EWI-2對腫瘤細(xì)胞運(yùn)動性、粘附性以及間葉樣細(xì)胞向阿米巴樣細(xì)胞轉(zhuǎn)換的影響

1、EWI-2 對腫瘤細(xì)胞運(yùn)動性、 粘附性以及間葉樣細(xì)胞向阿米巴樣細(xì)胞轉(zhuǎn)換的影響研究背景EWI-2(又名CD316,lgSF8或者鼠源性PGRL是近年新發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白超家族成員。EWI-2蛋白具有四到六個(gè)細(xì)胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，而且具 備由 10 到 27個(gè)氨基酸組成的胞內(nèi)短的跨膜拖尾結(jié)構(gòu) ,EWI-2 最先是作為 tetraspanin 的結(jié)合蛋白而被發(fā)現(xiàn)的 , 它的這種跨膜結(jié)構(gòu)允許其能夠直接與 tetraspanin 家族成員CD9,CD81相結(jié)合并且發(fā)揮功能性作用。此外,EWI-2胞內(nèi) 段可以與ERMB白直接結(jié)合從而影響tetraspanin與細(xì)胞骨架的連接進(jìn)而影響其 功能。細(xì)胞粘附分子是

2、位于細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)。 它們主要的功能在于與細(xì)胞外基質(zhì) 以及周圍的細(xì)胞相結(jié)合。 這些穿膜蛋白都具有三個(gè)基本的結(jié)構(gòu)域 :(1) 細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域,與其它細(xì)胞粘附分子相結(jié)合 ;(2) 細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域 ,與細(xì)胞骨架相結(jié)合 ;(3) 穿膜 結(jié)構(gòu)域。IgSF 家族作為細(xì)胞粘附分子的一員主要在非鈣離子依賴的情況下發(fā)揮功能 , 這些蛋白是可溶性的并且具有免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。EWI家族作為IgSF的亞家族包括許多新的蛋白例如 EWI-2、EWI-F、PRP/CD9P-1 lgSF3、CD101等。EWI 在具有免疫球蛋白超家族成員共有的高度同源氨基酸序列的基礎(chǔ)上形成了新的 EWI免疫球蛋白亞家族。FPRP/CD

3、9P-作為亞家族的成員也可以與tetraspanin 結(jié)合。然而,亞家族 成員IgSF3和CD101是否也能與tetraspanin 結(jié)合至今尚不明確。據(jù)報(bào)道,EWI-2 還能夠與tetraspanin 家族成員KAI1/CD82(Tspan27)相結(jié)合,而KAI1/CD82(Tspa n27)在腫瘤的遷移抑制方面發(fā)揮著重要作用。因此,EWI-2與CD82的結(jié)合具有抑制腫瘤遷移的作用。盡管EWI-2的生物學(xué) 功能尚不明確 , 但是 EWI-2-tetraspanin 的相互結(jié)合能夠影響 tetraspanin 家族 的功能, 如細(xì)胞粘著、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲以及核聚變等。正因?yàn)?tetraspa

4、nin 家族具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞遷移的決定性作用，所以EWI-2可能是通過直接或者間接 的結(jié)合來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動。如過表達(dá)EWI-2能夠抑制腫瘤細(xì)胞向膠原蛋白和纖維粘連蛋白的遷移；相反的,EWI-2基因沉默可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。然而在高表達(dá)EWI-2的組織內(nèi)，例如前列腺、睪丸、腦和腎臟中 ,EWI-2 表達(dá)在細(xì)胞微突觸部位 , 進(jìn)而影響細(xì)胞的相 互粘附。以往研究表明,熱休克蛋白A8作為EWI-2的配基而表達(dá)在樹突狀細(xì)胞間 連接的位置，U87動物模型中過表達(dá)的EWI-2能夠明顯抑制腫瘤的生長和大小。而且EWI-2在惡性轉(zhuǎn)移的腦腫瘤中表達(dá)量大幅下降甚至消失 ，除此之外 EWI-2本身也與腦腫瘤患者

