利用木糖產(chǎn)琥珀酸重組大腸桿菌的構(gòu)建

1、文獻(xiàn)綜述1.1前言近年來，隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的飛速發(fā)展，生物催化技術(shù)不斷成熟，已越來越多 的應(yīng)于工業(yè)合成領(lǐng)域，輔因子代謝工程的研究也逐漸得到研究者們的關(guān)注。但由于生物催化 過程中很多酶（如脫氫酶等），要具有生物活性必須與輔因子結(jié)合，因此輔因子的旮效供給對(duì) 于這類酶催化的生物反應(yīng)過程至關(guān)重要。輔因子代謝工程主要是通過基因工程、代謝調(diào)控等 方法調(diào)控生物反應(yīng)中涉及的輔酶（或輔因子）及其參與的過程，從而影響代謝網(wǎng)絡(luò)11。代謝工程的研宂主要集中在對(duì)某些代謝途徑酶水平的放大、添加或失活的操縱。對(duì)于進(jìn)一 步提高系統(tǒng)的生產(chǎn)效率，輔酶的調(diào)控尤為重要。輔因子通常是作為電子，原子或某些化學(xué)基 因的載體。s前對(duì)

2、于輔酶還沒有徹底系統(tǒng)的研究，但輔酶調(diào)控為代謝工程的研究提供了一種 新的思路。近年來一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)輔酶還原態(tài)與氧化態(tài)的比值常常與生物存在外部環(huán)境的氧化 還原態(tài)勢有極大的關(guān)聯(lián)，所以通過調(diào)節(jié)反應(yīng)環(huán)境的氧化還原態(tài)勢、ph等提高生物氧化還原反 應(yīng)過程中輔酶的有效供給進(jìn)而對(duì)菌體生長和代謝流向進(jìn)行調(diào)節(jié)控制。在微生物活細(xì)胞屮，參與生物氧化反應(yīng)的脫氫酶的輔酶本身不能跨過膜，被局限在其所在 的細(xì)胞空間內(nèi)。它們必須被再生，才能冋用，以維持能量代謝。脫氫酶的輔酶在細(xì)胞的氧化 還原反應(yīng)中接受電子而被還原成還原型輔酶，還原型輔酶把電子釋放給電子受體，從而實(shí)現(xiàn) 脫氫酶的輔酶的再生。輔酶的有效供給是氧化還原酶類生物催化反應(yīng)在工

3、業(yè)化應(yīng)用中的關(guān)鍵，而輔酶的價(jià)格相對(duì) 貴，其穩(wěn)定性較低，從技術(shù)經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)考慮，在生物催化過程屮添加人量的輔酶是不可 取的，而探索幵發(fā)高效、低成本的輔酶系統(tǒng)再生體系是生物催化與生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在工業(yè)化應(yīng)用中的關(guān)鍵技術(shù)。1.2有關(guān)輔酶系統(tǒng)的研宄1.2.1 nadh和nad+在生物體中的重要性在酶的六大類型中，30%35%為氧化還原酶。氧化還原酶催化反應(yīng)在應(yīng)用于手性合成、 制藥、食品添加劑等方面具有明顯的優(yōu)勢，其應(yīng)用越來越受到研究者們重視。而在氧化還原 酶所催化的反應(yīng)中，合成產(chǎn)物的同吋會(huì)消耗一定量的輔酶，約80%的反應(yīng)需要尼克酰胺腺嘌 呤二核苷酸（nad，nadh）作為輔酶，10%的反應(yīng)以尼克酰胺腺嘌呤

4、二核苷酸磷酸（nadp,nadph)為輔酶，只有很少一部分以黃素(fmn，fad)和輔酶q(pqq)為輔酶2。nad+(nicotinamide adenine dinucleotide,煙醜胺腺曝咚二核苷酸)和其還原形式nadh(nicotinamide ade nine dinucleotide hydrogen,煙醜胺腺卩票吟二核苛酸)是生物代謝過程 中一類重要的氧化還原輔酶。nad1的基木生理功能是維持細(xì)胞的生忪、分化和能量的代謝； nad(h)在生物體內(nèi)的糖酵解、擰檬酸循環(huán)和光合作用等過程中，起著電子傳遞的重耍作用 34。nad+和nadh參與的多酶氧化還原體系是生物體細(xì)胞呼吸鏈中電

5、子傳遞過程的主要生 物氧化體系，糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解屮的氧化反應(yīng)絕大部分也都是通過這一體系 完成的。細(xì)胞內(nèi)nadh/nad+的水平與細(xì)胞所處環(huán)境的氧化還原狀態(tài)息息相關(guān)，在許多發(fā)酵 體系中經(jīng)常采用調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的辦法來實(shí)現(xiàn)對(duì)菌體生長和代謝的改變5。1.2.2調(diào)控大腸桿菌中關(guān)鍵酶活的研究nad(h)作為輔酶參與了 300多種氧化還原反應(yīng)，并且參與調(diào)控多種酶活和基因過程， nadh/nad1的水平對(duì)微生物分解代謝兵有重要的影響。細(xì)胞的生長需耍充足的nad+來進(jìn)行氧化，以葡萄糖為碳源進(jìn)行發(fā)酵考察。菌株由于敲除了丙酮酸甲酸裂解酶某因冰和乳酸脫氫酶棊因w/7,使其成為生產(chǎn)琥珀酸的潛力菌株，然而

