片的厚度不均勻性，以消除蓋玻片厚度不規(guī)則造成的成像失真，對于厚度在0.12-0.22mm之間的蓋玻片都可以作相應的校正。 1986年以來，德國蔡司公司推出的新一代光學顯微鏡，其中的物鏡突破了傳統(tǒng)光學顯微鏡的概念，采用了無限遠色差校正的光學系統(tǒng)（infinity color-c

17、orrected system，簡稱ICS物鏡），其特點是：由物鏡射出的成像光束是一束平行光，可在成像光路中按需要插入任意多的光學部件而不影響成像質(zhì)量。在顯微鏡鏡體內(nèi)有一特制的鏡筒透鏡（tube lens）與物鏡相配，兩者結合起來把物鏡的色差與像差都作了十分完善的校正，而且物鏡的視域相當寬闊，比傳統(tǒng)物鏡的視域擴大約40% 。 13. 熒光濾光片組插板的插口（slot for the fluorescence slider）這是為作熒光觀察時插入熒光濾光片組插板預留的插口。 14. 勃氏鏡插板的插口（slot for Bertcand-lens slider）這是為作偏光觀察時插入勃氏鏡插板預留

18、的插口，勃氏鏡是偏光顯微鏡中用作錐光干涉圖試驗的重要部件。 15. 補色器插板的插口（slot for auxiliary objects）這是當作微分干涉相襯觀察和偏光需加入的各種補色器預留的插口。 16. 雙目鏡筒或帶照像鏡筒的雙目鏡筒（binocular tubes or binocular phototubes）用來安放目鏡及照像裝置。為便于觀察，鏡筒制成具有一定傾斜角度（30°或45°），設有瞳距調(diào)節(jié)裝置，可在55°至75°范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，以適合不同使用者兩眼瞳孔距離。雙目鏡筒內(nèi)裝有一些折光和分光棱鏡，能把從物鏡出來的一束成像光束等分成兩部分，分別

19、由兩個目鏡作觀察。帶照像鏡筒的雙目筒一般在右測裝有光束分配棱鏡的拉桿，把它全部推入時只作觀察，拉出來則一邊觀察一邊照像，或全部作顯微照像。 17. 目鏡（eyepieces）目鏡是顯微鏡中把物鏡所成的像作再一次放大的光學部件，顯微鏡的總放大倍數(shù)通常就是物鏡與目鏡放大倍數(shù)的乘積。為方便不同視力者進行顯微拍照時調(diào)焦同樣清晰，一些目鏡設計成可調(diào)焦式。為了使顯微鏡獲得最大有效放大倍數(shù)和最高分辨本領，必須合理選配目鏡。到目前為止，由于受光學定律的制約，光學顯微鏡最大的有效放大倍數(shù)為1250-1300倍。10×目鏡是最常用而必須配備的目鏡，觀察熒光時最好選用10×以下的目鏡。 顯微鏡的

20、正確調(diào)試和使用    在了解了顯微鏡各主要部件的名稱、構造和功能之后，為了更好地發(fā)揮顯微鏡的各種功能，提高工作效率，保證在顯微觀察及顯微照像過程中取得最佳效果，使用人員必須了解和掌握顯微鏡正確的調(diào)試方法和使用方法。尤其在新一代顯微鏡中，具備了多種功能，能進行多種顯微鏡檢方法觀察，正確的試調(diào)方法和使用方法就顯得尤為重要。下面以Axioplan萬能研究顯微鏡為例，簡述調(diào)試及使用方法。 1. 顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整為了使顯微鏡的視野能受到均勻而又充分的照明，在顯微鏡初次安裝和調(diào)試時，就必須把照明光路系統(tǒng)調(diào)整好，這是正確使用顯微鏡，并獲得正確、可靠結果的重要手段和最基本的要求。此

