高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用HPLC-MS試驗含思考題

1、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS的各種模式探索一、實驗?zāi)康?、了解LC-MS的主要構(gòu)造和基本原理；2、學(xué)習(xí)LC-MS的基本操作方法；3、掌握LC-MS的六種操作模式的特點及應(yīng)用。二、實驗原理1 、液質(zhì)基本原理及模式介紹液相色譜- 質(zhì)譜法（ Liquid Chromatography/Mass Spectrometry ，LC-MS將應(yīng)用范圍極廣的分離方法一一液相色譜法與靈敏、專屬、能提供分子量 和結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜法結(jié)合起來，必然成為一種重要的現(xiàn)代分離分析技術(shù)。但是，LC是液相分離技術(shù)，而 MS是在真空條件下工作的方法，因而難以 相互匹配。LC-MS經(jīng)過了約 30年的發(fā)展，直至采用了大氣壓離子化

2、技術(shù)（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才發(fā)展成為可常規(guī)應(yīng)用的重要分離分析方法?，F(xiàn)在，在生物、醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)和環(huán)境等各個領(lǐng)域中均 得到了廣泛的應(yīng)用，在組合化學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的研究工作中， LC-MS 已經(jīng)成為最重要研究方法之一。質(zhì)譜儀作為整套儀器中最重要的部分，其常規(guī)分析模式有全掃描模式（Scan）、選擇離子監(jiān)測模式（SIM）。（一）全掃描模式方式（Scan）：最常用的掃描方式之一，掃描的質(zhì)量范圍覆蓋被測化合物的分子離子和碎片離子的質(zhì)量，得到的是化合物的全譜，可 以用來進行譜庫檢索，一般用于未知化合物的定性分析。實例：（ Q1 = 100-

3、259m/z）（二）選擇離子監(jiān)測模式（Selective Ion Monitoring， SIM）:不是連續(xù)掃描某一質(zhì)量范圍，而是跳躍式地掃描某幾個選定的質(zhì)量，得到的不是化合物 的全譜。主要用于目標化合物檢測和復(fù)雜混合物中雜質(zhì)的定量分析。實例： （Q1 = 259m/z ）本實驗采用三重四極桿質(zhì)譜儀（Q1:質(zhì)量分析器；Q2：碰撞活化室；Q3: 質(zhì)量分析器），由于多了 Q2、Q3 的存在，在分析測試的模式上又多了四種選 擇：（三）子離子掃描模式（ Product Scan ）：第一個質(zhì)量分析器固定掃描電 壓，選擇某一質(zhì)量離子（母離子）進入碰撞室，發(fā)生碰撞解離產(chǎn)生碎片離子， 第二個質(zhì)量分析器進行全

4、掃描，得到的所有碎片離子都是由選定的母離子產(chǎn)生 的子離子，沒有 其它 的干 擾。 主要用于化合 物結(jié) 構(gòu)分析。 實例：（ Q1 = 259m/z； Q3 = 100-259m/z ）（四）母離子掃描模式（ Precursor Scan ）：第一個質(zhì)量分析器掃描電壓 選擇母離子（如分子離子） ，進入碰撞室碰裂后，第二個質(zhì)量分析器固定掃描電 壓，只選擇某一特征離子質(zhì)量，該特征離子是由所選擇的母離子產(chǎn)生的，由此 得到所有能產(chǎn)生該子離子的母離子譜。主要用于同系物的分析。實例：（Q1 =100-300m/z；Q3 = 259m/z ）（五）中性丟失掃描模式（ Neutral Loss ）：第一個質(zhì)量分析

5、器掃描所有 離子，所有離子進入碰撞室碎裂后，第二個質(zhì)量分析器以與第一個質(zhì)量分析器 相差固定質(zhì)量聯(lián)動掃描，檢測丟失該固定質(zhì)量中性碎片（如質(zhì)量數(shù)15、 18、45）的離子對，得到中性碎片譜。主要用于中性碎片的分析。實例：（Q1 =100-300m/z ；Q3 = 82-282m/z ）（六）多反應(yīng)監(jiān)測模式（MR）第一個質(zhì)量分析器選擇一個（或多個）特 征離子，經(jīng)過碰撞解離，到達第二個質(zhì)量分析器再進行選擇離子檢測，只有符 合特定條件的離子才能被檢測到，因為是兩次選擇，比單四極質(zhì)量分析器的 SIM 方式選擇性、排除干擾能力、專屬性更強，信噪比更高。主要用于定量分 析。實例： （Q1 = 259m/z ；

6、Q3 = 138m/z ）2、實驗內(nèi)容簡介鄰苯二甲酸酯（簡稱PAEs是一類重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，常被用作塑料 的增塑劑，也可用作農(nóng)藥載體。近年來，隨著工業(yè)生產(chǎn)和塑料制品的廣泛使 用，鄰苯二甲酸酯不斷進入環(huán)境，普遍存在于土壤、底泥、大氣、水體和生物 體等環(huán)境樣品中，成為環(huán)境中無所不在的污染物。據(jù)報道，鄰苯二甲酸酯類具 有較弱的環(huán)境雌激素成分，具有影響生物體內(nèi)分泌和導(dǎo)致癌細胞增殖的作用。 環(huán)境內(nèi)分泌干擾物是指能改變機體內(nèi)分泌功能，并對機體、后代或（亞）種群 產(chǎn)生有害效應(yīng)的環(huán)境物質(zhì)。由于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對人和動物有種種不良影響，對環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的研究已成為國際關(guān)注的焦點。我國也正在逐漸重視 有關(guān)

