gp與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的基因治療

1、1會(huì)計(jì)學(xué)gp與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的基因治療與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的基因治療IL-6簡介：IL-6是一種由單核/巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、Th2細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。主要生物學(xué)活性包括：促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化和產(chǎn)生抗體；促進(jìn)CTL、NK的分化并增強(qiáng)殺瘤活性；促進(jìn)肝合成急性期蛋白；作為內(nèi)源性致熱源，參與炎癥反應(yīng)。IL-6異常與系統(tǒng)性紅斑狼瘡：SLE病人的B細(xì)胞可自發(fā)產(chǎn)生大量IL-6，而正常人的B細(xì)胞幾乎不產(chǎn)生IL-6。在SLE病人中，B細(xì)胞主要由IL-6刺激分化與增殖。SLE病人B細(xì)胞同時(shí)表達(dá)IL-6高親和力受體（IL-6 Receptor,IL-6R），組成一個(gè)自分泌刺激環(huán)，促使B細(xì)

2、胞多克隆活化。IL-6還能誘導(dǎo)SLE病人B細(xì)胞產(chǎn)生抗DNA抗體，這是SLE的特征抗體之一1。IL-6的簡要致病機(jī)理如下圖：B細(xì)胞IL-6IL-6R復(fù)合物抗DNA抗體gp130分子是分子量為130 kD的糖蛋白，是白介素-6(IL-6)的信號(hào)傳導(dǎo)鏈。IL-6和IL-6受體(IL-6R)結(jié)合后，并不引起信號(hào)的跨膜傳遞，還必須與二個(gè)gp130分子結(jié)合，使之發(fā)生同二聚體化，導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)Jak激酶的活化，引起信號(hào)傳遞1。IL-6/IL-6R的信號(hào)傳導(dǎo)鏈如下圖所示：可溶性gp130（soluble gp130, sgp130）細(xì)胞因子受體有膜蛋白和可溶性蛋白兩種形式，大多數(shù)細(xì)胞因子受體的可溶性表達(dá)都能起到

3、競(jìng)爭性抑制細(xì)胞因子與膜蛋白受體結(jié)合的作用。因此，研究人員已嘗試過用sgp130競(jìng)爭性阻斷IL-6/IL6R復(fù)合物刺激B細(xì)胞分化增殖的信號(hào)傳導(dǎo)1。復(fù)合物gp130B細(xì)胞sgp130gp130抗體gp130抗體能與細(xì)胞膜表面的gp130發(fā)生特異性結(jié)合，阻止復(fù)合物與gp130結(jié)合2。gp130抗體復(fù)合物gp130siRNA：未見過用gp130的siRNA沉默gp130來治療SLE的嘗試，但研究表明gp130的siRNA確實(shí)可以大大降低細(xì)胞膜表面gp130受體的數(shù)量3，進(jìn)而抑制B細(xì)胞的活化。siRNA，即小干擾RNA，是一段長約20個(gè)堿基對(duì)、與靶標(biāo)基因高度同源的雙鏈RNA. siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后，

4、可引起與其同源的特異基因mRNA降解，進(jìn)而抑制這段基因的表達(dá)，屬于轉(zhuǎn)錄后抑制。siRNA的發(fā)現(xiàn)者獲得了2006年諾貝爾獎(jiǎng)，并被科學(xué)雜志連續(xù)兩年評(píng)為十大科技進(jìn)展之首。siRNA的基因沉默機(jī)理如下圖：基因載體的選擇基因載體的選擇化學(xué)、材料學(xué)與生物學(xué)問題：化學(xué)、材料學(xué)與生物學(xué)問題：病毒類基因載體：最早進(jìn)入臨床試驗(yàn)和藥物研發(fā)的基因載體，目前在基因治療中仍占有不小的比例。優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)染率高、基因表達(dá)時(shí)間持久。缺點(diǎn)：安全性受到質(zhì)疑，運(yùn)載的基因片段長度有限，制備復(fù)雜，成本昂貴。非病毒基因載體：最近十年開始受到廣泛關(guān)注，潛力巨大。優(yōu)點(diǎn)：無免疫原性，外源基因整合到核基因中的概率極低，制備簡單，成本較低。缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)染率

