氨基酸的測定實(shí)用教案

1、氨基酸的定義(dngy)(dngy) 它是含有氨基(nj)和羧基的一類有機(jī)化合物的通稱。大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位，是構(gòu)成動(dòng)物營養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)。是含有一個(gè)堿性氨基(nj)和一個(gè)酸性羧基的有機(jī)化合物。氨基(nj)連在-碳上的為-氨基(nj)酸。組成蛋白質(zhì)的氨基(nj)酸均為-氨基(nj)酸。第1頁/共24頁第一頁，共25頁。食品(shp(shpn)n)中蛋白質(zhì)的氨基酸組成 蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的高分子化合物，目前各種氨基酸已達(dá)175種以上，但是構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸主要是其中的20種，按照-氨基酸側(cè)鏈R基團(tuán)的結(jié)構(gòu)可分為：脂肪(zhfng)族類：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。羥基類

2、：絲氨酸、蘇氨酸酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸堿性氨基酸：賴氨酸、精氨酸、組氨酸酰胺類：天冬酰胺、谷氨酰胺含硫類：半胱氨酸、蛋氨酸芳香族類：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸亞氨基酸：脯氨酸第2頁/共24頁第二頁，共25頁。 在構(gòu)成構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸中，亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等8種氨基酸在人體中不能合成，必須依靠從食品攝入，故被稱為必需氨基酸，它們對人體有著極其重要的生理功能。 限制氨基酸：是指食物蛋白質(zhì)中一種或幾種必需氨基酸缺少或數(shù)量不足(bz)，就會(huì)使食物蛋白質(zhì)合成為機(jī)體蛋白質(zhì)的過程受到限制，亦即限制了此種蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值，這類氨基酸就稱為限制氨基酸。 評價(jià)

3、某種蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值包括兩個(gè)方面：一是各種必需氨基酸含量是否豐富，二是必需氨基酸的構(gòu)成是否符合一定比例。食品(shp(shpn)n)中蛋白質(zhì)的氨基酸組成第3頁/共24頁第三頁，共25頁。測定(cdng)意義 隨著食品科學(xué)的發(fā)展和營養(yǎng)知識(shí)的普及，食物蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的構(gòu)成，愈來愈得到人們的重視。為提高蛋白質(zhì)的生理效價(jià)而進(jìn)行食品氨基酸互補(bǔ)和強(qiáng)化的理論，對食品加工(ji gng)工藝的改革，對保健食品的開發(fā)及合理配膳等工作都具有積極的指導(dǎo)作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分離、鑒定和定量也就具有極其重要的意義。 鑒于食品中氨基酸成分的復(fù)雜性，在一般的常規(guī)檢驗(yàn)中多測定樣品中的氨基酸

4、總量，通常采用酸堿滴定法測定。 色譜技術(shù)的發(fā)展則為各種氨基酸的分離、鑒定及定量提供了有力的工具，近年世界上已出現(xiàn)多種氨基酸分析儀，這使得快速鑒定和定量氨基酸的理想成為現(xiàn)實(shí)。 第4頁/共24頁第四頁，共25頁。氨基酸的定性(dng xng)(dng xng)測定個(gè)別氨基酸的顯色(xin s)反應(yīng)氨基酸的一般顯色反應(yīng)茚三酮法吲哚(yn du)醌法鄰苯二甲醛法精氨酸（坂口反應(yīng)）胱氨酸和半胱氨酸甘氨酸脯氨酸絲氨酸和羥賴氨酸羥脯氨酸色氨酸酪氨酸酪氨酸和組氨酸（Pauly反應(yīng)）第5頁/共24頁第五頁，共25頁。氨基酸的定量(dngling)(dngling)測定個(gè)別(gbi)氨基酸的定量測定氨基酸的一般定

5、量測定甲醛滴定法電位(din wi)滴定法茚三酮比色法非水溶液滴定法鄰苯二甲醛法三硝基苯磺酸法乙酰丙酮和甲醛熒光法賴氨酸 色氨酸苯丙氨酸酪氨酸脯氨酸羥脯氨酸胱氨酸 谷氨酸第6頁/共24頁第六頁，共25頁。氨基酸的分離(fnl)(fnl)及測定薄層色譜法氨基酸自動(dòng)(zdng)分析儀法氣相色譜法高效液相色譜法第7頁/共24頁第七頁，共25頁。 茚三酮法 （以測定蜂蜜及果葡糖漿(tngjing)(tngjing)中的氨基酸含量為例） 雙語例句(lj)反應(yīng)原理 氨基酸在一定pH條件下與茚三酮起反應(yīng)，生成藍(lán)紫色化合物，可比色(570nm)定量。注意：茚三酮受陽光、溫度、濕度、空氣等影響易被氧化呈淡紅或深

