BRD4和PI3K-AKT雙重抑制劑SF2523抗腎細(xì)胞癌作用及分子機(jī)制研究

1、BRD4和PI3K-AKT雙重抑制劑SF2523抗腎細(xì)胞癌作用及分子機(jī)制研究目的：觀察BRD4和PI3K-AKT雙重抑制劑SF2523在體外和體內(nèi)抗腎細(xì)胞癌(Re nal cell carci no ma,RCC)細(xì)胞的作用，并解析其作用的分子機(jī)制，為RCC勺分 子靶向治療提供有益的探索。方法和內(nèi)容：1.對(duì)人RCC細(xì)胞系(786-0和A489)、 兩系原代人RCC細(xì)胞(RCC-1、RCC-2),分別應(yīng)用CCK-8比色法、Trypan blue 染 色檢測(cè)、細(xì)胞集落試驗(yàn)、BrdU酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)等方法，分別檢測(cè)不同 劑量SF2523處理后48h、72h,各系人RCC細(xì)胞存活及細(xì)胞增

2、殖的情況,與對(duì)照組 比較,分析SF2523對(duì)細(xì)胞存活及細(xì)胞增殖的影響。同時(shí)應(yīng)用CCK-8方法、BrdU酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)觀察SF2523對(duì) HK-2腎小管上皮細(xì)胞株和原代培養(yǎng)的腎上皮細(xì)胞 (Renal Epi)的存活和增殖的影 響。2.對(duì)人RCCffl胞系(786-O和A489)、兩系原代人 RCC細(xì)胞(RCC-1、RCC-2), 分別應(yīng)用TUNE細(xì)胞核染色方法、分光光度法檢測(cè)Caspase-3/9活性、Ann exin V- 碘化丙啶(PI)流式細(xì)胞儀(FACS)法及單鏈-DNA(ssDNA)ELISA法檢測(cè)SF2523處理 后以上人RCCffl胞系凋亡情況，分析SF2523

3、對(duì)RCC細(xì)胞凋亡的作用。3.對(duì)人RCC®胞系786-O和原代人RCC-1的細(xì)胞用SF2523處理后進(jìn)一步培 養(yǎng)細(xì)胞 24h, 用碘化吡啶 (PI)-FACS 方法檢測(cè)細(xì)胞周期進(jìn)程 , 對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析 觀察SF2523對(duì)人RCC®胞周期的影響。4.對(duì)人RCC®胞系786-O細(xì)胞株用1.0 卩M的SF2523處理24小時(shí),應(yīng)用Tran swell法及細(xì)胞軌道示蹤實(shí)驗(yàn)法,分別觀察 細(xì)胞遷移、侵襲能力,與對(duì)照組比較,分析SF2523對(duì)RCC細(xì)胞遷移能力的影響;5. 運(yùn)用免疫印跡(Western Blotting) 方法,觀察786-O細(xì)胞用SF2523處理后,PI3K

4、-AKT-mTOR言號(hào)通路相關(guān)分子 P-P85、P85 P-AKT S473 P-AKT T308AKT1/2、P-S6K1、P-S6等的變化,觀察細(xì)胞內(nèi)BRD4調(diào)控蛋白Bcl-2和Myc的表 達(dá),分析SF2523對(duì)人RCC細(xì)胞PI3K-AKT-mT0Ri BRD4言號(hào)通路的影響。觀察原代培養(yǎng)的腎上皮細(xì)胞(Renal Epi)在SF2523處理后p-p85、p85、p-AKT S473 p-AKT T308、AKT1/2、p-S6K1、p-S6 和 Bcl-2、Myc的表達(dá),觀察 SF2523 對(duì)腎上皮細(xì)胞的影響。比較 SF2523與JQ1(BRD4抑制劑)和 Wortmannin(PI3K抑

5、 制劑)對(duì)人RCC 786-O細(xì)胞的作用。6.建立SCID鼠荷瘤模型，雌性SCID小鼠將786-O RCC細(xì)胞注射到左肋腹部 皮下,建立腫瘤移植瘤模型。將荷瘤的SCID小鼠,隨機(jī)分為3組,分別給予溶劑對(duì) 照或SF2523(15/50 mg/kg體重)，腹腔注射，隔日處理一次,連續(xù)15天，每日觀察 腫瘤生長(zhǎng)情況 , 每 6 日記錄腫瘤體積和小鼠體重。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí) (“Day-36”), 分離和稱量每組的腫瘤。再選取荷瘤的SCID小鼠隨機(jī)分成2組(每組n=3),分別給予溶劑對(duì)照和SF2523(50 mg/kg),腹腔注射， 隔日處理一次。在首次給藥后的第6天分離出兩組各3個(gè)786-O移植瘤(“#1