5、的預(yù)后密切相關(guān)。第一部分EWI-2對腫瘤細(xì)胞表面蛋白表達(dá)及細(xì)胞運(yùn)動性的調(diào)節(jié)研究目的探討EWI-2是否能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面 蛋白的表達(dá) , 分子構(gòu)成以及進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動性。 研究方法本節(jié)實(shí)驗(yàn)利 用兩種細(xì)胞株進(jìn)行研究:PC3人源前列腺癌細(xì)胞株和U87人源膠質(zhì)瘤細(xì)胞株。在PC3細(xì)胞株中利用SiRNA干擾沉默PC3細(xì)胞株中EWI-2的表達(dá)，基因沉默 組命名為PC3-KD同時(shí)設(shè)陰性對照組命名為PC3-NEG在人源性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87 構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)EWI-2的U87-WT與此同時(shí)設(shè)立不表達(dá) EWI-2的對照組U87-MOCK 以及蛋白質(zhì)棕櫚化突變對照組 U87-M3 EWI-2過表達(dá)和基因沉默組都

6、用不同抗 tetraspanin 和抗整合素的一抗孵育 , 然后用偶聯(lián)了熒光素的二抗孵育 , 接連經(jīng) 由流式分析儀分析。流式結(jié)果分析在Flowjo7.6.1 軟件中進(jìn)行,統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析利用SPSS 13.0 軟件:(1)PC3-NEG和PC3-KD兩組數(shù)據(jù)之間各個(gè)抗體免疫熒光染色后流式分析熒 光強(qiáng)度值比較采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)(Independent-Samples t test);(2)U87 三組 數(shù)據(jù)之間各個(gè)抗體免疫熒光染色后流式分析熒光強(qiáng)度值比較采用單因素的方差 分析(One-WayAnova),數(shù)據(jù)間兩兩比較采用LSD方法。腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動性分析包 括 : 傷口愈合實(shí)驗(yàn) , 細(xì)胞遷移以及

7、細(xì)胞侵入實(shí)驗(yàn)組成。 對于腫瘤細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn) , 于六孔板中培養(yǎng)PC3前列腺癌細(xì)胞并用SiRNA進(jìn)行EWI-2基因沉默。細(xì)胞接觸抑制后，經(jīng)由絲裂霉素C處理,然后用200-p槍頭制造傷口。在 16-24個(gè)小時(shí)的愈合過程中 ,傷口愈合情況用倒置顯微鏡觀察并拍照。圖像結(jié)果 分析用 Image J 軟件進(jìn)行。PC3EWI-2 RNAF擾細(xì)胞的腫瘤遷移及侵入實(shí)驗(yàn)都在 traswell小室中進(jìn)行。 腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中Tran swell小室的聚碳酸酯膜預(yù)先用纖維粘連蛋白或者I 型層粘連蛋白包被，然后由加熱失活的BSA封閉。用300u 1 DMEM/BSAt懸6000 個(gè)細(xì)胞加入到transwell的小室中

8、，在37C、5%CO情況下孵育三到六小時(shí)。分組比較:(1)纖維粘連蛋白(Fibronectin) 包被時(shí)PC3-NE(和PC3-KD遷移的 細(xì)胞數(shù)差異;(2) I型層粘連蛋白(Laminin I)包被時(shí)PC3-NEG PC3-KD遷移的 細(xì)胞數(shù)差異 ) 。腫瘤侵入實(shí)驗(yàn)預(yù)先需要在 transwell 上層小室中加入 Metrigel 形成一層薄膠膜 , 然后用完全培養(yǎng)基重懸 105細(xì)胞輕輕加入到膠膜上方。細(xì)胞遷 移實(shí)驗(yàn)需在37C、5%CO條件下過夜培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后遷移或者侵入到聚碳酸酯膜上的細(xì)胞用 Diff-Quick 試劑盒固定 , 染色,細(xì)胞拍照后用ImageJ軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分

9、析利用SPSS13.0軟件,在上述分組條件下,PC3兩組數(shù)據(jù)之間遷移或者侵入到聚碳酸酯膜上的細(xì) 胞個(gè)數(shù)比較采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)(Independent-Samples t test)。實(shí)驗(yàn)結(jié) 果EWI-2基因沉默可以顯著降低PC3細(xì)胞中同源二聚體CD9的表達(dá) (PC3-NEG=1919.67 ± 23.674,n=3;PC3-KD=1349.00 ± 75.408,n=3;P=0.002) 。C9BB%體結(jié)合量/MAB7抗體結(jié)合量比值即二聚體CD9/總CD9的比值伴隨EWI-2的沉默而下調(diào),CD9表達(dá)型傾向于單體型,而且在U87 EWI-2過表達(dá)組中也 觀察到了同樣的趨勢。