21、外，正確掌握照明光路系統(tǒng)的調(diào)整，是使用顯微鏡過程中更換光源燈泡后所必經(jīng)的步驟，也是在日常使用過程中不時地檢驗顯微鏡性能的必要手段。顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整主要有以下4項內(nèi)容： (1) 照明光源燈室在顯微外的初步調(diào)整 首先將燈室的外殼打開，壓彈簧夾子將鹵素燈泡裝入插座中，安裝時避免手指直接接觸燈泡（可用柔軟的布或紙隔?。?，以免燈泡上留有指紋等臟物，影響燈泡的使用壽命。 把燈室擺在桌面上，接通電源后，用專用的螺絲刀調(diào)節(jié)燈的調(diào)焦旋鈕孔（標有“”），使燈絲投影在1-2m外的墻上，將燈絲成像調(diào)至清晰；然后調(diào)節(jié)燈的高低位置調(diào)節(jié)絲孔（標有“”），使燈絲位置高低適當；再調(diào)節(jié)燈的左右位置調(diào)節(jié)螺絲孔（標有“”），

22、使燈絲左右位置合適。 (2) 光源發(fā)光體（燈絲）在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗和校正目的是為了把發(fā)光體的像端端正正地調(diào)入物鏡的視域范圍內(nèi)，從光源的角度去確保顯微鏡的視域受到充分而均勻的照明，這是調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的前提條件。 需要的基本工具：對中望遠鏡購置顯微鏡時已配備。 拔掉燈庫內(nèi)的毛玻璃套筒，把燈室裝回顯微鏡上； 選用10×物鏡，開亮光源程序找樣品并調(diào)焦清晰，再換用40×物鏡把樣品調(diào)焦清 晰（40×物鏡可以看清燈絲的全貌）； 把聚光鏡的孔徑光闌和視場光闌均開到最大； 拔掉其中一個目鏡，換上對中望遠鏡，抓住白色部分，另一手伸縮黑色接目鏡，就可在視野中看到燈絲像； 如燈絲位置

23、不合適，調(diào)“”孔，把燈絲像沿水平方向調(diào)好，調(diào)“”孔，把絲像沿垂直方向調(diào)好，直至將燈絲像調(diào)至剛好充滿物鏡孔徑的光圓像； 調(diào)整完畢后，將毛玻璃套筒插回原位，拔掉對中望遠鏡，換回目鏡作下一步調(diào)整。 以上所述照明光源燈室在顯微鏡外的調(diào)整和光源發(fā)光體在顯微鏡內(nèi)位置的校驗，只需在顯微鏡初次安裝調(diào)試及更換燈泡時進行，平時使用顯微鏡時不能隨意亂調(diào)亂動。萬一調(diào)亂時，可按上述步驟調(diào)回原狀。 (3) 庫勒照明（Kohler）系統(tǒng)的正確調(diào)整顯微鏡的正確調(diào)試，主要工作之一是照明光路系統(tǒng)的調(diào)整，而其中的關鍵是庫勒照明系統(tǒng)的調(diào)整。對于每一位使用顯微鏡的人員，特別是作顯微照像的人員來說，應該對庫勒照明系統(tǒng)的原理及其調(diào)整步驟有

24、一定的了解和掌握，才能充分發(fā)揮顯微鏡應有的功能，拍出來的照片才能在效果上比較一致而又完善。 庫勒照明系統(tǒng)的原理簡單來說就是：光源發(fā)光體上任意一點發(fā)出的光，可以照明顯微鏡的視域范圍，而光源發(fā)光體上每一點所發(fā)出的光匯集起來，在顯微鏡的視域中就實現(xiàn)了非常充分而又均勻的照明。 調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的目的，是為了使所觀察的視域能獲得均勻而又充分的照明，防止雜散光對照像系統(tǒng)造成影響或干擾，以免照像時在底片形成灰霧。高調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的必要部件：視場光闌、可進行合軸調(diào)整的聚光鏡系統(tǒng)。 選用10×物鏡和10×目鏡； 把聚光鏡前端透鏡擺進光路中，孔徑光闌調(diào)至適中的位置上（不大不?。?，再把聚光鏡升