6、/2/3 ” )。將腫 瘤組織裂解 , 并用 Western Blotting 測(cè)定方法觀察 p-AKT Ser-473 、 Myc、 Bcl-2 表達(dá)情況,分析SF2523在體內(nèi)抗RCC細(xì)胞的作用機(jī)制。結(jié)果:1.SF2523顯著抑制人RC住田胞(786-O和A489)及原代人RCC細(xì)胞 (RCC-1、RCC-2)的存活和增殖。SF2523對(duì)HK-2腎小管上皮細(xì)胞株和原代培養(yǎng)的 腎上皮細(xì)胞 (Renal Epi) 的無(wú)顯著毒性作用。2.SF2523誘導(dǎo)人RCCB胞凋亡。SF2523處理的人RCCB胞明顯增加了 ssDNA 的含量,增加Caspase-3和Caspase-9的活性,還顯著增加了

7、Ann ex in V標(biāo)記及TUNE染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目3.SF2523能導(dǎo)致RC（細(xì)田胞周期阻滯，G2-M周期阻滯。SF2523處理的RC（細(xì)田 胞中G1期百分比顯著降低，相應(yīng)的G2和S期細(xì)胞百分比增加。4.SF2523抑制RCC細(xì)胞遷移。SF2523處理顯著抑制了“遷移”的 786-0細(xì) 胞 （ 在 Transwell 底部 ） 的數(shù)量 , 細(xì)胞軌道示蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示顯著抑制 786-O 細(xì)胞 的侵襲、浸潤(rùn),定量分析10次細(xì)胞軌道示蹤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),SF2523的作用是非 常顯著的。5.SF2523同時(shí)阻斷RC（細(xì)胞內(nèi)PI3K-AKT-mT0并下調(diào)BRD4調(diào)控蛋白Bcl-2 和 Myc的表達(dá)。

8、SF2523顯著抑制 786-O 細(xì)胞中 p-p85、P-AKTS473 P-AKTT308 p-S6K1、p-S6的表達(dá)，而p85,AKT,S6K1,S6的表達(dá)沒(méi)有變化，BRD4調(diào)節(jié)蛋白（Bcl-2 和Myc）的表達(dá)也顯著下調(diào)。SF2523比JQ1（BRD4卬制劑）和 Wortmannin（PI3K抑制劑）更有效的抑制 RCC 細(xì)胞存活,誘導(dǎo)其凋亡。腎上皮細(xì)胞內(nèi)磷酸化的 p-p85,p-AKT1,p-S6 和 p-S6K1 水平和Bcl-2/Myc的表達(dá)非常低,SF2523對(duì)其的抑制作用也不明顯。Bcl-2/Myc表達(dá)下調(diào)作用也沒(méi)有 RCC細(xì)胞顯著。6.SF2523能明顯抑制SCID 小鼠中

9、786-O腫瘤生長(zhǎng),使PI3K-AKT抑制及Bcl-2/Myc表達(dá)下調(diào)。SF2523治療組的腫瘤比載體對(duì)照腫瘤明顯輕得多,SF2523在體內(nèi)抑制786-O 腫瘤生長(zhǎng)表現(xiàn)出劑量依賴性反應(yīng)，50 mg/kg的SF2523在抑制786-O腫瘤生長(zhǎng)方 面明顯優(yōu)于15mg/kg的劑量。SF2523處理的腫瘤中AKT活化（p-AKT Ser-473）和 Myc及Bcl-2表達(dá)顯著降低。結(jié)論:1.SF2523能顯著抑制人RCC細(xì)胞的存活和增殖，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并導(dǎo) 致細(xì)胞周期阻滯，抑制RCC細(xì)胞遷移。SF2523對(duì)人正常腎上皮細(xì)胞無(wú)顯著毒性作2.SF2523具有同時(shí)阻斷 RC（細(xì)田胞內(nèi)PI3K-AKT-mT0并下調(diào)BRD4調(diào)控蛋白Bcl-2和Myc表