10、然而,CD81作為EWI-2的直接偶聯(lián)蛋白卻沒有發(fā)生表達(dá)水 平的變化(P>0.05)。與此同時(shí),EWI-2的下調(diào)可以顯著降低層粘連蛋白受體a6整合素的表達(dá) (PC3-NEG=149±8 22.51666,n=3;PC3-KD=1016± 52.20153,n=3;P=0.001), 但是卻顯著上調(diào)纖維粘連蛋白受體 a 5 的膜表面含量 (PC3-NEG=9.5667 ± 0.74923,n=3;PC3-KD=15.2433 ± 0.09171,n=3;P=0.002)。在后續(xù)的細(xì)胞 -細(xì)胞外間質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)中將繼續(xù)探討其機(jī)制。接著繼續(xù)檢測了U8

11、7-EWI-2過表達(dá)體系對細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的影響。EWI-2過表達(dá)(U87-WT)可以上調(diào)二聚體 CD9的表達(dá)量(U87-MOCK=1164.666± 240.00162,n=3;U87-WT=2704 ±488.42024,n=3;P=0.017), 但是此表達(dá)卻在 M3 突變體中相對 WT 組卻有所降 低(U87-MOCK=1164.666± 240.00162,n=3;U87-M3=1068.6667 ± 183.43603,n=3;P=0.013) 。本實(shí)驗(yàn)中,U87-M3突變體中相對于-WT(U87-WT=14.806±1.33834

12、,n=3;U87-M3=29.19 ± 4.67339,n=3;P=0.034)和-MOCK(U87-MOCK=6.5733 ± 0.56972,n=3;U87-M3=29.19 ± 4.67339,n=3;P=0.004)觀察到了顯著的 CD82上 調(diào)。與基因沉默組相一致的是,CD151的表達(dá)量相對于U87-MOCK在 U87-WT中有 降低的趨勢 (U87-MOCK=3.4633±3 0.14051,n=3;U87-WT=2.12±0.42548,n=3;P=0.044),而 U87-M3 突變體相對于-WT卻有所上調(diào)(U87-WT=2.1

13、2 ± 0.42548,n=3;U87-M3=4.31 ± 0.46608,n=3;P=0.006) 。相反的是 , a 6 整合素的膜表面表達(dá)量伴隨 EWI-2 的過表達(dá)有所降低 (U87-MOCK=3.46± 0.51481,n=3;U87-WT=1.4333 ± 0.23681,n=3;P=0.030)但在 M3突變體中 a 6 整 合素的含量相對于 -MOCK(U87-MOCK=3.±460.51481,n=3;U87-M3=3.5422 ± 0.67097,n=3;P=0.019)和-WT(U87-WT=1.433±

14、; 0.23681,n=3;U87-M3=3.5422 ± 0.67097,n=3;P=0.001)卻有大幅上升，整合素 a 5的表達(dá)在U87-MOC和 U87-WT 中沒有顯著性差異(P>0.05),我們只觀察到了 U87-M3突變體中相對MOCK 升高的 a 5 表達(dá)(U87-MOCK=12.2± 2.75308,n=3;U87-M3=21.2133 ± 2.0.3850,n=3;P=0.045) 。a 2 整合素在 U87-WT組中相對于 MOCK(U87-MOCK=14.65±7 0.92726,n=3;U87-WT=19.8033

15、 ±2.04452,n=3;P=0.036) 和 M3(U87-MOCK=14.656±70.92726,n=3;U87-M3=11.7133 ±0.66519,n=3;P=0.045) 都有所上調(diào)。CD44的表達(dá)量與基因沉默組相符，在各組間無顯著性差異 (P>0.05) 。在腫瘤細(xì)胞移動方面的研究表明 ,EWI-2 基因沉默并不能改變傷口 愈合實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞遷移速度。細(xì)胞遷移到纖維粘連蛋白上的數(shù)量在 PC3基因沉默組有所升高(PC3-NEG=278.3333 ±34.16789,n=3;PC3-KD=546.3333 ±48.759