5、低于病毒載體。本實(shí)驗(yàn)中擬采用非病毒基因載體。設(shè)計(jì)一種非病毒基因載體，將本實(shí)驗(yàn)中擬采用非病毒基因載體。設(shè)計(jì)一種非病毒基因載體，將gp130的的siRNA安全、高效地轉(zhuǎn)入動(dòng)物模型體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)基因治療。安全、高效地轉(zhuǎn)入動(dòng)物模型體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)基因治療。非病毒載體的研究工作超出了基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的范疇，所以該項(xiàng)目需要化學(xué)、生物學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)專業(yè)的學(xué)生合作完成。浙江大學(xué)化學(xué)系09級(jí)本科生胡天楠師從湯谷平教授，已開始著手合成用于SLE的基因治療的非病毒基因載體。他將要合成的載體是PHPA-PEI，其安全性和運(yùn)載目的基因的能力已被相關(guān)研究證實(shí)1。這是世界范圍內(nèi)，聚陽離子型非病毒基因載體在SLE的基因治療中的首次嘗試。該項(xiàng)目日

6、前已被批準(zhǔn)獲得2011年全國大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（國創(chuàng)）的資助。下圖是PHPA-PEI的結(jié)構(gòu)式。1.用用gp130的的siRNA在體外研究其對(duì)紅斑狼瘡中在體外研究其對(duì)紅斑狼瘡中B細(xì)胞活化的影響細(xì)胞活化的影響從sigma試劑公司或GeneBank數(shù)據(jù)庫中獲取gp130的siRNA序列，并交由生物技術(shù)公司，擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)錄后能得到相應(yīng)siRNA的質(zhì)粒載體（以下簡稱siRNA質(zhì)粒）。取SLE小鼠（NZB/NZW品系）骨髓細(xì)胞，分離純化，得到B細(xì)胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)后得B細(xì)胞系。分別用siRNA質(zhì)粒和空白對(duì)照處理B細(xì)胞，用westernblot法檢測(cè)處理后細(xì)胞表面gp130的表達(dá)情況。然后用脂多糖刺激B細(xì)胞，

7、誘導(dǎo)B細(xì)胞分化增殖，觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間B細(xì)胞的增殖速度有無差異。2.合成非病毒載體，將合成非病毒載體，將siRNA質(zhì)粒送入質(zhì)粒送入SLE小鼠體內(nèi)，嘗試小鼠體內(nèi)，嘗試SLE的基因治療。的基因治療。合成PHPA-PEI非病毒基因載體，用Zeta電勢(shì)儀測(cè)量該載體的粒徑和表面電勢(shì)，并用凝膠阻滯電泳測(cè)試這種材料與DNA的結(jié)合能力（以上工作由浙江大學(xué)完成）。將PHPA-PEI與siRNA質(zhì)粒形成的復(fù)合物注入SLE小鼠體內(nèi)，化驗(yàn)注射后小鼠各項(xiàng)相關(guān)生理指標(biāo)（抗dsDNA抗體、尿蛋白等），并與空白組、siRNA質(zhì)粒組、PHPA-PEI組相對(duì)照，以驗(yàn)證基因治療是否確實(shí)有效。隨著人類對(duì)疾病認(rèn)識(shí)的逐漸深入，越來越

8、多的疾病可以歸因?yàn)榛虍惓?。針?duì)特定基因進(jìn)行基因治療，既可以避免傳統(tǒng)藥物特異性差、副作用大的缺點(diǎn)，又可以解決傳統(tǒng)藥物設(shè)計(jì)周期過長、蛋白質(zhì)藥物（如利妥昔單抗等細(xì)胞因子）成本過高普及困難的問題。20年前，當(dāng)計(jì)算機(jī)藥物設(shè)計(jì)的概念剛剛被提出的時(shí)候，有關(guān)“藥物作用靶點(diǎn)”的研究在國內(nèi)尚屬冷門。今天，藥物靶點(diǎn)的研究已成為一項(xiàng)產(chǎn)業(yè)?？梢灶A(yù)見，在基因治療時(shí)代，有關(guān)重大疾病的基因治療靶點(diǎn)的研究亦將產(chǎn)生重要意義。針對(duì)有治療意義基因靶點(diǎn)的研究，就是基因藥物的知識(shí)產(chǎn)權(quán)。將自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)握在自己手里，才能徹底扭轉(zhuǎn)我國長期在藥物開發(fā)中處于劣勢(shì)的局面。SLE是一類嚴(yán)重危害人類健康的自身免疫病，且疾病高發(fā)人群往往是年輕女性，目前以糖皮質(zhì)激素為主導(dǎo)的藥物治療方案有效性固然毋庸置疑，但糖皮質(zhì)激素副作用大（發(fā)胖、導(dǎo)致