6、紅色，使用前要進(jìn)行純化,方法如下： 取10g茚三酮容于40ml熱水中，加1克活性炭，搖勻靜置30分鐘，過濾，將濾液(ly)放入冰箱中，即出現(xiàn)藍(lán)色結(jié)晶，過濾，用2ml冷水洗滌結(jié)晶，置干燥皿中干燥，裝瓶備用。 第8頁/共24頁第八頁，共25頁。 茚三酮法 （以測定蜂蜜及果葡糖漿(tngjing)(tngjing)中的氨基酸含量為例） 雙語例句(lj)1.材料與方法：葵花蜜、洋槐蜜等；茚三酮、谷氨酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硼酸等。7200可見分光光度計(jì)等 準(zhǔn)確稱取100mg谷氨酸(純度不低于99% )，溶于100 mL水中，即母液。用此母液及磷酸緩沖液配制終質(zhì)量濃度分別為0，20 , 40 , 6

7、0 , 80 ,100 ,150 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液(rngy)。取5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(rngy)，加入1.0 mL 5 mg/mL茚三酮溶液(rngy)，沸水加熱5 min，冷卻后加水定容至10mL ,于570 nm處測定吸光度，繪制谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 。2.2回收率及精密度實(shí)驗(yàn)用去離子水將谷氨酸和果葡糖漿配制成谷氨酸含量分別為50,25,12.5 , 6.25 g/mL的果葡糖漿樣品。以未加谷氨酸的果葡糖漿為空白，采用茚三酮法測定其中的氨基酸含量。計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD ) 。2.3果葡糖漿中氨基酸含量的測定 ：取13份不同的果葡糖漿樣品各5g，編號(hào)分別為HFCS1至HFCS13，采用

8、茚三酮法測定每個(gè)樣品的氨基酸含量。2.4蜂蜜中氨基酸含量的測定取冬蜜、拎蜜、洋槐蜜、葵花蜜、龍眼蜜，采用茚三酮法測定每個(gè)樣品的氨基酸含量。第9頁/共24頁第九頁，共25頁。 茚三酮法 （以測定(cdng)(cdng)蜂蜜及果葡糖漿中的氨基酸含量為例） 雙語例句(lj)2.5蜂蜜與果葡糖漿混合物中氨基酸含量的測定根據(jù)1.3.3節(jié)測定結(jié)果，分別用氨基酸含量最低和最高的果葡糖漿將冬蜜、葵花蜜、洋槐蜜按不同比例(bl)混合成果葡糖漿含量為0 , 20% , 40% ,60% , 80%的蜂蜜樣品，采用茚三酮顯色法測定每個(gè)樣品的氨基酸含量。2.6數(shù)據(jù)處理方法每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3次平行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值表示。

9、平均值及其他統(tǒng)計(jì)參數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)差及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)的計(jì)算采用excel軟件處理。結(jié)論 1)采用茚三酮顯色法測定的蜂蜜及果葡糖漿的氨基酸含量在0150 g/mL范圍，該法具有線性好、準(zhǔn)確性及精密度高等特點(diǎn)。 2)蜂蜜與果葡糖漿混合物中的氨基酸含量和果葡糖漿摻入量呈良好的負(fù)線性關(guān)系。采用茚三酮顯色法測定蜂蜜樣品的氨基酸含量，可以快速判斷蜂蜜中是否摻入了果葡糖漿。第10頁/共24頁第十頁，共25頁。 甲醛(ji qun)(ji qun)滴定法雙語例句(lj)反應(yīng)原理原理 將酸度計(jì)的玻璃電極及甘汞電極同時(shí)插入被測液中構(gòu)成電池，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到酸度計(jì)指示的pH值為8.2為終點(diǎn)(zhngdin)，記下所

10、用的氫氧化鈉的體積數(shù)V1,此時(shí)滴定的是游離酸,根據(jù)氨基酸的兩性作用,再加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，繼續(xù)用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到酸度計(jì)指示的pH值為9.2為終點(diǎn)(zhngdin),此時(shí)滴定的是氨基酸。 雙指示劑： 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至淡藍(lán)色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液，（9.410.6） 0.1%中性紅 50%乙醇溶液，（6.88.0） 0.1 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。操作：取相同兩份樣品2030mg分別于250ml三角瓶各加50ml蒸餾水 一份加中性紅3滴用0.1mol/L NaOH滴定終點(diǎn)（由紅變琥珀色），記錄用量，另一份