6、， 兩基因的失活致使nadh不能及時(shí)再生為nad+,引起胞內(nèi)輔酶nad(h)的不平衡，最終導(dǎo) 致厭氧條件下菌株不能利用葡萄糖代謝生長l6j。過量表達(dá)了蘋果酸酶(me)，使丙酮酸生成蘋果酸，進(jìn)一步生成琥珀酸。該反應(yīng)過程中， 不僅有利于緩解丙酮酸的積累，而且能使多余的nadh生成nad+，降低nadh/nad+的比例，恢復(fù)了菌株在厭氧條件下的生長和產(chǎn)酸能力7"8。過量表達(dá)了蘋果酸脫氫酶(mdh)使草酰 乙酸生成蘋果酸，進(jìn)一步生成琥珀酸。該過程也能使更多的nadh生成nad+,緩解輔酶系 統(tǒng)的平衡，恢復(fù)了菌株的生長和產(chǎn)酸能力l9j。goldberg等和wang等曾研究過在大腸桿 菌中過量表

7、達(dá)延胡索酸還原酶(fum),使延胡索酸生成琥珀酸，還伴隨著nadh向nad1的 轉(zhuǎn)化，恢復(fù)了菌株的生長能力，生成更多的琥珀酸。1.2.3改造在nad(h)合成途徑的研宄進(jìn)展采用過量表達(dá)輔酶nad(h)合成途徑中關(guān)鍵酶的方法，改造nad(h)生物合成途徑，調(diào)控 nadh/nad+比例來提高輔酶nad(h)的生成，從而進(jìn)一步提高琥珀酸的產(chǎn)量，已越來越吸引 研宂薺們的眼球。大腸桿菌中nad(h)合成途徑如圖1-1所示。susana112等通過在人腸桿菌屮過景表達(dá)鼠傷寒沙門氏菌typhimurium屮的煙酸 轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶基因(pzwfi)，提高了nad的總量，降低nadh/nad+的比例，從而使其代

8、謝流發(fā)生改變。liang等人13在e.cwnznlll中過量表達(dá)/胤5基因，提高了大大提高了nad+的總 量，nadh與nad+的比例降到0.13,使重組菌株在厭氧條件下具有生長和代謝葡萄糖的能力。 heuser等通過在大腸桿菌中過量表達(dá)煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶基因(p/wfi)和煙酰胺腺嘌呤二核 苷酸合成酶基因(似北)后，均使細(xì)胞中nad(h)的總量增加了兩倍多，通過將這兩個(gè)基因共表 達(dá)后，使胞內(nèi)的nad(h)的總量増加了7倍多。1等151人在大腸桿菌ba002中共表達(dá)煙酸轉(zhuǎn)磷 酸核糖激酶某因川)和丙酮酸羧化酶(p，c), nad(h)的濃度比出發(fā)菌株ba002提高了9.8倍， 并且，nadh/n

9、ad+的比例從0.6降到0.04,從而提高菌株的生長和產(chǎn)酸能力。1.2.4還原性碳源調(diào)控nadh不同還原態(tài)碳源可以的提供代謝還原力也不同，從而進(jìn)一步影響代謝產(chǎn)物的流向分布。 火腸桿菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵，主要是通過調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物的分布比例來維持細(xì)胞代謝的氧化還原平 衡。微生物通過tca循環(huán)途徑合成琥珀酸需要消耗大量的nadh,所以高還原性底物旮利于提高胞內(nèi)nadh/nad1比例，進(jìn)而提高琥珀酸收率。以高還原性碳源甘露醇 和阿拉伯糖醇為發(fā)酵底物時(shí)，actinobacillus sp. 130z生產(chǎn)琥珀酸的收率明顯高于其他碳源(如 葡萄糖，木糖等)16。以過量表達(dá)蘋果酸酶的大腸桿菌nzn111為出發(fā)菌株，分

10、別以葡萄糖酸 鈉、葡萄糖和甘露醇作為碳源，考察菌體對(duì)不同碳源的利用，發(fā)酵結(jié)果相應(yīng)得到琥珀酸收率 分別為40.5%, 83.0%和99.7%ll7j。當(dāng)分別以葡萄碳酸鈉，葡萄糖，山梨醇等不同還原性碳源 為底物時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，重組大腸桿菌nznlll(ptrcml)得到相應(yīng)的琥珀酸收率分別為0.1，0.3, 1.1 g/g181o同時(shí)，本實(shí)臉室li jian191等人發(fā)現(xiàn)高還原性還原性底物山梨醇可以降 mcc/狄胞外氧化還原電位、提高胞內(nèi)nadh/nad+,提高產(chǎn)琥珀酸的收率。這表明，高 還原性底物iii梨醇作為發(fā)酵底物可以提高胞內(nèi)可利用的nadh以及還原性產(chǎn)物收率，有利于代 謝流偏向消耗還原力的反t