16、04,n=3;P=0.011), 相反的是我們觀察到細(xì)胞遷移在層粘連蛋白中有下降的趨勢(PC3-NEG=626.6667 ± 32.31271,n=3;PC3-KD=522.6667±8.64741,n=3;P=0.036), 而且此趨勢與細(xì)胞 -細(xì)胞外基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。 侵 襲實(shí)驗(yàn)表明EWI-2基因沉默后，相對比陰性對照組，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力顯著上升(PC3-NEG=18& 46.92902,n=3;PC3-KD=970.6667 ± 87.15785,n=3;P=0.001)。有報(bào)道表明,EWI-2是通過CD82/KAII來調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲性，但是

17、PC3細(xì)胞株中CD82勺表達(dá)量極低,所以我們推測EWI-2在PC3前列腺細(xì)胞中對于腫瘤侵襲的抑制可能來源于其他機(jī)制而非通過 CD82的表達(dá)量的變化，這一點(diǎn)將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn) 中繼續(xù)探討。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 (1)EWI-2 可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面的蛋白表達(dá)水平。 (2) 可以改變 細(xì)胞膜表面CD9的分子構(gòu)成。(3)進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動性。第二部分EWI-2對于腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，微突觸的形成以及細(xì)胞粘附的作 用實(shí)驗(yàn)?zāi)康?腫瘤細(xì)胞遷移受多種因素的調(diào)節(jié) ,如生長因子、趨化因子、基質(zhì)降 解酶以及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)分子等。EWI-2在細(xì)胞間微突觸上有所表達(dá)并且作為 癌癥抑制蛋白存在。本研究中,我們利用EWI-2在U

18、87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的過 表達(dá)和PC3前列腺癌細(xì)胞中的基因沉默來共同探討 EWI-2在細(xì)胞間微突觸形成和 細(xì)胞粘附中所起到的作用。實(shí)驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)利用兩種細(xì)胞株進(jìn)行研究:PC3人源前列腺癌細(xì)胞株和 U87人源膠質(zhì)瘤細(xì)胞株。在PC3細(xì)胞株中利用SiRNA干擾沉默PC3細(xì)胞株中EWI-2 的表達(dá),基因沉默組命名為PC3-KD同時(shí)設(shè)立陰性對照組命名為PC3-NEG在人源 性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)EWI-2的U87-WT與此同時(shí)設(shè)立不表達(dá) EWI-2的對照組U87-MOC以及蛋白質(zhì)棕櫚化突變對照組 U87-M3兩組不同細(xì)胞株都用細(xì)胞粘附相關(guān)抗體染色，如CD9,CD81,CD4等,并經(jīng)由 免疫

19、熒光顯微鏡觀察拍照。在圖像分析方面,應(yīng)用軟件Image J和Carl Zeiss ZEN lite software 分析并統(tǒng)計(jì)了細(xì)胞 -細(xì)胞間拉鏈結(jié)構(gòu)的形成 , 計(jì)算其條數(shù) , 并且進(jìn) 行了細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異的分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析用SPSS 13.0軟件中進(jìn)行 :(1)PC3兩組間拉鏈結(jié)構(gòu)形成的比值差異 (拉鏈結(jié)構(gòu)個(gè)數(shù) /細(xì)胞總數(shù)(%)分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-Samples t test);(2)PC3兩組間單個(gè)細(xì)胞周圍微突觸形成的條數(shù)比較采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)(Independent-Samples t test);(3)PC3兩組間細(xì)胞形態(tài)的差異(偏圓形細(xì)胞數(shù)，偏梭型細(xì)

20、胞數(shù))比較采用X2檢驗(yàn);U87三組 細(xì)胞間微突觸形成的長度差異比較 , 數(shù)量差異比較都采用單因素方差分析 (One way Anova),數(shù)據(jù)間兩兩比較采用LSD方法。細(xì)胞-細(xì)胞間粘附分析我們利用了單個(gè)液滴懸垂細(xì)胞聚集實(shí)驗(yàn)，采用PC3細(xì)胞為研究對象。PC3細(xì)胞在EWI-2基因沉默后，單個(gè)液滴懸液中的細(xì)胞在孵箱中 過夜進(jìn)行聚集。實(shí)驗(yàn)分為兩組：無藥物處理組和丫27632藥物處理組，各組內(nèi)分別 設(shè)立鈣離子存在及鈣離子不存在培養(yǎng)條件 ( 只進(jìn)行組內(nèi)比較 , 即(1) 鈣離子存在時(shí) 無藥物處理?xiàng)l件下PC3-NE兮口 PC3-KD進(jìn)行比;(2)鈣離子不存在時(shí)無藥物處理?xiàng)l 件下PC3-NE審PC3-KD進(jìn)行

