流式細(xì)胞影像系統(tǒng)（FlowCAM）在海洋微型浮游生物群落結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用發(fā)展

1、    流式細(xì)胞影像系統(tǒng)（flowcam）在海洋微型浮游生物群落結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用發(fā)展    韓留玉 陳綿潤(rùn)【摘 要】微型浮游生物是海洋生態(tài)系統(tǒng)中最基本的組成部分。近年來，海洋微型浮游生物群落在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的地位和作用越來越得到人們的關(guān)注，這與微型浮游生物觀測(cè)技術(shù)的發(fā)展以及它們?cè)诤Ｑ笊鷳B(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用有著密切的關(guān)系。流式細(xì)胞影像系統(tǒng)（flow cam）是近年來發(fā)展起來的浮游生物生態(tài)學(xué)研究方法，通過結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)和顯微鏡技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)浮游生物的自動(dòng)分類，提高微型浮游生物樣品的分析效率?！娟P(guān)鍵詞】微型浮游生物;flow cam;自動(dòng)分類1海洋微型浮游生物的研究

2、進(jìn)程近年來，由于海洋顯微觀測(cè)技術(shù)的發(fā)展，使得生物學(xué)家能夠觀察到越來越小的海洋微型浮游生物，進(jìn)而對(duì)它們的分類、生理生態(tài)學(xué)、種群增長(zhǎng)率、營(yíng)養(yǎng)行為以及在微食物環(huán)中的作用研究越來越多。目前國(guó)際上通常所說的海洋微型浮游生物包括微型真核自養(yǎng)生物、微型真核異養(yǎng)生物、微型原核自養(yǎng)生物和微型原核異養(yǎng)生物等單細(xì)胞生物以及浮游病毒等多個(gè)類群。近年來的研究表明，海洋微型浮游生物在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的作用尤其是生產(chǎn)力中的作用越來越重要，在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的生物地球化學(xué)循環(huán)和能量代謝中發(fā)揮著越來越重要的作用。定量檢測(cè)微型浮游生物的種群動(dòng)態(tài)變化，不僅有利于研究其種間營(yíng)養(yǎng)關(guān)系，更有助于探索其在海洋生態(tài)系統(tǒng)中所起的重要作用。傳統(tǒng)顯微

3、計(jì)數(shù)方法雖然可以通過形態(tài)特征觀察不同類型的微生物來分別計(jì)數(shù)，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，人為誤差較大。流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（flow cam）的應(yīng)用，使得這些問題迎刃而解。2海洋微型浮游生物觀測(cè)技術(shù)的發(fā)展（1）顯微鏡計(jì)數(shù)法顯微鏡法是最傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。通常用網(wǎng)具采集樣品并用固定劑固定后帶回實(shí)驗(yàn)室，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。其優(yōu)點(diǎn)是計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確，可以從物種水平對(duì)形態(tài)多樣性和不規(guī)則的浮游生物進(jìn)行鑒定。但耗時(shí)耗力，對(duì)操作人員的專業(yè)知識(shí)及能力要求比較嚴(yán)格，計(jì)數(shù)結(jié)果的人工主觀性誤差比較大。（2）浮游生物光學(xué)計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法浮游生物光學(xué)計(jì)數(shù)器（opc）簡(jiǎn)便快捷、計(jì)數(shù)效率高，并且能通過遮擋相同數(shù)量光線的球的直徑來表示顆粒物的大小，因而得到

4、廣泛使用。浮游生物激光計(jì)數(shù)器（lopc）在opc的基礎(chǔ)上進(jìn)行了技術(shù)上的改進(jìn)，將最小粒徑擴(kuò)展到100m，在海洋生態(tài)系統(tǒng)研究中應(yīng)用比較廣泛。（3）流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法流式細(xì)胞儀的出現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了快速、大批量的分析，但不能得到浮游生物直觀圖像。對(duì)于粒徑小于50m和大于100m的顆粒難于操作，且數(shù)據(jù)重復(fù)性低，難以用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。（4）圖像拍攝技術(shù)分析法最早的流體成像系統(tǒng)是利用感光膠片和計(jì)算機(jī)等控制圖像和閃存來實(shí)現(xiàn)的。隨著計(jì)算機(jī)和圖像獲取技術(shù)的發(fā)展，系統(tǒng)逐漸向包含圖像、分析和顆粒技術(shù)的方向發(fā)展。浮游生物視頻記錄器（vpr）的出現(xiàn)使海洋顆粒物的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)成為可能。（5）流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（flow cam）分析法流式細(xì)胞