11、ca琥珀酸合成途徑。1.3大腸桿菌中有關(guān)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的研宄磷酸烯醇式丙酮酸(pep)占據(jù)著在大腸桿菌代謝過程屮至關(guān)重要的位置，是tca循環(huán)屮的 關(guān)鍵中間體，不僅可以通向丙酮酸途徑，生成乳酸、甲酸、乙醇和乙酸，而且，它是終端產(chǎn) 物琥珀酸合成途徑中一個(gè)羧基化反應(yīng)的底物。在葡萄糖吸收利用過程中，pep作為的公共底 物，許多化合物進(jìn)行的糖異以及芳香族氨基酸生物合成途徑的第一步反應(yīng)底物都離不開它， 所以，在生物細(xì)胞內(nèi)，pep的代謝流分布受到高度調(diào)控20。在大腸桿菌的厭氧發(fā)酵途徑屮，有兩種酶可以催化pep到oaa的反應(yīng)，分別為磷酸烯醇 式丙酮酸羧化酶(ppc)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(pck

12、)。ppc主要在生物合成反應(yīng)中，在 好氧條件下補(bǔ)給oaa的消耗；在厭氧發(fā)酵條件下，ppc具有催化功能，趨使pep生成琥珀酸。 pck主要是在糖異生作用屮催化三磷酸核苻酸的脫羧反應(yīng)和pep到oaa的磷酸化反應(yīng)。對(duì)于這兩種琥珀酸途徑中的關(guān)鍵酶，研究者們發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖為碳源進(jìn)行混合酸發(fā)酵， 在大腸桿菌中過量表達(dá)ppc，琥珀酸的產(chǎn)量有了巨大的提高，并且，在優(yōu)化條件下進(jìn)行誘導(dǎo), 琥珀酸的產(chǎn)量提高了3.5倍。相反，過量表達(dá)pck卻對(duì)發(fā)酵結(jié)果無任何作用f211。然而，在當(dāng)以 ppc缺陷的條件下，過量表達(dá)pck,琥珀酸的產(chǎn)量提高了6倍多22。于麗等23研宄了重組大腸 桿菌jm001（a/）/ptrc99a-p

13、d發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的性能，結(jié)果表明厭氧條件下其耗糖能力和產(chǎn)酸 能力分別為對(duì)照菌株jm001的4.2倍和15.3倍，琥珀酸對(duì)葡萄糖的質(zhì)量收率達(dá)54%, k副產(chǎn)物乙 酸的產(chǎn)量極低。此外，1以011等24在大腸桿菌中過量表達(dá)沖的pdt,結(jié)果表明當(dāng)培養(yǎng)液中 hco3"的濃度低時(shí)，細(xì)胞巾的羧化反應(yīng)由ppc完成，而hco3"濃度高時(shí)，主要由pck完成該反 應(yīng)。綜上說明：與ppc相比，經(jīng)由pck催化pep到oaa的反應(yīng)對(duì)菌株的生長和產(chǎn)酸更為有利。 原因可能是：過量表達(dá)后，pep到oaa的代謝通量增加，pep到丙0同酸的通量相對(duì)減少， 部分解除了丙酮酸積累對(duì)菌株的抑制作用。此外，由pck催化的

14、反應(yīng)伴有atp的生成，因此 菌株可不必通過乙酸生成途徑來合成atp。1.4代謝通量的研宄 1.4.1代謝工程的原理代謝工程，指利用基因工程技術(shù)，定向地對(duì)細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾和改造，以改變微生 物的代謝特性，并與微生物基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，構(gòu)建新的代謝途徑，生 產(chǎn)新的代謝產(chǎn)物的工程技術(shù)領(lǐng)域。代謝工程的實(shí)質(zhì)是定量分析細(xì)胞代謝流量及其控制的基礎(chǔ) 上，提出精確的遺傳修飾方法，并借助分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)代謝過程進(jìn)行合理的調(diào)節(jié)，從而最 大限度地提高目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率25。代謝工程由于是基于基因工程研宂的基礎(chǔ)上的，所以, 目前火多數(shù)仍處於實(shí)驗(yàn)室研究階段。代謝工程的研究對(duì)象主要是代謝途徑，因此離不開

15、對(duì)代謝通路中的一些酶及產(chǎn)物進(jìn)行研 究和分析。物質(zhì)平衡、同位素標(biāo)記、分析障礙突變體等是必不可少的傳統(tǒng)分析手段，而核磁 共振、流氏細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用則為這一領(lǐng)域的發(fā)展增添了新的活力。代謝工程所涉及到的主耍內(nèi) 容包括：（1）生物合成相關(guān)代謝調(diào)節(jié)和條件網(wǎng)絡(luò)理論；（2）代謝流分析、節(jié)點(diǎn)分析；（3）碳源、呼 吸系統(tǒng)、氧化還原重新設(shè)計(jì)；（4）屮心代謝產(chǎn)物作用機(jī)理及相關(guān)代謝分析26。1.4.2代謝通景分析代謝網(wǎng)絡(luò)理論不是孤立的考察細(xì)胞的生化反應(yīng)，而是以網(wǎng)絡(luò)整體進(jìn)行研宂。千千萬萬種 酶催化的系列反應(yīng)系統(tǒng)、膜傳遞系統(tǒng)、信號(hào)傳遞系統(tǒng)構(gòu)成了細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)，它們相互調(diào)節(jié)， 相互制約，從而形成一套統(tǒng)一、完整、靈敏的調(diào)節(jié)機(jī)制。代謝