7、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的研究。三、儀器與試劑1、儀器液相系統(tǒng)： Varian Pro Star ；自動進樣器： Varian 410 自動進樣器；質(zhì)譜儀： Varian 310 LC-MS/MS 三重四極桿質(zhì)譜儀( ESI 離子源)；色譜柱：Varian Inertsil 3 ODS-3(150mM 2mn, 3 卩 m)。2、試劑甲醇：HPLC色譜純；超純水： Millipore Express 超純水系統(tǒng)制備；標準溶液：用甲醇配制鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)混合標準溶液(O.lppm)。四、實驗步驟1 、條件設(shè)置色譜條件：流動相(90%甲醇

8、+10%水)；流速( 0.2ml/min )；掃描時間( 7min)；離子源模式：電噴霧電離(ESI),正離子模式；掃描條 件： Detector ： 1000V； Needle ： 5000V； Shield ： 600V； Spray Chamber Temperature : 50 °C； Nebuliz ing Gas Pressure : 55psi ； Drying Gas Pressure : 18psi , Drying Gas Temperature ( C): 250C, Capilary Voltage 30(V) ， Coll.Energy 30(v)；質(zhì)量分

9、析器：三重四極桿；進樣體積： 10ul 。2、實驗測定按實驗操作規(guī)程完成儀器開機、參數(shù)設(shè)置及測定。根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)，設(shè)置 m/z,選擇各種掃描模式(全掃描、選擇離子掃描、子離子掃描、母離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測模式)進行測定。3、數(shù)據(jù)處理表1待測物質(zhì)的母離子和主要子離子DMPDEPDBP母離子195.1223.1279.1（m/z）子離子163.1149.1149.1（m/z）（一）全掃描模式方式（Scan）:*1 丨歿R % (X I 四+函”忑閩(二)選擇離子監(jiān)測模式(Selective Ion Monitoring, SIM):224Acquirsd Range m/zMCounl&1

10、.5-1 0-0 6-S/N (RMS): 1484S-2.11e+QQ6N- 14243-46-4Q PM-9-20-2aW-3ampls1Filtered 世兇501DQ1- n也.mutes| | j1 | OFFHp F sIons：-1剣幻|夷*環(huán)F X II *1血閩2(刃 mim Sc汕；11匕 223,0： RIC; 2刃加圧唧理納1Spectrum 1A日P 223.1 (2,37矢也=100%),pm9：282J1®wampl1MCcunlS2231 237佔1A2.(P0(H(三)子離子掃描模式(Product Scan ):*1 1|歿， ” X覽彳rH回匝閩

11、(四)母離子掃描模式(Precursor Scan ):1 I off*1pJ J- sIons：=1時1畫 ” IT i1 rr T直庇帆1Spectrum 1ABP:CB38D40hClCl%)" 4-13囚kCounts：2.074 min, Scan: 11E, 100.0:350.0>149.0 -15.0V1. RIC: 2.714e+6 ZS.3330401A3001 1350100200250300223.0>ld.J（五）多反應(yīng)監(jiān)測模式（MR）-15.0V/n fRMSj： 1911S; 964393N: 5050.7&H0 25-ow50

12、9;'''JJJ"10.012.615.017.5111 I 0FF*|p| 1 sIons：N 3 HHE | TT *個*藍閩MCounts;Segment 11490104卩柘Spectrum 1AEF1: MPO 化一04滄託hClO臨），422-羽少m-9-2手201®騎mpl/.xms 2IK3 min,氐art 杓，223.CMA9U 戸5.0£, R£: LO4兀代minutes0.7&I1Aosoe0 0（H14914915f4、思考題1、各掃描模式中m/z分別如何設(shè)定?（一）全掃描模式方式（Scan）：

13、 100-300m/z;（二）選擇離子監(jiān)測模式（Selective Ion Monitoring ，SIM）: 279m/z;（三）子離子掃描模式（Product Scan ）: Q1=279m/z,Q2=100-279m/z;（四） 母離子掃描模式（Precursor Scan ）: Q仁 149-300m/z ,Q2=149m/z;五）多反應(yīng)監(jiān)測模式（ MRM）： Q1=279m/z,Q2=149m/z;2、比較各模式的測定結(jié)果，討論各模式在測定中的作用。（一）全掃描模式方式（ Scan）： 掃描的質(zhì)量范圍覆蓋被測化合物的分子離子和碎片離子的質(zhì)量，得到的是 化合物的全譜，一般用于未知化合物的定性分析。（二）選擇離子監(jiān)測模式（ Selective Ion Monitoring， SIM）：跳躍式地掃描某幾個選定的質(zhì)量，得到的不是化合物的全譜。主要用于目 標化合物檢測和復(fù)雜混合物中雜質(zhì)的定量分析。（三）子離子掃描模式（ Product Scan ）： 對碰撞解離產(chǎn)生碎片離子，第二個質(zhì)量分析器進行全掃描，得到的所有碎 片離子都是由選定的母離子產(chǎn)生的子離子，沒有其它的干擾。主要用于化合物 結(jié)構(gòu)分析。（四）母離子掃描模式（ Precursor Scan ）： 第一個質(zhì)量分析器根據(jù)某一特征離子質(zhì)量掃描電壓，確定該特征離子是由 哪種所選擇的母離子產(chǎn)生的