25、到最頂?shù)奈恢蒙?，聚光鏡轉(zhuǎn)盤調(diào)至明視野“J”位置； 把視場光闌調(diào)至最?。?.1）； 載物臺上放上已封片的生物樣品，開亮光源，調(diào)焦清晰； 視域中會出現(xiàn)一個局部照明的區(qū)域或亮斑，這是視場光闌的模糊像，在其中可以清晰地看到樣品的細節(jié)；在它之外是較暗的視域，不一定能把樣品的細節(jié)看得清楚； 把聚光鏡微微地向下調(diào)，使視野中的亮斑逐漸收小，慢慢變成一個清晰的多邊形象，這便是視場光闌的清晰像； 一般情況下，多邊形象并不在視域中央，需要調(diào)整聚光鏡的一對調(diào)中螺絲，把視場光闌多邊形的像調(diào)至中央位置； 逐漸開大視場光闌，使多邊形象成為視域的內(nèi)接多邊形，進一步核對調(diào)中的狀況，如對中不夠理想，繼續(xù)微微調(diào)對中螺絲； 將視場光

26、闌稍為再微微開大一些，使它的多邊形象恰好消失在視域的邊緣上，至此，庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整完畢。 庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好以后，整個視域照明均勻，拍攝的顯微照片明亮清晰，反差正常。在日后使用過程中應特別注意： a. 視場光闌不可任意開大，但可隨物鏡倍數(shù)的增大而將視場光闌收小，隨物鏡倍數(shù)的減小而開大； b. 聚光鏡的高低位置不準亂調(diào)，否則會破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng)； c. 使用10×以下物鏡時要將聚光鏡前端透鏡擺出光路外，使用10×或10×以上物鏡時要將前端透鏡擺入光路中； d. 關于物鏡倍數(shù)與視場光闌大小配合問題，在實際使用過程中，作為一般觀察不一定要收小或開大視場光闌，但作

27、顯微照相時，為了避免雜散光線對照相系統(tǒng)的干擾，以便能拍攝到較完善的照片，則應在使用每一個倍數(shù)的物鏡時，把視場光闌調(diào)節(jié)到正好消失于所觀察的視域邊上，這是比較繁復的工作，但又非做不可。較為簡便的方法是把與各個倍數(shù)物鏡相對應的視場光闌事先調(diào)整好，并作好記號，以后使用時根據(jù)記號直接調(diào)至相應的位置。 (4) 孔徑光闌的正確使用由于聚光鏡的孔徑光闌可以影響顯微鏡的分辨率，使用時應掌握正確的使用方法。過去由于對孔徑光闌的認識不足，往往把它當作是調(diào)節(jié)視野亮度的工具。雖然調(diào)節(jié)孔徑光闌在一定程度上可以改變視野的亮度，但會直接影響成像的反差、對比度及分辨率，在使用過程中應盡可能避免。 為了發(fā)揮聚光鏡孔徑光闌的作用，

28、以便在觀察時，尤其在作顯微照相時獲得最佳分辨率，在每換用一個倍數(shù)的物鏡時，在樣品調(diào)焦清晰后，需要調(diào)節(jié)孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑（物鏡孔徑像）的2/3 。 調(diào)整方法是用對中望遠鏡對焦于視野中黑色相差環(huán)上，調(diào)節(jié)孔徑光闌，可以看到一個多邊形的孔徑光闌像，然后調(diào)到等于物鏡孔徑像的2/3，即介于黑色相差環(huán)外與圓形視域內(nèi)之間。為方便起見，可把與各倍數(shù)物鏡相對應的孔徑光闌預先調(diào)整好，并作好標記，以免每次使用都要重新調(diào)整。 2. 顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整及顯微鏡檢術概要顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整，是根據(jù)不同顯微鏡檢術的需要而進行的。所謂顯微鏡檢術（microscopy），概括而言就是以顯微鏡觀

29、察樣品時所使用的照明方法，以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術與方法。以下簡述顯微鏡檢術中已成熟的幾種方法及對應的顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整方法。 (1) 透射光明視野（brightfield）這是自顯微鏡發(fā)明以來最傳統(tǒng)、最普遍的應用方法。 基本部件： a. 物鏡：任何物鏡都可作明視野觀察； b. 聚光鏡：各種聚光鏡均可，最好配有孔徑光闌。 調(diào)整方法：在上述顯微鏡的庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好后，即可應用明視野法。 適用范圍：所有已染色的組織切片、血液涂片等。 注意事項： a. 使用明視野方法觀察時，一定要將庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好； b. 視場光闌不可任意開大，使用10×、10×以