16、流量分析(metabolic flux analysis, mfa), 乂稱代謝流分析，是在擬穩(wěn)定的假設(shè)下， 計(jì)算矩陣模型中細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)代謝流量的一種定量分析的方法。它假定一定時(shí)間內(nèi)，胞內(nèi) 中間代謝產(chǎn)物的濃度不變，根據(jù)代謝途徑中各反應(yīng)的計(jì)量關(guān)系以及測得的底物、產(chǎn)物的通量 和細(xì)胞組成等，進(jìn)而確定代謝網(wǎng)絡(luò)的通量分配圖。然而，利用mfa方法得到正確的通量分 布，首先要清楚的知道細(xì)胞代謝途徑，特別是各個(gè)分支點(diǎn)，缺少某一重要分支或增加某一根 木不存在的分支都可能對(duì)通量分布有巨大的影響。菌體生理狀態(tài)的變化隨著菌體的生長環(huán)境和基因型的改變而改變，確定各個(gè)代謝支路的代 謝通量的大小以及在生長環(huán)境或基因型改變

17、時(shí)發(fā)生的相應(yīng)變化，對(duì)于細(xì)胞生理學(xué)和代謝工程 來說都有重要的意義。目前琥珀酸發(fā)酵的代謝通量分析的研究，主要是針對(duì)以人腸桿菌為出 發(fā)菌株基因工程菌。大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)包含有600-700個(gè)代謝反應(yīng)，但大多數(shù)例如氨基酸轉(zhuǎn)移 和利用的反應(yīng)對(duì)菌體的生忪不是必需的27。1.4.3代謝通量分析的應(yīng)用在代謝通量分析的基礎(chǔ)上，可以清晰地看出各種途徑相互作用及在代謝分支點(diǎn)的流向， 進(jìn)而判斷細(xì)胞的生長代謝能力。并且，通過比較由遺傳或環(huán)境因素造成地?cái)_動(dòng)來誘導(dǎo)各中間 代謝物流量分配變化，可以確定在整個(gè)代謝過程中具有特殊地位的途徑或反應(yīng)28，并對(duì)某些 特定的途徑進(jìn)行分子操作定向選育或定向誘變，是開發(fā)工業(yè)微生物的一種重要手段2

18、9。目前 代謝通量分析主要用于菌種選育和發(fā)酵調(diào)控這兩個(gè)方面。姜紹通等3()人采用定向選育的方法改善細(xì)胞代謝。在對(duì)菌株生化和分子鑒定的基礎(chǔ)之上， 計(jì)算代謝中流量分布，有效地降低了乙醇93%的流量，將部分h電子供體轉(zhuǎn)向oaa到琥珀 酸的途徑，使得琥珀酸的流量升高34%。此外，黃秀梅等31人對(duì)產(chǎn)琥珀酸的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行代 謝通量的分析。得出外源添加屮間代謝產(chǎn)物pep,使得己糖磷酸途徑(hmp)與糖酵解途徑(emp) 的通量比由39.4 : 60.3提高到了 76.8 : 22.6,充分解決了琥珀酸合成中還原力不足的矛盾，是琥珀酸收率達(dá)76.2%。1.5琥珀酸發(fā)酵最新的研宄1.5.1產(chǎn)琥珀酸基因工程的代謝

19、改造琥珀酸(丁二酸)，一種自然界中常見的天然有機(jī)酸，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、香料、食 品和塑料等行業(yè)。作為優(yōu)秀的c4平臺(tái)化合物，又可用于合成1, 4-丁二醇、四氫呋喃、y-丁內(nèi) 酯等大宗化學(xué)品以及聚琥珀酸丁二醇酯類生物可降解材料，因此美國能源部稱之為未來12種 最有價(jià)值的生物煉制產(chǎn)品之一32。采用生物轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化可再生資源來生產(chǎn)琥珀酸，成 本低，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過程中能固定大量的c02,有效減輕溫室效應(yīng)，近年來 受到了各國科研人員的關(guān)注34。由于dna重組技術(shù)的不斷進(jìn)步促使代謝工程的高速發(fā)展，而以代謝工程的思想改造菌種 己成為一種提高b的產(chǎn)物的有效手段。在眾多的琥珀酸生產(chǎn)菌中，大腸

20、桿菌具有培養(yǎng)條件簡 單、代謝網(wǎng)絡(luò)明確、易改造、易操作等優(yōu)勢，故成為生物法合成琥珀酸的研究熱點(diǎn)35。野生 型大腸桿菌合成琥珀酸的量很少，其得率不超過0.2nx)l/mol葡萄糖361。圖1-2為大腸桿菌混合 酸發(fā)酵的主要代謝途徑。琥珀酸的形成是由葡萄糖經(jīng)emp途徑生成pep后，由ppc或pck催化 并固定c02,生成oaa。oaa又繼續(xù)過渡到蘋果酸和富馬酸，最終形成琥珀酸。在此合成途 徑中，需要固定1 mol的c02,消耗2molnadh,才能生成1 mol琥珀酸l37,38j。近年來，應(yīng)用基因工程手段改造大腸桿菌產(chǎn)琥珀酸有了顯著的成效，綜合國內(nèi)外各種改 造策略，主要包括以下四個(gè)方而：(1) 敲