11、加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml搖勻用0.1mol/L NaOH 滴至淡藍(lán)色。分別記錄兩次所消耗的堿液ml數(shù)。（以測定氨杞精口服液中的氨基酸含量為例）第11頁/共24頁第十一頁，共25頁。 甲醛(ji qun)(ji qun)滴定法計(jì)算(j sun)： 氨基酸態(tài)氮= c（V2-V1）0.014100） /W100 V1用中性紅為指示劑時(shí)，堿液所消耗的體積 V2用百里酚酞乙醇液為指示劑時(shí)標(biāo)液消耗量 應(yīng)用： 氨杞精口服液是由天然原料提取的氨基酸粉(含20多種氨基酸)，加上構(gòu)祀子、黃精煎煮液配制而成的口服液。其中氨基酸為主要(zhyo)有效成份， 采用甲醛滴定法測定氨基酸的總量做為質(zhì)量控制方法

12、，操作簡便 。 醬油的檢測也可用此法。（以測定氨杞精口服液中的氨基酸含量為例）第12頁/共24頁第十二頁，共25頁。 電位(din wi)(din wi)滴定法雙語例句(lj)反應(yīng)原理 將酸度計(jì)的玻璃電極及甘汞電極同時(shí)插入被測液中構(gòu)成電池，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到酸度計(jì)指示的pH值為8.2為終點(diǎn)，記下所用的氫氧化鈉的體積數(shù)V1,此時(shí)(c sh)滴定的是游離酸,根據(jù)氨基酸的兩性作用,再加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，繼續(xù)用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到酸度計(jì)指示的pH值為9.2為終點(diǎn),此時(shí)(c sh)滴定的是氨基酸。儀器附磁力攪拌器的酸度計(jì);25mL酸式滴定管; 10mL胖肚吸管。（以測定醬

13、油中的氨基酸含量為例）第13頁/共24頁第十三頁，共25頁。 電位(din wi)(din wi)滴定法 （以測定(cdng)醬油中的氨基酸含量為例）操作方法：（1）樣品處理：先測出待測醬油的比重，然后吸取醬油5.00mL于100mL容量瓶中,加水定容。吸取定容液20.00mL于250mL燒杯中,加水60mL，放入磁力轉(zhuǎn)子，開動(dòng)磁力攪拌器使轉(zhuǎn)速適當(dāng)。用pH6.18的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正好酸度計(jì)，然后將電極清洗干凈(gnjng)，再插入到上述醬油液中，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2,記下消耗的NaOH溶液體積。（2）氨基酸的滴定：在上述滴定至pH8.2的溶液中加入10.00mL的中性甲醛

14、溶液，再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2,記下消耗的NaOH溶液體積。（3）空白滴定：吸取80mL蒸餾水于250mL的燒杯中，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH8.2,然后加入10.00mL中性甲醛溶液，再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2,記下加入甲醛后消耗的NaOH溶液體積。10010020m014. 0CVV%21）（氨基酸態(tài)氮第14頁/共24頁第十四頁，共25頁。 薄層(bo cn)(bo cn)色譜法 原理： 取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過(jnggu)多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的Rf值，不同成

15、分則有不同的Rf值，因而各種混合物可達(dá)到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對比，鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點(diǎn)顏色的深淺可以大致確定其含量。（以測定(cdng)味精中的氨基酸含量為例）ab樣點(diǎn)溶劑前沿點(diǎn)樣原點(diǎn)Rf = a / b第15頁/共24頁第十五頁，共25頁。 薄層(bo cn)(bo cn)色譜法 操作方法： 薄層板制備 樣品液制備 點(diǎn)樣：距薄板底端2cm處，用針畫一標(biāo)記(bioj)作為原點(diǎn)。再以點(diǎn)樣距扳子寬窄可點(diǎn)幾個(gè)點(diǎn)同時(shí) 展開，點(diǎn)與點(diǎn)之間間隔12cm。 可用毛細(xì)玻璃管、微量吸管或微量注射器。注意要等一個(gè)點(diǎn)干了再點(diǎn)另一個(gè)點(diǎn)。 展開：點(diǎn)樣完了，放入密閉容器中（展開槽）

16、，傾斜一定角度1030，下端浸入展開劑1cm，千萬別讓溶劑浸過了樣點(diǎn)。到離頂端一部分，取出樣板、晾干、顯色。（以測定(cdng)味精中的氨基酸含量為例） 顯色：a.噴適當(dāng)?shù)娜芤?，使斑點(diǎn)顯色，即噴霧顯色。b.噴有熒光反應(yīng)的物質(zhì)，在紫外光下觀察斑點(diǎn)。c.將涂有熒光指示劑的薄層板放在紫外燈下觀察。 （涂板時(shí)把熒光指示劑加入到固體吸附劑中）第16頁/共24頁第十六頁，共25頁。 氨基酸自動(dòng)(zdng)(zdng)分析儀法雙語例句(lj)樣品的處理 取含蛋白20 mg的各種樣品于水解管中，加12 mL的6 mol/L鹽酸，滴入幾滴苯酚，充氮后封管，置于1100C烘箱中保持22 h，冷卻后經(jīng)濾紙過濾到50

