鹽酸二甲弗林含量及有關(guān)物質(zhì)的HPLC檢測方法學(xué)驗證

1、鹽酸二甲弗林含量及有關(guān)物質(zhì)的HPLC檢測方法學(xué)驗證摘要：目的：對鹽酸二甲弗林含量及有關(guān)物質(zhì)的HPLC檢測方法進行驗證。方法：使用SunfireSB-C18色譜柱4.6×250mm5m，乙腈水：乙二胺為50250.2做為流動相，檢測波長243nm，流速1.0mL·min-1，柱溫25。結(jié)果：此方法專屬性良好；檢測限：2.56ng·mL-1；定量相：11.6ng·mL-1；線性：回歸方程為Y=68850.1X-342.5r=0.99998；精密度：RSD=0.4%；重復(fù)性：0.9%；耐用性：該方法在更換流動相比例、不同柱溫及不同流速的情況下，有關(guān)物質(zhì)量均符合

2、要求。結(jié)果：此方法可以滿足鹽酸二甲弗林含量及有關(guān)物質(zhì)的檢測，可用于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。關(guān)鍵詞：鹽酸二甲弗林；HPLC；方法學(xué)驗證鹽酸二甲弗林為中樞興奮藥【1】，其直接興奮呼吸中樞，具有作用快，維持時間短，療效明顯的優(yōu)點。其興奮作用遠比洛貝林、貝美格強，約比尼可剎米強100倍，促蘇醒率也高。靜脈注射后能迅速興奮呼吸中樞、起效迅速、持續(xù)時間短。在呼吸功能不全患者，可明顯改善血氧飽和度，蘇醒率達90%95%，平安范圍稍寬。鹽酸二甲弗林被收錄進2021版藥典二部中【2】，本文通過大量實驗來驗證反相高效液相色譜檢測鹽酸二甲弗林含量及有關(guān)物質(zhì)的方法。1.儀器與試藥1.1儀器高效液相色譜儀Aglient1260

3、，配置四元梯度泵、G1315D紫外-可見光檢測器、自動進樣器、柱溫箱、WatersEmpower3色譜工作站；Mettler-ToledoXSE105型電子天平、SunfireSB-C18色譜柱4.6×250mm5m、高溫枯燥鼓風(fēng)箱，光照箱BinderKBF-LQC720。1.2試藥鹽酸二甲弗林對照品購于中國食品藥品檢定研究院100687-202101，乙腈為色譜級Tedia公司，無水乙二胺、鹽酸、氫氧化鈉、過氧化氫溶液30%、亞硫酸氫鈉等均為分析純國藥集團，實驗用純化水為自制，鹽酸二甲弗林樣品為上海紫源自制。1.3色譜條件采用Waters公司SunfireSB-C18色譜柱4.6&

4、#215;250mm5m，以乙腈水：乙二胺為50250.2做為流動相，流速1.0mL·min-1，采集時間：含量為15min；有關(guān)物質(zhì)為30min，檢測波長：243nm，柱溫：25，進樣量：20L。2.方法與結(jié)果2.1對照品溶液以及樣品溶液制備精密稱取40mg鹽酸二甲弗林對照品100687-202101置于25mL容量瓶中，用流動相配制成含鹽酸二甲弗林濃度為16g·mL-1溶液，做為含量對照溶液；配制成鹽含酸二甲弗林濃度為1.6g·mL-1的溶液做為有關(guān)物質(zhì)對照溶液。精密稱取40mg鹽酸二甲弗林樣品置于25mL容量瓶中，用流動相配制成含鹽酸二甲弗林16g·

5、;mL-1溶液做含量測定溶液；用流動相配制成含鹽酸二甲弗林160g·mL-1溶液做為有關(guān)物質(zhì)測定溶液。2.2專屬性考察2.2.1強降解溶液制備精密稱取40mg鹽酸二甲弗林Er-171101樣品7份，分別置于25mL容量瓶中，1參加5mL純化水放置24小時做為水降解樣品；2參加5mL0.3%H2O2放置1小時做為氧化樣品；3參加5ml1mol/L亞硫酸氫鈉溶液放置24小時做為復(fù)原樣品；4參加5mL1mol/L鹽酸溶液放置24小時做為算破壞樣品；5參加5mL6mol/L鹽酸溶液放置24小時作為酸破壞樣品，6參加5ml1mol/L氫氧化鈉溶液放置24小時作為堿破壞樣品；7參加5mL6mol

6、/L氫氧化鈉溶液放置24小時做為堿破壞樣品；將樣品在可見光照度大于5000Lux，近紫外光能量大于0.83W/m²，分別放置5天、10天，精密稱取40mg放置5天，10天后的樣品用流動相配制成160g·mL-1以及16g·mL-1溶液做為光降解樣品；將樣品在60鼓風(fēng)枯燥箱中分別放置5天，10天，精密稱取40mg放置5天，10天后的樣品用流動相配制成160g·mL-1以及16g·mL-1做為高溫降解樣品；將樣品在25，濕度75%±5%、90%±5%中分別放置5天，10天，精密稱取40mg在2個濕度下放置5天，10天后的樣品用流

7、動相配制成160g·mL-1以及16g·mL-1溶液做為高濕降解樣品。2.2.2結(jié)果按“2項下色譜條件對強制降解的樣品進行檢測，記錄色譜圖。鹽酸二甲弗林強制降解后有關(guān)物質(zhì)變化見表二、三、四。以上實驗結(jié)果說明，鹽酸二甲弗林在復(fù)原條件下不穩(wěn)定，有較大雜質(zhì)產(chǎn)生。在高溫、高濕、氧化，強酸，強堿條件下較為穩(wěn)定，同時，在各破壞條件下主峰與雜質(zhì)都能被良好地別離，因此，本方法對于鹽酸二甲弗林有關(guān)物質(zhì)具有良好的專屬性。2.3方法學(xué)考察2.3.1檢測限和定量限的測定取“3.1項下的對照溶液用流動相逐級稀釋，按“2項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。計算得檢測下限濃度LOD為2.56ng·

