DuNLRP3介導(dǎo)的抗APEC先天性免疫應(yīng)答研究

1、DuNLRP介導(dǎo)的抗APEC先天性免疫應(yīng)答研究是引起雞、禽致病性大腸桿菌 (Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)鴨及其他禽類局部或全身性大腸桿菌病的病原 , 是一種重要的腸道外致病菌(Extraintestinal Pathogenic E.col,ExPEC)。APEC是養(yǎng)鴨生產(chǎn)中較為常見的病原菌 , 可感染任何年齡的鴨群 , 引起鴨的發(fā)病率和死亡率較高 ; 剖檢表現(xiàn)為典型 的纖維性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腹膜炎及全眼球炎等。對家禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。 模式識別受體 (pattern recognition receptors,PRRs) 是

2、機體先天性免疫的重要組成部分 ,其能夠識別病原相關(guān)分子 模式(Pathoge n Associated Molecular Pattern,PAMP)和損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMP), 進而激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 , 促進免疫相關(guān)基因的表達并誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答。NOD羊受體(Nucleotide-b inding oligomerizati on doma in-likereceptors,NLRs) 能夠識別細胞質(zhì)中的多種病原成分、組織損傷和細胞應(yīng)激。其 中NLRs中P亞家族的成員NLRP3因為能夠與細胞凋亡相關(guān)斑點樣蛋白和

3、半胱氨 酸天冬氨酸蛋白酶 -1 形成一種細胞質(zhì)復(fù)合物 -炎性小體而被大家所熟知。很多研究已表明，NLRP3對促進炎性因子IL-1 B、L-18和TNF-a的表達,NF- k B信號通路的調(diào)控以及促進細胞凋亡方面具有重要作用。在人和鼠等哺乳動物中,NLRs能夠識別細胞質(zhì)中細菌的多種成分,如：細菌鞭毛、RNA脂多糖、脂磷 壁酸和肽聚糖上的胞壁酰二肽等。但有研究指出,鴨上存在的PRRs與其他物種的有一定差異。因此,為了明確 鴨體內(nèi)是否存在NLRP3受體,以及鴨NLRP3(duNLRP是否參與宿主的抗APEC先 天性免疫應(yīng)答,本研究首次獲取了 duNLRP3CD的全長序列；明確了本實驗所用菌 株APE

4、CO1K1所含的毒力基因、生長曲線及對櫻桃谷肉鴨的致病性 ；檢測了 APEC感染后鴨體內(nèi)外先天性免疫相關(guān)基因的表達情況 ；明確了 duNLRP在APE(感染誘 導(dǎo)的先天性免疫中的作用；此外，我們還明確了 duNLRP3在細胞內(nèi)的亞定位，以及 對NF-k B和DEFs細胞凋亡的誘導(dǎo)作用。具體主要包括以下五部分內(nèi)容:1.DuNLRP3的克隆鑒定及生物信息學(xué)分析在 本研究中,我們以健康鴨脾臟cDNA為模板獲取了 duNLRP3CDs的全長序列。發(fā)現(xiàn) duNLRP3勺全長CDs序列為2805 bp,編碼934個氨基酸(GenBank no.為 MH373356.1)。通過軟件分析我們發(fā)現(xiàn),duNLRP

5、3蛋白是一種無信號肽、無跨膜域、不穩(wěn)定 的親水性蛋白，并含有3個潛在的糖基化位點。通過 SMARTS件進行功能域的分 析表明,duNLRP3蛋白均含有中間的NACH結(jié)構(gòu)域,C端的LRR重復(fù)結(jié)構(gòu)域，以及N 端的PYM構(gòu)域。同源性和進化樹分析表明,duNLRP3蛋白位于Bird分支上，且與Gallus的同 源性較近,與哺乳動物類的同源性較遠。2.APEC對櫻桃谷肉鴨的致病性研究首先， 我們通過多重PCR的方法明確了應(yīng)用于本實驗的 APEG31K1分離株主要含有aatA、 tsh、 fimC、 mat、 ibeB、 vat、 yijp 、 ompA、 neuC、 cva/cvi 、 iss 、 ir

6、oN 、 fyuA 和 irp2 等毒力基因。這些強毒力基因的含有是導(dǎo)致該分離株對鴨具有強致病性的原因。此外 ,該 分離株的生長曲線顯示 :2-6 h 為該菌的對數(shù)生長期、 6-14 h 為穩(wěn)定期、 14 h 之 后為該菌的衰亡期。細菌含量檢測表明,APEC在感染后的第2天即達到了峰值，可以在肝、脾和 腦等多個組織器官中進行快速有效的繁殖。 此外, 在細菌感染后的第 2天, 被感染 鴨即表現(xiàn)出典型的臨床癥狀和組織病理變化這些結(jié)果表明，APEC能夠?qū)е馒喌膰乐馗腥?造成機體廣泛的組織損傷和功 能障礙。3.APEC感染誘導(dǎo)的先天性免疫應(yīng)答為了獲知宿主早期對 APEC勺抗感染 反應(yīng),我們研究了 AP

