SD大鼠主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞自發(fā)鈣化模型的建立及阿托伐他汀和氨氯地平的影響

1、SD大鼠主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞自發(fā)鈣化模型的建立及阿托伐他汀和 氨氯地平的影響 鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病是一個(gè)慢性進(jìn)展性疾病 , 包括早期的主動(dòng)脈瓣硬化 (aortic sclerosis, ASc)和晚期的鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄 (calcific aortic valve stenosis, CAS)。在歐、美等發(fā)達(dá)國(guó)家,CAS己成為成人最常見(jiàn)的心臟瓣膜??； 且患者一旦出現(xiàn)臨床癥狀，預(yù)后較差。隨著研究的深入,對(duì)CAS的認(rèn)識(shí)逐漸從“與 年齡相關(guān)的退行性過(guò)程”過(guò)渡到認(rèn)為其是“主動(dòng)調(diào)節(jié)的慢性炎癥過(guò)程” 。臨床來(lái)源的的主動(dòng)脈瓣標(biāo)本數(shù)量有限 , 且鈣化較嚴(yán)重；用豬、兔等建立的動(dòng) 物模型 , 耗時(shí)較長(zhǎng)且較繁瑣 , 故

2、建立有效的體外疾病模型顯得尤為重要。 主動(dòng)脈瓣 間質(zhì)細(xì)胞(aortic valve interstitial cells,AVICs)在CAS發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前用于CAS研究的AVICs多來(lái)源于豬，但由于缺乏相應(yīng)一抗，使研究受限。在有關(guān)CAS的體外研究中，多通過(guò)不同種類或濃度的鈣化誘導(dǎo)劑或刺激因子 誘導(dǎo)AVICs鈣化，這使得試驗(yàn)間結(jié)論的可比性較差。SD大鼠是一種常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物，具有體積小、易飼養(yǎng)、易購(gòu)買等優(yōu)點(diǎn)。目前以SD大鼠為研究對(duì)象對(duì)CAS進(jìn)行 的研究較少,可能與大鼠主動(dòng)脈瓣較小 ,不易分離培養(yǎng)有關(guān)。本研究欲分離培養(yǎng)SD大鼠AVICs,并觀察其在未給予鈣化誘導(dǎo)劑或刺激因子 的情況下

3、,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)是否自發(fā)形成鈣化灶；并檢測(cè)鈣化過(guò)程中鈣化相 關(guān)因子的表達(dá)情況 ,同時(shí)觀察阿托伐他汀及氨氯地平對(duì)自發(fā)鈣化的影響。第一部 分SD大鼠主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)目的：建立快速有效的SD大鼠AVICs體外 培養(yǎng)方法。方法：通過(guò)組織塊法分離培養(yǎng) SD大鼠AVICs,觀察細(xì)胞原代及傳代后 生長(zhǎng)特性；并通過(guò)IF染色方法檢測(cè)a-SMA及vimentin表達(dá)情況；通過(guò)SEM和TEM對(duì)細(xì)胞表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。結(jié)果：1原代培養(yǎng) 2-3 天后, 部分組織塊周邊有細(xì)胞爬出 ,呈梭形、三角形或不規(guī)則形；原代培養(yǎng)78天后,細(xì)胞可達(dá)到7080%融合,進(jìn)行傳代。2AVICS經(jīng)IF檢測(cè)陽(yáng)性，即SD大鼠AVI

4、Cs表達(dá)a-SMA及 vimentin 。3經(jīng)SEM僉測(cè)可見(jiàn),細(xì)胞 貼壁良好 , 多邊形 , 體積較大 , 細(xì)胞膜較薄且充分伸展。4經(jīng)TEM檢測(cè)可見(jiàn)，細(xì)胞體積較大，不規(guī)則形，可見(jiàn)絨毛；胞內(nèi)細(xì)胞器豐富，可 見(jiàn)大量擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的肌絲；細(xì)胞核不規(guī)則 , 可見(jiàn)核仁。 結(jié)論：1通過(guò)組織塊法對(duì)SD大鼠AVICs進(jìn)行培養(yǎng),方法簡(jiǎn)單快速。2經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)、 細(xì)胞免疫學(xué)鑒定,SD大鼠AVICs為肌成纖維細(xì)胞。第二部分SD大鼠主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞自發(fā)鈣化模型的建立目的：觀察體外分 離培養(yǎng)的SD大鼠AVICs是否可以自發(fā)形成鈣化灶。方法：通過(guò)組織塊法分離培 養(yǎng)SD大鼠AVICs,對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的AVIC

5、s進(jìn)行Von Kossa及茜素紅染色、細(xì)胞 內(nèi)及其間質(zhì)鈣離子檢測(cè) , '評(píng)價(jià)其是否可以自發(fā)形成鈣化灶。 結(jié)果： 1 培養(yǎng)至 4 6天時(shí),AVICs逐漸聚集成團(tuán),稱為“細(xì)胞灶”，此時(shí)細(xì)胞灶較小,散在分布；隨著 培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng) , 細(xì)胞灶體積逐漸增加 , 中心區(qū)亮度增加。2VonKossa染色顯示,6天時(shí)細(xì)胞灶染色陽(yáng)性，即細(xì)胞灶處有鈣鹽沉積；并且 12天時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞灶個(gè)數(shù)及強(qiáng)度均大于 6天組。 3茜素紅染色顯示 ,6 天時(shí)細(xì)胞灶 染色陽(yáng)性 ,即細(xì)胞灶處有鈣鹽沉積； 并且 12天時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞灶個(gè)數(shù)及強(qiáng)度均大于 6 天級(jí)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示 , 茜素紅含量組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (F106.167,P&am