21、除琥珀酸合成途徑的競爭途徑的關(guān)鍵酶基因。如分別編碼乳酸脫氫酶(ldh)和丙酮酸 甲酸裂解酶(pfl)的w/zx基因和基因的失活，限制乳酸，甲酸和乙酸的形成以及編碼 磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(pts)中一種酶的pavg的自發(fā)突變，可以恢復(fù)菌株利用葡萄糖發(fā)酵的能力，并 且使琥珀酸成為主要的發(fā)酵產(chǎn)物291。(2) 增強(qiáng)關(guān)鍵途徑的酶，強(qiáng)化琥珀酸合成途徑：過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)， 能提高琥珀酸的濃度2.5倍40。過量表達(dá)蘋果酸酶(me)，可以提高菌株耗糖能力，從而促進(jìn)目 的產(chǎn)物的生成。此外，編碼蘋果酸脫氫酶(mdh)的過量表達(dá)，也能在厭氧條件下，提高菌 株代謝葡萄糖的能力，增加琥珀酸生成途徑的代

22、謝流分配41。過量表達(dá)丙酮酸羧化酶(pyc)， 能在丙酮酸鹽的節(jié)點(diǎn)處提高代謝的靈活性，從而降低丙酮酸的積累f421。(3) 激活乙醛酸途徑，調(diào)節(jié)nadh/nad+比值，滿足tca途徑對(duì)nadh的需要。如姜岷43 等人在有氧階段，控制菌體在較低的糖濃度下，從而激活乙醛酸途徑，最終得到琥珀酸的濃 度為101.2 g/l,生產(chǎn)強(qiáng)度為1.89g/(l.h)。(4) 構(gòu)建大腸桿菌琥珀酸有氧牛.產(chǎn)體系，提高細(xì)胞生長率和碳流產(chǎn)出率，從而提高琥珀酸生產(chǎn)強(qiáng)度。1.5.2利用木糖發(fā)酵的研究目前，針對(duì)琥珀酸的發(fā)酵，主要是以的葡萄糖為底物進(jìn)行研究的，但由于琥珀酸巨大的 需求量，必將出現(xiàn)“與人爭糧”的局而。因此，研宂薺

23、們對(duì)琥珀酸碳源的拓展利用進(jìn)行了研 宄。自然界中木糖含量豐富，以木糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸具有較大發(fā)展?jié)摿?。微生物利?木糖發(fā)酵的初始兩步反應(yīng)是在木糖還原酶及木糖醇脫氫酶作用下完成的。木糖首先在木糖還 原酶的催化下，生成木糖醇，然后在木糖醇脫氫酶的作用下生成木酮糖。在大多數(shù)細(xì)菌，如 £. c6?/和等中，木糖通過木糖異構(gòu)酶作用直接轉(zhuǎn)化為木酮糖。然后，木酮糖在木酮糖 激酶的作用k生成5-磷酸木酮糖，進(jìn)入磷酸戊糖途徑。木糖的代謝無需葡萄糖代謝所需要的 磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，它是由atp驅(qū)動(dòng)的高親和透性酶運(yùn)輸?shù)?。木糖發(fā)酵會(huì)保留更多的胞內(nèi)磷酸烯醇式丙酮酸，過多的磷酸烯醇式丙酮酸則進(jìn)入琥珀酸合成途徑44

24、。lin等45人在大腸桿菌中 過量表達(dá)pck,純厭氧條件下利用木糖發(fā)酵，生物量和琥珀酸濃度分別達(dá)2.5和11.63 g/l, 并且在兩階段發(fā)酵結(jié)束后，琥珀酸的的率達(dá)l.lomol/mol。男夕卜，jiang等46人采用artp和 進(jìn)化代謝手段，篩選菌株dc115,在合成培養(yǎng)基利用木糖發(fā)酵，琥珀酸的得率為0.85 mol/mok 木糖的奮效利用也為生物廢棄物木質(zhì)纖維素的利用奠定了基礎(chǔ)。1.5.3利用廢棄生物質(zhì)制備制備琥珀酸當(dāng)前世界能源危機(jī)和環(huán)境污染問題口益嚴(yán)峻，如果能利用微生物發(fā)酵，利用各種廉價(jià)的 廢棄生物質(zhì)生產(chǎn)琥珀酸，對(duì)于資源可持續(xù)和環(huán)境友好型社會(huì)的構(gòu)建具奮重大意義。wan等47以a. suc

25、cinogenes 130z在厭氧條件下利用乳清發(fā)酵，在.乳清初始濃度為50 g/l時(shí)， 琥拍酸得率為0.57g/g。wang等人在idha, pflb，ptsg缺陷的大腸打菌中過量表達(dá)基 因，當(dāng)以玉米芯水解液為碳源發(fā)酵，得到琥珀酸的產(chǎn)量達(dá)36.55 g/l,其得率為0.83 g/g，并 且進(jìn)行兩階段考察，琥珀酸的得率也達(dá)0.87 g/g。以11等49人在人腸桿菌屮表達(dá)來自價(jià) subtilis 168中的基因，提供了細(xì)胞代謝的能量，在以甘蔗渣水解液進(jìn)行發(fā)酵，生成產(chǎn)量 為15.85 g/l，產(chǎn)率為0.89 g/g的琥珀酸。sitha5g等人在大腸桿菌中導(dǎo)入cvco和cvca基因， 利用糖蜜進(jìn)行發(fā)