7、EC感染后肝、脾和腦以及鴨胚成纖維（duck embryo fibroblasts,DEFs） 細胞中先天性免疫相關(guān)基因的表達情況。我們發(fā)現(xiàn)：肝臟中TLR4的mRN表達量在APE（感染后第1天和第3天均表現(xiàn) 為顯著上調(diào)；脾臟中TLR2 4、5和15在APEC感染后的第2天均表現(xiàn)為極顯著的 上調(diào);在大腦中,四種TLRs在細菌感染后的第1天和第2天均表現(xiàn)為極顯著的上 調(diào),而在第3天時上調(diào)倍數(shù)急劇減小或表現(xiàn)為下調(diào)。這一現(xiàn)象表明在APEC感染初 期,TLRs在調(diào)節(jié)宿主的先天性免疫過程中發(fā)揮了重要作用。此外,APEC感染后肝、脾和腦中AvBD2和 16的上調(diào)倍數(shù)較顯著,而AvBD45、7和9卻主要表現(xiàn)為

8、下調(diào)。在 APEC感染后1-3天肝、脾和腦中促炎因子IL-1 B 的mRN表達水平均表現(xiàn)為上調(diào);IL-6作為一種主要的促炎因子,在肝和脾中表現(xiàn) 出顯著的上調(diào)；另一種促炎因子IL-8的mRNA!達量在上述三種組織中均表現(xiàn)出 穩(wěn)定且顯著的上調(diào),尤其是在腦中,APEC感染后的1-3天,IL-8穩(wěn)定上調(diào)12-14 倍; 作為抑炎因子之一 ,IL-10 的表達量在肝、脾和腦中也有不同程度的增加。此外,細菌感染后1-3天肝、脾和腦中MHC-I的mRN表達水平均表現(xiàn)為上調(diào), 然而MHC-II卻表現(xiàn)為極顯著的下調(diào)。這些結(jié)果表明,APEC感染引起了宿主的炎 癥反應(yīng)。體外實驗的結(jié)果與體內(nèi)結(jié)果基本一致,表明APEC

9、感染后能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生大 量的 TLRs（如 TLR2）,AvBDs（如 AvBD2）,ILs（如 IL-6 和 IL-8）以及 MHCs如 MHC-I）,而這些因子的過量表達 （尤其是 IL-6 和 IL-8） 可能會導(dǎo)致機體發(fā)生過度的炎癥反 應(yīng),進而對宿主細胞造成一定的損傷。4.DuNLRP3介導(dǎo)的抗APEC先天性免疫研究 我們研究了 duNLRP3在健康鴨組織中的分布情況，發(fā)現(xiàn)胰腺中的表達量最高,而 在食管及回腸等腸道組織中的表達量較低。這些結(jié)果表明duNLRP3在健康鴨組織中分布廣泛且差異較大。在 APEC感染 后1-3天，肝臟中duNLRP3勻表現(xiàn)為上調(diào)；脾臟中卻均表現(xiàn)為下調(diào)；腦中du

10、NLRP3 僅在APEC感染后第2天和第3天表現(xiàn)出極顯著的上調(diào)。這些結(jié)果表明duNLRP3參與了 APEC感染宿主后誘導(dǎo)的先天性免疫應(yīng)答。通過慢病毒介導(dǎo)的duNLRP過表達和Si-RNA敲弱DEFs細胞中duNLRP3勺表達發(fā)現(xiàn)：過表達duNLRP3能夠顯著的抑制APEC在體內(nèi)和體外的增殖；同時,過表達 duNLRP3后肝、脾和腦中IL-1 B在細菌感染后的第2天和第3天均表達為極顯著 的上調(diào)；IL-18和TNF-a在腦中的上調(diào)倍數(shù)顯著小于肝和脾中的上調(diào)倍數(shù)。同樣的結(jié)果也在NLRP3慢病毒載體感染的DEFs細胞中發(fā)現(xiàn),特別是在APEC 感染后,IL-1 B、IL-18和TNF-a的表達量均表現(xiàn)

11、出顯著的上調(diào)。而當 duNLRP3 被敲弱后,能顯著的降低APEC感染所誘導(dǎo)的DEFs細胞中IL-1 B和IL-18的mRNA 表達水平,但對TNF-a的抑制作用不顯著。這些結(jié)果表明過表達duNLRP3能顯著的誘導(dǎo)APEC感染后宿主細胞中炎性因 子的產(chǎn)生。5.DuNLRP乳導(dǎo)的抗APEC感染信號通路初步研究通過實驗我們發(fā)現(xiàn) duNLRP吐要表達于細胞質(zhì)中，同時在細胞核內(nèi)也有一定的表達。此外，我們通過 pc-duNLRP3分別與 pGL3-NF-K B-luc、pGL3-IFN- B -luc 和 pGL3-IRF-7-luc 的共轉(zhuǎn)染, 并結(jié)合雙熒光素酶報告基因檢測技術(shù) ,研究了 duNLRP3寸NF-k B、IFN- B和IRF-7啟動子的激活作用。我們發(fā)現(xiàn)單純過表達 duNLRP3對NF- k B和IRF-7啟動子活性的上調(diào)作用均不顯著,而IFN- B啟動子 的活性反而表現(xiàn)為輕微的下調(diào)；在APEC或 LPS刺激下,過表達duNLRP3能夠極顯 著的增強NF- k B的活性，但對IFN- B和IRF-7啟動子的激活作用卻不明顯,且 LPS刺激所誘導(dǎo)的啟動子