8、;mL-1S/N=4，定量下限濃度LOQ為11.6ng·mL-1S/N=10。2.3.2線性關(guān)系考察取“3.1項下的對照溶液用流動相逐級稀釋，稀釋成濃度為0.01196g·mL-1、0.01598g·mL-1、0.1598g·mL-1、1.278g·mL-1、1.598g·mL-1、1.918g·mL-1、2.397g·mL-1、2.876g·mL-1、12.78g·mL-1、15.98g·mL-1、19.18g·mL-1、79.9g·mL-1、127.9g

9、3;mL-1、159.8g·mL-1、191.8g·mL-1溶液，按“2項下色譜條件進行檢測，以各對照溶液的濃度X，g·mL-1為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得到回歸方程Y=68850.1X-342.5r=0.99998線性關(guān)系良好。2.3.3精密度實驗按“3.1項下含量、有關(guān)物質(zhì)測定溶液配制方法，分別配制1份含量測定溶液、1份有關(guān)物質(zhì)對照溶液。按“2項下色譜條件進行檢測，含量測定溶液、有關(guān)物質(zhì)對照溶液分別連續(xù)進樣6次。記錄色譜圖，以主峰峰面積計算精密度RSD=0.4%n=6，有關(guān)物質(zhì)以對照溶液主峰峰面積計算系統(tǒng)精密度RSD=0.4%n=6。綜合以上結(jié)

10、果說明，此方法具有良好的精密度。2.3.4重復(fù)性實驗按“3.1項下方法，使用同一批號樣品Er-171101分別配制6份含量、有關(guān)物質(zhì)測定溶液。按“2項下色譜條件進行檢測，其中含量測定溶液每份進樣2次；有關(guān)物測定溶液每份分別進樣1次。記錄色譜圖，含量以主峰峰面積計算RSD=0.6%n=12，有關(guān)物質(zhì)測定溶液以總有關(guān)物質(zhì)量計算RSD=0.9%n=6，綜合以上結(jié)果說明，此方法具有良好的重復(fù)性。3方法耐用性考察3.1流動相改變按“2項下色譜條件，配制流動相，除此外再配制2份流動相：將其中乙睛：純化水：乙二胺=50：25：0.2乙二胺±25%。按“3.1項下方法，用3種不同流動相配制3份有關(guān)物

11、質(zhì)對照溶液及測試溶液進行檢測，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算總雜質(zhì)量。結(jié)果見表五。3.2柱溫改變按“2項下色譜條件，以不同柱溫22.5、25.0、27.5對“4.1項下按“乙睛：純化水：乙二胺=50：25：0.2流動相配制的有關(guān)物質(zhì)對照溶液以及測試溶液進行檢測，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算總雜質(zhì)量。計算結(jié)果見表六。3.3流速改變按“2項下色譜條件，以不同流速0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min對“4.1項下按“乙睛：純化水：乙二胺=50：25：0.2流動相配制的有關(guān)物質(zhì)對照溶液以及測試溶液進行檢測，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算總雜質(zhì)量。計算結(jié)果見表七通過對方法中流動相比例的改變、柱溫的

12、改變、流速的改變對同一批鹽酸二甲弗林進行有關(guān)物質(zhì)檢測，總雜質(zhì)量均無明顯變化。此方法耐用性良好。4討論與結(jié)論4.1色譜柱的選擇?中華人民共和國藥典?2021年版中，對鹽酸二建弗林檢測色譜柱的要求為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，于是實驗分別用SunfireSB-C184.6×250mm5m、ZorbaxSB-C184.6×250mm5m、XBridgeSB-C184.6×150mm5m對鹽酸二甲弗林進行有關(guān)物質(zhì)檢測。通過比照SunfireSB-C184.6×250mm5m較其他2種色譜柱能更好地對主峰以及雜質(zhì)峰進行別離。因此選擇此色譜柱為此檢測方法的色譜柱。

13、4.2方法耐用性耐用性是指在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受其影響的承受程度，為所建立的方法用于日常檢驗提供依據(jù)。方法的耐用性試驗是考察檢測方法可靠性非常重要的內(nèi)容【3】。在耐用性試驗中，柱溫上下浮動10%以及流動相中乙二胺比例的調(diào)整對檢測無明顯影響。而流速上下浮動20%，對主峰保存時間有一定影響，因此得出流速變化對方法的穩(wěn)定性有一定影響，在實際含量以及有關(guān)物質(zhì)檢測中，流速要特別注意，防止對檢測數(shù)據(jù)產(chǎn)生影響。4.3小結(jié)通過實驗說明此高效液相色譜法滿足方法學(xué)考察，且此方法專屬性強、精密度好、實驗重復(fù)性良好。分析過程簡便，可用于鹽酸二甲弗林含量檢測及有關(guān)物質(zhì)的的質(zhì)量控制。參考文獻：【1】李桂林，丁維明，李眉.HPLC法測定注射用鹽酸二甲弗林的含量及有關(guān)物質(zhì)J.藥物分析雜質(zhì)，2021，276：834-837.【2】中華人民共和國藥典2021年版.二部S.862.【3】蔣玲玉，黃慧