6、p;lt;0.001),0 天及 6天組茜素紅含量較低 ,12 天組茜素紅含量較高 , 即隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加鈣 鹽沉積增加。4 細(xì)胞及間質(zhì)鈣含量經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示 , 鈣離子含量組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (F116.379,P<0.001),0 天及6天組鈣離子含量較低 ,12 天組鈣離子含量較高 ,即隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加鈣鹽沉積增加。 結(jié)論：通過(guò)延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間能夠誘導(dǎo)其 自發(fā)形成鈣化灶。第三部分SD大鼠主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞自發(fā)鈣化模型的機(jī)制研究目的：檢測(cè) AVICs 在自發(fā)鈣化過(guò)程中某些成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況。方法：通過(guò)組織塊法分離培養(yǎng) SD大鼠AVICs,用RT-PCF和western-bl

7、ot 方法，檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞的 ALP活性、成骨相關(guān)因子(a-SMA、Cbfal、Osteocalcin、ALP BMP-2 BMP-4) mRN股蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：1ALP活性檢測(cè)結(jié)果表明,0天、6天、12天組ALP活性有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=139.396,P<0.001),12天組ALP活性最低,0天組ALP活性較高,6天組ALP活性最高，即隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，ALP活性從0天開(kāi)始逐漸升高，至第6天達(dá)峰，之后逐漸下降。 2Cbfal mRN、AOsteocalcin mRN、ABMP-4mRN、 ALPmRN、ABMP-2mRN、A a -SMA mRNA RT-PC檢測(cè)

8、結(jié)果 2.1Cbfal mRNA、Osteocalcin mRNA、BMP-4mRNA RT-PCF結(jié)果表明,0 天、6 天、12 天組 Cbfal mRNAOsteocalcin mRNABMP-4mRNA 表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (F=410.106, x 2=7.200,F=38.463,P<0.005),0 天組 最低,6 天組較高,12 天組最高, 即隨著培養(yǎng)時(shí)間的增力 (?)Cbfal mRNA、Osteocalcin mRNA、BMP-4mRN表達(dá)水平逐漸增高。2.2ALP mRNART-PCR結(jié)果表明,0天、6天、12天組ALP mRN表達(dá)水平有統(tǒng) 計(jì)學(xué)差異 (x

9、2=7.200,P=0.027),0 天最低,12 天較高,6 天最高, 即隨著培養(yǎng)時(shí)間 的增加,ALP mRNA勺表達(dá)水平先增加后下降。2.3BMP-2mRNA RT-PC吉果表明,0 天、6天、12天組BMP-2mRN表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=56.565,P<0.001),0 天組較低,6天組和12天組較高，即隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，BMP-2mRN的表達(dá)水平 逐漸增加。2.4a-SMA mRNA RT-PC結(jié)果表明,0天、6天、12天組a-SMA mRNA表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (F=89.886,P<0.001),12 天最低,6 天較高,0 天最高隨著培養(yǎng)時(shí)間

10、的增加a-SMA mRN的表達(dá)水平逐漸下降。3ALP BMP-2BMP-4western-blot 結(jié)果 3.1ALP western-blot 結(jié)果表明 ,0 天、6 天、12 天組ALP蛋白表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x 2=7.261,P=0.027),0天組最低,12天組較 高,6天組最高，即隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，ALP蛋白表達(dá)先增高后降低。3.2BMP-2、 BMP-4western-blot結(jié)果表明,0天、6天、12天組BMP-2 BMP-4蛋白表達(dá)水平 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (x2=7.200,F=452.482,P<0,05),0 天組最低,6 天組較高,12 天 組最高,即隨著

11、培養(yǎng)時(shí)間的增加BMP-2 BMP-4蛋白表達(dá)逐漸增高。結(jié)論：AVICs向成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化可能是自發(fā)鈣化模型形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。 第四部分阿托伐他汀和氨氯地平對(duì) SD大鼠主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞自發(fā)鈣化的影響目 的：觀察阿托伐他汀和氨氯地平對(duì) SD大鼠AVICs自發(fā)鈣化的影響。方法：采用 組織塊法分離培養(yǎng)SD大鼠AVICs,檢測(cè)不同濃度的阿托伐他汀和氨氯對(duì)平對(duì) AVICs自發(fā)鈣化程度及ALP活性的變化情況。結(jié)果： 1 通過(guò)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間 , 各組均形成直徑大小不同的鈣化灶。 2Ato 和 Aml 對(duì)AVICs自發(fā)鈣化程度的影響2.1在控制了組別因素的情況下,時(shí)間因素在不同 水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：0天和6天較低,

12、12天較高(F=116.379,P<0.001),髓著培養(yǎng)時(shí)間的增加各組Ca2+含量均逐漸增高。2.2在控制了時(shí)間因素的情況下,組別 間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,10-6mol/L Aml組比10-6mol/L Ato 組鈣含量高，兩組間有統(tǒng)計(jì) 學(xué)差異 (F=3.655,P=0.023), 其他組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 , 即在相同的培養(yǎng)時(shí)間情況 下，除 10-6mol/L Aml 組和 10-6mol Ato 組 Ca2+含量有差別外(10-6mol/L Aml 組Ca2+含量高于10-6mol/L Ato組)，其余各組均無(wú)差別。3Ato和Aml對(duì)ALP的影響3.1在控制了組別因素的情況下，時(shí)間因素在不同水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：12天最低,0天較高,6天最高(F=139.396,P<0.001),即 隨著培養(yǎng)時(shí)