21、比較;(3)鈣離子存在時(shí)Y27632藥物處理?xiàng)l件下 PC3-NEGS PC3-KD進(jìn)行比較;(4)鈣離子不存在時(shí)Y27632藥物處理?xiàng)l件下 PC3-NEGS PC3-KD進(jìn)行比較。無藥物處理組和藥物處理組間不進(jìn)行組間比較 ) 。次日,細(xì)胞經(jīng)過機(jī)械力沖擊 后進(jìn)行拍照。在細(xì)胞團(tuán)大小的統(tǒng)計(jì)方面，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行量取和計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn) 結(jié)果以細(xì)胞團(tuán)的大小顯示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)基于三次重復(fù)實(shí)驗(yàn) , 統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行, 上述分組條件下細(xì)胞團(tuán)大小差異比較應(yīng)用兩個(gè)獨(dú)立樣本的 t 檢驗(yàn)(Independent-Samples t test)。繼而進(jìn)一步利用 DU145乍為模型來研究

22、EWI-2基因沉默對B -catenin和E-cadherin定位的影響。DU145細(xì)胞基因沉默組命名 為DU145-KD同時(shí)設(shè)立陰性對照組 DU145-NEGWestern blot 和免疫熒光染色如上所述 , 影像學(xué)信息的采集我們使用 LeicaSP2 MP共聚焦熒光顯微鏡,63x Plan AP0 1.4 NA 油鏡觀察并拍照。影像學(xué)分析采用Image J軟件。統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析用SPSS 13.0軟件進(jìn)行QU145兩組間具有B -catenin胞內(nèi)染色的細(xì)胞比例()差異比較應(yīng)用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn) (Independent-Samples t test) 。對于細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)粘附分析，選

23、用PC3細(xì)胞作為研究對象，分別用纖維粘 連蛋白和I型層粘連蛋白預(yù)先包被 96孔板,各組內(nèi)分別設(shè)立鈣離子存在及鈣離 子不存在培養(yǎng)條件 (分組情況:(1) 鈣離子存在,纖維粘連蛋白 (Fibronectin) 包被 時(shí)PC3-NE審PC3-KD粘附的細(xì)胞數(shù)差異；(2)鈣離子不存在，纖維粘連蛋白 (Fibronectin) 包被時(shí)PC3-NE審PC3-KD粘附的細(xì)胞數(shù)差異;(3)鈣離子存在，I 型層粘連蛋白(Laminin I)包被時(shí)PC3-NE創(chuàng)PC3-KD粘附的細(xì)胞數(shù)差異;(4)鈣離 子不存在，I型層粘連蛋白(Laminin I )包被時(shí)PC3-NEG口 PC3-KD占附的細(xì)胞數(shù) 差異)。EWI

24、-2基因沉默后將細(xì)胞懸液加入到預(yù)包被的孔中進(jìn)行一小時(shí)的粘附，隨后輕輕用DME清洗96孔板三次以去掉未貼壁的細(xì)胞。貼壁細(xì)胞用Diff-Quick試劑盒染色并拍照計(jì)數(shù)。Image J 軟件中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行。實(shí) 驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)基于三次重復(fù)試驗(yàn) , 上述分組條件下各組粘附的細(xì)胞數(shù)差異比較應(yīng) 用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)(Independent-Samples t test)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果PC3細(xì)胞中EWI-2基因沉默可以使細(xì)胞從偏圓形形態(tài)轉(zhuǎn)變成長梭形形態(tài)。PC3-NEGATIV組中細(xì)胞微突觸的形成更加平滑、規(guī)則，但是EWI-2基因沉默組中的微突觸則非常容易斷裂。統(tǒng)計(jì)結(jié)果

25、基于三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),PC3-KD組中細(xì)胞間微突觸的形成大幅降低 (PC3-NEG=117.2±7.23080,n=10;PC3-KD=52± 5.43446,n=10;P=0.000),PC3-KD 組中長梭形細(xì)胞的比例占 82.9%, 與 PC3-NEG組形成梭形細(xì)胞所占 17.2%相比,數(shù)量顯著增加 (PC3-NEG=82.8%,n=233;PC3-KD=17.1%,n=175;N=3;P=0.000),而且 PC3-KD組細(xì) 胞間拉鏈結(jié)構(gòu)的形成比例(10%)相對比于PC3-NEG&(52.5%)也有顯著性降低(PC3-NEG=52.5%,n=284;PC3-KD