30、下和10×以上物鏡時，要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實出和擺進光路中； c. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來調(diào)節(jié)視野的亮度，更不要亂調(diào)聚光鏡的高低位置，否則，會降低顯微鏡的分辨率和破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng)； d. 作顯微照相時，每換用一個倍數(shù)的物鏡，就要調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑的2/3 。 (2) 透射光相差法（phase-contrast）這是現(xiàn)代顯微鏡檢術中的一種反差增強法。 基本部件：相差物鏡、明視野與相差兼用的多用途聚光鏡、對中望遠鏡、綠色濾光片。 調(diào)整方法： a. 在庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好的基礎上，用明視野方法把樣品調(diào)焦清晰； b. 把聚光鏡轉(zhuǎn)到Ph1對

31、準轉(zhuǎn)盤刻度線位置，選用10×相差物鏡，換上待觀察的透明樣品； c. 拔掉其中一個目鏡，換上對中望遠鏡，并調(diào)焦于視野中的兩個相差環(huán)上（物鏡的黑色相差環(huán)和聚光鏡的透光相差環(huán)）； d. 視野中的兩個相差環(huán)不一定重合，調(diào)節(jié)聚光鏡上的兩個調(diào)節(jié)裝置（調(diào)整相差環(huán)左右位置的調(diào)節(jié)桿和調(diào)整前后位置的摩擦式轉(zhuǎn)鈕），使透光環(huán)作前后左右移動而與黑環(huán)重合； e. 調(diào)整好后，換回觀察用目鏡，將綠色濾光片按入光路中，即可觀察到樣品的相差像； f. 有20×和40×物鏡觀察時，聚光鏡應設在Ph2位置上，用100物鏡時，聚光鏡應設在Ph3位置上。 適用范圍：適用于觀察透明、未染色或不能染色的樣品，如

32、各種細胞、活組織、未染色或不染色的組織切片、水生生物等。 (3) 微分干涉相襯法（differential interference-contrast，DIC）為了克服相差法觀察時樣品細節(jié)像周圍伴隨有光暈，會掩沒掉本來應該看見的細節(jié)，以及樣品或組織切片厚度要求相當薄，原則上下能厚于10?m等局限性，利用雙光束干涉的原理設計子微分干涉相襯法。 調(diào)整方法 a. 必須在庫勒明系統(tǒng)已調(diào)好的基礎上才能調(diào)好DIC方法； b. 先用10×物鏡，以明視野先確定好能把樣品看清晰的物鏡調(diào)焦位置； c. 把起偏器（polarizer）擺入照明光路中，注意其取向應為東西方向； d. 把聚光鏡轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)到與10&

33、#215;物鏡對應使用的位置上，即DIC 0.30.4； e. 在物鏡后方或物鏡轉(zhuǎn)換器上插入10×物鏡使用的DIC插片（DIC slider）； f. 把檢偏器（analyser）插入成像光路中，注意其取向應為南北方； g. 換上待觀察的透明樣品，開亮光源把樣品調(diào)焦清晰； h. 調(diào)節(jié)DIC插片，使微分干涉相襯的像達到最佳效果，也就是浮雕效果最為明顯； i. 同時可調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使反差的效果也達到最佳； j. 然后再細微調(diào)樣品的細節(jié)，可見樣品中不同層面上的結構； k. 如果把補色器（first order red retardation plate）插入，并同時調(diào)節(jié)DIC插片，

34、可在視野中看到不斷變化的絢麗色彩，紅、橙、黃、綠、藍、紫、粉紅、粉紫及金黃色都具有。適用范圍：透明或不能染色的組織切片，厚度可達100?m左右，培養(yǎng)中的活組織和活細胞、小生生物等。 (4) 落射光激發(fā)的熒光法（incident-loght fluorescence Epi-FL）簡稱為落射熒光法，是近代顯微鏡檢術中新發(fā)展出來的一種強有力的反差增強法。它將激發(fā)熒光用的光源改在物鏡的上方，光由物鏡上方經(jīng)反光鏡射入物鏡去激發(fā)樣品，從樣品上被激發(fā)的熒光經(jīng)物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀察。該方法較簡便，效率高，50W的光源強度比透射熒光法的250W還強。 熒光方法是利用波長較短的紫外光、紫光、藍紫光、藍