26、酵72 h后，在搖瓶中生成62 g/l琥珀酸，10 l發(fā)酵罐中生成56 g/l琥珀酸。利用木糖產(chǎn)琥珀酸重組大腸桿菌的構(gòu)建2.1前言人腸桿菌k12在厭氧條件下雖然能夠利用木糖代謝生長，但是琥珀酸不是其主要的代謝 產(chǎn)物，在厭氧發(fā)酵中，一分子的木糖轉(zhuǎn)化為琥珀酸需要消耗2.67個(gè)atp，但是在整個(gè)發(fā)酵過 程一分子木糖只能生成1.67個(gè)atp,可見，重組大腸桿菌無法利用木糖生產(chǎn)琥珀酸的主要原 因是atp的供給不足。由磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(pck)到催化磷酸烯醇式丙酮酸(pep)到 成草酰乙酸(oaa：)的反應(yīng)中，可以產(chǎn)生能量atp。但是，pck只能在磷酸烯醇式丙酮酸羧化 酶(ppc)缺陷的大腸桿菌屮

27、才能提高琥珀酸的產(chǎn)量。因此，通過在ba203(aw/za, pflb，ppc)菌株中過量表達(dá)pck,增加atp供給，滿足菌株生長能量的需要，從而進(jìn)一步促進(jìn)琥珀酸的 生成。煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(naprtase，ec 2.4.2.11),是nadh補(bǔ)給合成途徑中的關(guān)鍵酶，由pncb 某因編碼。該酶以煙酸和磷酸核糖焦磷酸為底物，生成nad的直接前體煙酸單核苷酸(namn)， 并且伴隨著atp的參與。過量表達(dá)naprtase,不僅能提高nad(h)的水平，而且能改變 nadh/nad+的比值，這對(duì)于提高菌株的生長和產(chǎn)酸能力奮著重要的影響。2.3.7重組菌pck和naprtase的酶活測定樣品處理：取i

28、ml菌液，與4°c，12000r/min，離心5 min，用o.lmol/l的tris-hcl(ph 65和 ph 7.5)清洗，離心，再清洗，離心。之后，用1 ml的tris-hcl沖洗懸浮細(xì)胞。然后采取超3 s 停5 s的策略井超聲破碎3 min，于4°c、12 000 r/min,離心15min，取上清即粗酶液，進(jìn)行pck 和naprtase酶活分析?？偟鞍诐舛葴y定參照bradfordft52，以bsa(牛血清白蛋白)為標(biāo)準(zhǔn)。pck酶活檢測見文獻(xiàn)45，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系：0.1 mmol/l tris-hcl (ph 6.5), 10 mmol/l mgcl2(ph 6.5

29、), 5 mmol/l mncl2, 75 mmol/l nahco3, 10 mmol/l adp, 1 mmol/l dtt, 10 mmol/l pep, 20u蘋果酸脫氫酶，0.3 mmol/l nadh。在340nm的吸光值下檢測樣品變化情況， 并根據(jù)測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成底物濃度。pck酶活定義為：1 min內(nèi)催化1 (imol的nadh轉(zhuǎn)化為nad*所需要的酶量為1 u。naprtase酶活檢測見文獻(xiàn)53，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系：45 mmol/l tris-hcl(ph 7.5), 15 mmol/l mgcl2 (ph 7.5), 1.5 mmol/l prpp, 4 mmol/l pe

30、p, 0.2 mmol/l nadh, 4.5 mmol/l atp , 13 u乳酸脫氫酶，13 u丙酮酸激酶，0.15 mmol/l煙酸。在340nm處吸光值下檢測樣品變化,根據(jù)測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成底物濃度。naprtase酶活定義為：1 min內(nèi)催化1 mmol的煙酸轉(zhuǎn)化為煙酸單核苷酸所需要的酶量為1 u。比酶活定義為每毫克蛋白含有的酶活(u/mg)。3.1前言磷酸烯醇式丙酮酸(pep)是驅(qū)動(dòng)琥珀酸合成的重要前體，以木糖為碳源進(jìn)行發(fā)酵可以保存 細(xì)胞內(nèi)pep，來供給琥珀酸生物合成途徑的消耗，從而提高琥珀酸的產(chǎn)量。然而，從木糖到 琥珀酸的轉(zhuǎn)化過程中，由于沒有生成足夠的丙酮酸和乙酸，所以會(huì)導(dǎo)致