26、=10.0%,n=230;P=0.000。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明 EWI-2可以改變細(xì)胞表面微突觸的長度和數(shù)量并進(jìn)而影響細(xì)胞間連接的形成。繼而發(fā)現(xiàn),無論用何種抗體對U87組細(xì)胞進(jìn)行染色，U87-M3突變體細(xì)胞與 -MOCK!相比總會有更多的細(xì)胞表面微突觸形成(多重比較P<O.05)。U87-WT 組中從統(tǒng)計(jì)圖來看雖然相對 MOC組有數(shù)量增多的趨勢，卻沒有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)的 顯著性差異(P>0.05)。然后量取分析了微突觸的長度,發(fā)現(xiàn)U87-WTB在 CD9 染色時(shí)相對比 -MOCK(U87-MOCK=7.326±7 0.58015,U87-WT=10.3061 &#

27、177; 0.77284;P=0.002)和-M3(U87-WT=10.3061 ± 0.77284,U87-M3=8.0238±0.60308;P=0.024)顯示出較長的微突觸形成，但是在CD81染色時(shí)，-M3與-WT之間 的顯著性差異消失 (U87-WT=15.7525 ± 8.97587,U87-M3=13.2460 ±6.82862;P>0.05), 但是-MOCI與-WT組之間仍然具有顯著性差異即-WT組有更 長的微突觸形成 (U87-MOCK=9.0660± 0.80704,U87-WT=15.7525 ±

28、 8.97587;P=0.013) 。在接下來的鬼丙環(huán)肽染色分析中 , 我們觀察到 , 無論在長度還是數(shù)量 上，-MOCK組顯示出最短以及最少的微突觸形成,而-M3組具有最長和最多的微突 觸形成(多重比較P<O.05)。細(xì)胞-細(xì)胞間粘附實(shí)驗(yàn)也說明EWI-2可以功能性 影響細(xì)胞粘附并且進(jìn)而影響細(xì)胞的運(yùn)動性。無藥物處理組實(shí)驗(yàn)表明 , 經(jīng)過外力沖 擊后,鈣離子依賴組和非鈣離子依賴組在 EWI-2基因沉默后細(xì)胞團(tuán)大小相對于陰 性對照組都有顯著降低(鈣離子依賴組：PC3-NEG=115.2859 ±7.37516,n=25;PC3-KD=89.7471 ±5.85023

29、,n=23;P=0.003; 非鈣離子依賴 組:PC3-NEG=133.410吐 8.42085,n=27;PC3-KD=86.8984 ± 3.33575,n=23),而且 還觀察到EWI-2基因沉默后該組細(xì)胞有更多的單個(gè)細(xì)胞存在。繼而用Y27632處理細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在藥物處理后，鈣離子依賴組的細(xì)胞 團(tuán)大小在陰性對照組和基因沉默組中的差異消失(PC3-NEG=136.3948±7.01654,n=15;PC3-KD=126.0439±11.71461,n=15,P>0.05), 而細(xì)胞團(tuán)大小的 差異在非鈣離子依賴組中依然存在 (PC3-NEG=

30、157.9326 ±9.427704,n=16;PC3-KD=116.6084 ± 7.96081,n=15,P=0.002)。DU145細(xì)胞在 EWI-2基因沉默后，Western blot結(jié)果顯示B -batenin表達(dá)量顯著上調(diào)。隨后利 用B -batenin和E-cadherin抗體進(jìn)行熒光染色，結(jié)果顯示DU145-KD&的細(xì)胞骨 架有更多結(jié)節(jié)形成，而且B -batenin有大量的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)染色。然后將具有細(xì)胞質(zhì)內(nèi) B -batenin 染色的兩組細(xì)胞都進(jìn)行了計(jì)數(shù) , 統(tǒng)計(jì)結(jié)果 顯示DU145-KD組的B -batenin胞內(nèi)染色細(xì)胞數(shù)目比例要高于陰性對照組