17、 mL容量瓶中，用超純水反復(fù)沖洗水解管及濾紙，最后(zuhu)定容至刻度。m濾膜過濾，備用上機(jī)。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精確吸取經(jīng)脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL, 0.5 mL,1.0 mL,1.5 mL, 2.0 mL, 2.SmL, 3.0 mL分別加入到100 mL容量瓶中，用水稀釋到刻度，進(jìn)氨基酸分析儀分析，以峰面積和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖。 （乳制品中羥脯氨酸）第17頁/共24頁第十七頁，共25頁。 氨基酸自動(dòng)(zdng)(zdng)分析儀法雙語例句(lj)樣品的檢測與分析 分別取市售不同的膠原蛋白粉、明膠、奶粉等樣品，按上述樣品處理方法(fngf)進(jìn)行處理后進(jìn)樣，測定不同樣品中17種水解氨基酸和經(jīng)脯氨酸

18、的含量。 若樣品中檢出有經(jīng)脯氨酸，則說明有膠原蛋白的存在，可作為乳粉中是否添加動(dòng)物膠原水解蛋白的依據(jù)。 該方法(fngf)樣品處理簡便易操作，可以對羥脯氨酸直接進(jìn)行分析，避免了衍生產(chǎn)物的多樣性，也不涉及樣品中氨基酸衍生不徹底等問題，能快速、準(zhǔn)確地判斷乳制品中是否添加了動(dòng)物膠原水解蛋白。（乳制品中羥脯氨酸）第18頁/共24頁第十八頁，共25頁。 氣相色譜法雙語例句(lj)（辨別燕窩(ynw)的真?zhèn)危?. 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 2.1樣品水解：稱取約50mg研碎的樣品(如為燕窩飲品，則過濾，將固形物供干、研碎后稱取)，放于l 0ml容量瓶中，加入5一7mL6N鹽酸，用高純氮?dú)馀抛呖諝?kngq)，

19、蓋緊塞子，放于145C烘箱中水解4小時(shí)，冷卻，加氫氧化鈉中和，如懸濁，則離心后取5m1澄清液做下一步處理。 反應(yīng)原理： 一定量的氣體或液體分析物被注入到柱一端的進(jìn)樣口中。當(dāng)分析物在載氣帶動(dòng)下通過色譜柱時(shí)，分析物的分子會(huì)受到柱壁或柱中填料的吸附，使通過柱的速度降低。由于每一種類型的分子都有自己的通過速率，分析物中的各種不同組分就會(huì)在不同的時(shí)間到達(dá)柱的末端，從而得到分離。檢測器用于檢測柱的流出流，從而確定每一個(gè)組分到達(dá)色譜柱末端的時(shí)間以及每一個(gè)組分的含量。通過物質(zhì)流出柱的順序和它們在柱中的保留時(shí)間來表征不同的物質(zhì)。第19頁/共24頁第十九頁，共25頁。 氣相色譜法雙語例句(lj)（辨別(binbi

20、)燕窩的真?zhèn)危?：取5m1水解液倒入裝有陽離子交換樹脂的玻璃柱中，以0. 5mL/min的流速過柱，然后用蒸餾水洗柱，直至用硝酸銀溶液檢不出氯離子為止，再依次用5mL2N氨水溶液和25mL蒸餾水將氨基酸洗脫出來，合并洗脫液，真空蒸發(fā)溶液至近干，用少量0. 1N鹽酸將殘液轉(zhuǎn)移到微量反應(yīng)瓶做下一步處理。 2.3氨基酸衍生化：將上述溶液轉(zhuǎn)移于微量反應(yīng)瓶中，在100砂浴中用(zhngyng)氮?dú)獯蹈?，加入?mL二氯甲烷，再置砂浴，繼續(xù)吹入氮?dú)猓箽埓娴乃止卜写党觥４蹈珊?，加?. 5mL3N鹽酸一正丁醇溶液，在超聲波浴中振蕩約2分鐘，以加速氨基酸的溶解，蓋緊塞子，在110砂浴中酯化5分鐘，稍冷，吹入氮?dú)猓舭l(fā)正丁醇和鹽酸，按前述步驟加入二氯甲烷以除去水分。最后加入0. 2m1三氟乙酰酐和0. 6m1二氯甲烷，在超聲波浴中震蕩1一2分鐘，蓋緊在140砂浴中進(jìn)行酯化反應(yīng)20分鐘。 2.4測定色譜條件OBD-1石英毛細(xì)管柱，50m X0. 25mm，分流方式進(jìn)樣。 第20頁/共24頁第二十頁，共25頁。 高效(o xio)(o xio)液相色譜法雙語例句(lj)（測定(cdng)西洋參中的氨基酸）操作方法：1.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制2.微波提取和水