31、琥珀酸生成中atp的 不足411。在厭氧條件下，琥珀酸有兩條代謝途徑：tca循環(huán)途徑和乙醛酸支路途徑。在這兩 種途徑中，草酰乙酸(oaa)是生成琥珀酸的重要媒介，由pck或ppc催化，并固定co2。由pck 催化會(huì)產(chǎn)生atp,而ppc只生成焦磷酸鹽，沒有能量的產(chǎn)生55。根據(jù)之前的研究，pck只有在 ppc缺陷的菌株中才能提高琥珀酸的產(chǎn)量。輔酶在大部分的牛.物化學(xué)反應(yīng)中起著重要的作用，并且輔酶操縱手段作為獲取代謝工程 目的產(chǎn)物的輔助工具上，具有潸在的價(jià)值561。在菌株厭氧發(fā)酵的過程巾，輔因子nad*和nadh 作為氧化還原的重要載體。nad+在底物降解過程中作為電子受體，nadh則為產(chǎn)物的形成提

32、 供還原力。nad+的還原和nadh的氧化，這兩者的平衡是微生物發(fā)酵過程屮必不可少的57。 大腸桿菌通過合成途徑和毗啶核苷酸補(bǔ)救途徑中生成nad'從而維持總的nad(h)的量。在 合成途徑中，從天冬氨酸和磷酸二羥丙酮中生成nad在毗啶核苷酸補(bǔ)救途徑中，主要是再 循環(huán)細(xì)胞內(nèi)nad+分解的產(chǎn)物(如煙酰胺單核苷酸)以及在環(huán)境中合成的毗啶類化合物(如煙酰 胺和煙酸)12。過量表達(dá)戸cb:基因，即編碼磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(naprtasc)，是nad(h)補(bǔ)救合成 途經(jīng)屮的限速酶。文獻(xiàn)報(bào)道，naprtase的活性對(duì)于提高nad(h)總量，降低nadh/nad*具 奮重要意義。此外，作為發(fā)酵底物的煙酸(

33、na)，由于價(jià)格相對(duì)便宜，能奮效地被細(xì)胞吸收， 故為木研究采用。3.3.1.1 iptg濃度對(duì)ba209菌株發(fā)酵的影響iptg,即異丙基硫代半乳糖苷，是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，用于外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)， 普遍應(yīng)用于原核表達(dá)系統(tǒng)，使其表達(dá)量增高，產(chǎn)物穩(wěn)定，且不被細(xì)菌代謝。合適的iptg濃度是誘導(dǎo)型基因工程菌發(fā)酵中的一個(gè)關(guān)鍵因素，過低的iptg濃度會(huì)影響 目的蛋白的表達(dá)量和活性，過高的iptg濃度對(duì)于細(xì)胞生長具有毒害作用58。在一定范圍內(nèi)， iptg濃度越高，生物量和琥珀酸的值越高，但是當(dāng)濃度超過1.0mmol/l以后，由于iptg本身具有細(xì)胞毒性，反而不利于菌體生長。所以一般采用iptg的濃度在o.

34、l-lmnwl/l。本實(shí)驗(yàn) 分別選擇濃度為0.1 mmol/l，0.3 mmol/l，0.5 mmol/l, 0.7 mmol/l的iptg進(jìn)行發(fā)酵添加量 的優(yōu)化，同吋分別加入0.7 mmol/l的na。分別有3個(gè)平行樣，考察對(duì)重組菌株ba209的細(xì) 胞生忪、木糖消耗和琥珀酸產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖3-1所示。由圖 3-1 可知，在分別加入濃度為 0.1 mmol/l, 0.3 mmol/l, 0.5 mmol/l, 0.7 mmol/l 的 iptg后，ba209的生物量、耗糖及產(chǎn)酸隨著iptg濃度的增加反而降低，原因可能是因?yàn)檫^ 高濃度的iptg也可能會(huì)誘導(dǎo)外源基因的高表達(dá)，過高的酶活會(huì)加重菌

35、體生長和基礎(chǔ)代謝負(fù) 擔(dān)，從而不利于菌體生長。所以，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果選為iptg濃度為0.1 mmol/l。3.3.1.2 na濃度對(duì)ba209菌株發(fā)酵的影響煙酸(na),是nad(h)補(bǔ)給合成途徑的初始底物，對(duì)于重組菌株的生長，耗糖及產(chǎn)酸有 重要的影響。此外，na作為底物，價(jià)格低廉，并且能奮效地被菌株吸收。本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化iptg 濃度為 0.1 mmol/l 的基礎(chǔ)上，分別選擇濃度為 0.1 mmol/l, 0.3 mmol/l, 0.5 mmol/l, 0.7 mmol/l 1.0 mmol/l, 1.2 mmol/l的na。同樣，分別有3個(gè)平行樣，考察對(duì)重組菌株ba209的細(xì)胞 生長、木糖消耗和

36、琥珀酸產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖3-2所示。由圖3-2可知，隨著na添加量的増加，菌體的生物量、耗糖及琥珀酸產(chǎn)量也增加，可見, na對(duì)于菌株發(fā)酵有重要意義。然而，當(dāng)na濃度超過1.0 mmol/l吋，菌體的生物量、耗糖 及琥珀酸產(chǎn)量開始降低，可能是因?yàn)檫^高na抑制了菌體的代謝。因此，添加終濃度為1.0 mmol/l的煙酸時(shí)，為本優(yōu)化的最佳結(jié)果。3.3.4 ba209在玉米芯水解液發(fā)酵中的應(yīng)用在我國，玉米芯資源儲(chǔ)量相當(dāng)豐富，年產(chǎn)量超過2000萬t，它的主要成分氈含32%36%纖維 素、35%40%半纖維素、25%木質(zhì)素及少量灰分f611。酸解是一種常見的纖維素預(yù)處理方法, 可提高纖維素酶的酶解效率。如