31、(DU145-NEG=0.11412± 0.023446,n=6;DU145-KD=0.29950 ± 0.038099,n=6;P=0.002) 。與此同時(shí) E-cadherin 的細(xì)胞間連接染色也顯著降低。 細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)表明,PC3-KD組相對于陰性對照組有更多的細(xì)胞粘附 在預(yù)先結(jié)合了纖維粘連蛋白的 96 孔板上 (PC3-NEG=253.4444± 54.91815,n=9;PC3-KD=446.8889±52.32390,n=9;P=0.021), 但 PC3-KD 組在預(yù) 先結(jié)合了層粘連蛋白的 96孔板中相對于陰性對照組卻有較少的細(xì)

32、胞粘附 (PC3-NEG=71±2 123.08913,n=6;PC3-KD=315.16679±38.82990,n=6;P=0.012) 。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 (2)EWI-2 對于腫瘤細(xì)胞運(yùn)動性的調(diào)節(jié)至少部分歸因于細(xì)胞微突 觸的形成及細(xì)胞形態(tài)的變化。(2)EWI-2作為IgSF超家族成員可以調(diào)節(jié)Ca2+依賴 條件下以及非Ca24依賴條件下細(xì)胞-細(xì)胞間的粘附。R0C抑制劑并不能影響非Ca2+依賴條件下細(xì)胞-細(xì)胞間的粘附而且EWI-2對細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)粘附的調(diào)節(jié)受ECMFP整合素的影響。第三部分EWI-2對間充質(zhì)細(xì)胞向阿米巴樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)變的影響研究目的探討EWI-2是否 能夠調(diào)節(jié)間

33、充質(zhì)細(xì)胞向阿米巴樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。研究方法TEM實(shí)驗(yàn)選用PC3細(xì)胞 為研究對象,在PC3細(xì)胞株中利用siRNA干擾沉默PC3細(xì)胞株中EWI-2的表達(dá), 基因沉默組命名為PC3-KD同時(shí)設(shè)陰性對照組命名為PC3-NEG在 EWI-2基因沉默 后用透射電鏡分析。貼壁細(xì)胞經(jīng)EDTA/PB消化后用DME全培養(yǎng)基在冰上重懸以使微突觸重新形 成。四個(gè)小時(shí)懸浮培養(yǎng)后 , 細(xì)胞用甲次砷酸鹽緩沖液清洗兩次除掉血清 , 然后用 2.5%戊二醛/砷酸鹽緩沖液固定 , 細(xì)胞染色后用透射電鏡觀察并拍照。 細(xì)胞表面泡 狀結(jié)構(gòu)以及微突觸的形成用Image J軟件分析,統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析用SPSS 13.0軟 件進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)

34、基于三次重復(fù)試驗(yàn)，PC3-NEG和PC3-KD兩組細(xì)胞中有細(xì)胞表 面微結(jié)構(gòu)的形成 （具有微突觸形成的細(xì)胞個(gè)數(shù)及具有細(xì)胞表面小泡形成的細(xì)胞個(gè) 數(shù)）差異應(yīng)用X2檢驗(yàn)。Western blot用來分析PC3及 DU145兩種細(xì)胞在MAT過 程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)情況。EWI-2過表達(dá)和基因沉默兩組細(xì)胞都用 RIPA細(xì)胞裂解液 裂解,SDS-PAGE（12%蛋白膠分離蛋白條帶并電轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。蛋白膜用不同一抗孵育 , 分別為:抗 ERK、P-ERK,、PAN-ER、KVIMENTIN、FAK、 PY319-FAK EGFR P-EGFR tyrasinateda -tubulin 、MEK1 MEK2。隨后進(jìn)行HRL抗孵育及化學(xué)顯色。DU145前列腺癌細(xì)胞EWI-2基因沉默后進(jìn)行三維立 體培養(yǎng) , 培養(yǎng)基質(zhì)分為膠原蛋白和 Metrigel 兩種。隨后進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 , 并利用倒置顯微鏡觀察及拍照以及后續(xù)用 ImageJ 圖像處理軟件分析。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察后 , 固定細(xì)胞 , 進(jìn)行鬼丙環(huán)肽免疫熒光染色 染色后三維培養(yǎng)基質(zhì)及細(xì)胞混合物用防止熒光淬滅封片劑封片保存。 影像學(xué)信息 的采集使用 Leica SP2 MP 共聚焦熒光顯微鏡 ,63x