35、光及綠光等去激發(fā)樣品，只要樣品中含有可產(chǎn)生熒光的成分，它便吸收短波的激發(fā)光而釋放出波長較長的熒光。不同物質(zhì)只能吸改特定波長的激發(fā)光，而釋放的熒光也會有特定的波長，因而用作特異性的鑒定十分有效，如某些致病的細菌和螺旋體，受紫外光激發(fā)后能發(fā)出它們特有的熒光，很容易作出鑒定，這種利用物質(zhì)吸收激發(fā)光后放出特有熒光的方法稱為自發(fā)熒光法。某些物質(zhì)自身不會吸收激發(fā)光，或吸收后不能釋放熒光，但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料，而這些特定的熒光色素或染料也只能吸收特定的激發(fā)光，再釋放出特定的熒光，從而間接地鑒別出某種物質(zhì)，這稱為間接熒光法。上述熒光方法廣泛應用于醫(yī)學、生物學及工業(yè)的特異性研究和鑒別上。 調(diào)整方

36、法：熒光顯微鏡或附有熒光部件的顯微鏡，調(diào)整的方法大致相同。 汞燈的安裝 a. 打開包裝，取出汞燈將其小心安裝在上電極散熱帽上，安裝時注意手指不能直接接觸燈管和散熱帽的正面，汞燈的封氣口要對向散熱帽的左側(cè)或右側(cè)； b. 把汞燈的上電極引張安裝并固定在散熱帽底面的小孔上，再把汞燈的下電極及上電極引線另一端，分別安裝在燈座上各自的插孔中并固定； c. 鎖緊散熱片上的螺絲后，把汞燈連同燈座及散熱帽小心裝入燈室中，鎖緊相應的螺絲，再把燈座上的連線和插座插到汞燈電源后部專用的插座上。 d. 詳細的安裝方法請參照有關說明書。 汞燈燈室在顯微鏡外的初步調(diào)整： a. 接通汞燈電源，讓汞燈預熱10-15min；

37、b. 把汞燈燈室擺放在桌面上，讓汞弧投影到2-3m外的墻上，劃一條與燈室窗口中心線對地高度一樣的水平線作為參考線； c. 轉(zhuǎn)動燈室調(diào)焦旋鈕，使汞弧的像清晰地投影于墻上； d. 分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個調(diào)節(jié)螺絲孔，把汞弧的像其反射像調(diào)成并排且盡量靠近，但不要重疊在一起。 汞燈汞弧在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗： a. 將汞燈照明光路系統(tǒng)中的視場光闌開到最大； b. 把熒光濾光片組推到藍光激發(fā)的位置上，以避免汞燈中的藍光太刺眼； c. 把觀察的樣品或一塊載玻片放在物臺上，蓋上一張比蓋玻片稍大且潔白的薄紙； d. 取下一個物鏡，使激發(fā)的藍光經(jīng)物鏡轉(zhuǎn)換器的空檔照在白紙上，白紙上會有一藍色的圓形照明區(qū)域，汞弧的像及其反射像都應該出現(xiàn)在這區(qū)域的中央部位，否則，可調(diào)節(jié)燈室調(diào)焦旋鈕至最清晰，然后分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個調(diào)節(jié)螺絲孔，直至汞弧的像及其反射像并排在照明區(qū)域的中央位置。 e. 調(diào)好之后，把物鏡裝回去，通過目鏡可見白紙被藍光激發(fā)后發(fā)射出的黃綠色熒光； f. 仔細調(diào)焦，可看清白紙的纖維；取去白紙，樣品上的熒光細節(jié)隱約可見而很容易調(diào)焦清晰。 汞燈使用注意事項目前通常使用的為50W超高氣壓汞燈，燈管內(nèi)通有一對鎢電極和液態(tài)汞（室溫下附在管壁上），未點燃時，管內(nèi)氣壓很低，在燈管的兩電極間施加電壓角發(fā)點燃后，汞氣化為汞蒸氣形成汞弧而產(chǎn)生強光，溫度升高，管內(nèi)氣壓迅速升到10個大氣壓。由于是高氣