37、果將玉米芯水解液代替葡萄糖作為碳源，用于微生物厭氧發(fā)酵 生產(chǎn)琥珀酸，具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)先用模擬玉米芯水解液的成分考察ba209是否 具有的產(chǎn)酸能力，進(jìn)而使用玉米芯發(fā)酵。根據(jù)玉米水解液中木糖與葡萄糖的比例，配置總糖濃度為32 g/l混合糖，其中，木糖濃度 為30 g/l,葡萄糖濃度為2 g/l。在厭氧發(fā)酵過程中，ba209先消耗葡萄糖，當(dāng)葡萄糖完全消 耗后，開始利用木糖。發(fā)酵72 h后，利用了 15.4 g/l的木糖和2 g/l葡萄糖，琥珀酸的產(chǎn)量為13.6 g/l(圖3-5)，是6人204產(chǎn)酸的1.16倍。說明過量表達(dá)pck,滿足菌株生長屮atp的供給，使足 夠的pep進(jìn)行羧化反應(yīng)

38、，從而提高琥珀酸的產(chǎn)量。同時(shí)，ba209中naprtase的表達(dá)，提高了 木糖的代謝速率。因此，模擬糖的發(fā)酵結(jié)果為進(jìn)行玉米芯的發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。在玉米芯水解液屮，木糖的含量最多。故ba209可能在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化方面具有重要的作用。根據(jù)hplc分析結(jié)果，玉米芯稀酸水解液中木糖占總糖的91%。發(fā)酵24 h后，2.1g/l的葡糖 糖全部耗完，ba209才開始利用木糖。發(fā)酵72 h小時(shí)后，琥珀酸產(chǎn)量達(dá)17.2 g/l,且得率為 0.94 g/go在發(fā)酵過程中只有2.7 g/l的乙酸形成(圖3-6)。由此可見，ba209在生物質(zhì)廢物循 環(huán)利用上有重要的發(fā)展?jié)摿Α?.1前言目前，對(duì)輔因子nadh和nad+的調(diào)控

39、與操作已經(jīng)成為代謝工程的主要工具621。在有氧 的條件下，以氧氣作為氧化劑，nadh的循環(huán)主要是通過氧化呼吸鏈。而在厭氧條件下，即 沒有外源氧化劑時(shí)，nad+的再生主要是通過發(fā)酵，利用還原力nadh對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行還原。 以葡萄糖為碳源發(fā)酵，是以nad+進(jìn)行氧化，產(chǎn)生的還原力以nadh的形式表現(xiàn)出來，細(xì)胞 自身再通過nadh再生為nad"來保持氧化還原平衡63。當(dāng)選擇不同氧化態(tài)碳源發(fā)酵，主要 是通過再生nadh策略來提高細(xì)胞內(nèi)nadh的利用率f641，以及通過增強(qiáng)nad+的補(bǔ)救合成 途徑來提高總的nad+的水平65。因此，在發(fā)酵的過程中，調(diào)節(jié)nadh量對(duì)整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)有 至關(guān)重要的作用。

40、在本研究中，使用不同還原態(tài)碳源來考察細(xì)胞內(nèi)nadh的利用情況。還原性碳源因?yàn)檠?化態(tài)不同，所以提供nadh的能力也不同。相同質(zhì)量的還原性碳源，葡萄糖可以提供2 mol h,山梨醇和tt露醇可以產(chǎn)生3 mol h,而卄油卻可以提供4 mol h。甘油，被廣泛地用 于微生物生產(chǎn)化學(xué)品的原料，它具有其分布廣泛、成本低、還原性高等特點(diǎn)。琥珀酸的合成途徑需要有nadh參與，每生成1 mol琥珀酸需要消耗2 mol nadh,可 見，nadh的及吋供給是提高琥珀酸產(chǎn)量的重要前提。還原性碳源的使用可以增加額外的 nadh來提高細(xì)胞內(nèi)nadh的利用率。本章共表達(dá)了 pncb基因和pd基因，分別采用不同還原性碳源考察對(duì)ba209的生長、 耗糖和產(chǎn)物分布的影響，并進(jìn)行代謝流分析。4.3結(jié)果與討論4.3.1 ba209利用不同碳源的發(fā)酵結(jié)果分別以木糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、甘油為碳源，在血清瓶進(jìn)行72 h純厭氧發(fā)酵。 在通過表達(dá)丫已經(jīng)提供丫足量的nad的基礎(chǔ)上，不同的碳源被用來增加更多的nadh, 還原性碳源的利用也可以增加了琥珀酸的生產(chǎn)。由發(fā)酵結(jié)果可知，碳源的消耗基本用于琥珀 酸的生產(chǎn)，同時(shí)有少量的乙酸和丙酮酸產(chǎn)生，沒有蘋果酸和富馬酸的形成。菌株對(duì)木糖的消 耗和產(chǎn)酸最高，分別為17.05 g/l和16.82 g/l。其次是甘露醇，消耗了 14.87 g/l的木糖，產(chǎn) 生12.56 g/