5、攝像系統(tǒng)（flow cam）綜合了顯微鏡技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)。實(shí)現(xiàn)了浮游生物的快速檢測(cè)與自動(dòng)分類，減少了人工操作，解決了大規(guī)模尺度研究下數(shù)據(jù)獲得相對(duì)滯后的問題。在快速檢測(cè)的同時(shí)得到浮游生物的直觀形態(tài)學(xué)圖像，測(cè)定顆粒粒徑范圍擴(kuò)展到了3-3000m。既能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行樣品分析，又可以在野外進(jìn)行連續(xù)24小時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，分析樣品的數(shù)量和速度得到提升。3流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（flow cam）的工作原理和流程流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（flow cam）包括主機(jī)和計(jì)算機(jī)工作平臺(tái)兩部分，由三個(gè)子系統(tǒng)構(gòu)成：流控系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)和電學(xué)系統(tǒng)。流控系統(tǒng)是蠕動(dòng)抽水泵將待分析的樣品導(dǎo)入流通池，通過調(diào)節(jié)蠕動(dòng)抽水泵的速度調(diào)節(jié)樣品經(jīng)過流通池

6、的速度，流通池根據(jù)浮游顆粒物的大小分為不同的規(guī)格，用以得到顆粒物的清晰圖像。光學(xué)系統(tǒng)包括閃頻led光源、熒光探測(cè)器和其他一些光學(xué)部件。電學(xué)系統(tǒng)主要是控制整個(gè)設(shè)備的運(yùn)轉(zhuǎn)、獲取圖像信號(hào)以及數(shù)據(jù)處理等。flow cam的基本工作流程包括：（1）物鏡及對(duì)應(yīng)流通池的安裝;（2）掃描樣品，獲得圖像及相應(yīng)的顆粒物信息;（3）建立浮游生物圖像數(shù)據(jù)庫;（4）利用visual spreadsheet軟件對(duì)已經(jīng)分析的樣品進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別和分類，獲得不同浮游生物類群的豐度。4流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（flow cam）在微型浮游生物分類鑒定工作中的應(yīng)用流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（flow cam）是近年來發(fā)展起來的一種先進(jìn)的檢測(cè)儀器，主要

7、用于快速檢測(cè)海洋、湖泊、河流等各種水體中的有機(jī)和無機(jī)懸浮體。flow cam在國(guó)外海洋研究中的應(yīng)用較多，在我國(guó)只有個(gè)別學(xué)者利用flow cam檢測(cè)海洋浮游植物物種并建立圖譜庫。目前我國(guó)運(yùn)用流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)建立圖譜庫，來對(duì)海洋微型以及超微型浮游生物群落多樣性的研究以及它們?cè)诤Ｑ笊鷳B(tài)系統(tǒng)中的研究鮮有報(bào)道。入?？诤徒：呈俏覈?guó)赤潮的高發(fā)區(qū)，而且是重要的漁業(yè)生產(chǎn)基地，微型浮游生物種群的變動(dòng)間接影響著漁業(yè)資源的興衰和分布，部分赤潮種的爆發(fā)將會(huì)對(duì)漁業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生不可估量的危害，微型浮游生物種群多樣性的變化可以指示海域環(huán)境的改變情況，對(duì)入?？诤徒：澈Ｓ蛭⑿透∮紊镏饕惾航⒍鄥?shù)圖譜庫，不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)沿

8、海海域的微型浮游生物實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控，從而通過種群的變動(dòng)判斷被檢測(cè)海域環(huán)境的變化，而且對(duì)于漁業(yè)養(yǎng)殖海域赤潮種的快速檢測(cè)與預(yù)警，以及近海漁業(yè)資源的分布具有一定的指導(dǎo)意義。5流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（flow cam）應(yīng)用于海洋微型浮游生物分類工作中的局限性和展望流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（flow cam）在國(guó)外已經(jīng)獲得廣泛應(yīng)用，但在技術(shù)上仍存在一些不足，目前應(yīng)用于海洋浮游生物鑒定和分類工作方面仍存在很大的瓶頸。首先系統(tǒng)對(duì)參數(shù)的設(shè)計(jì)還不夠全面，尤其是多細(xì)胞不規(guī)則形態(tài)的類群，不能有效的展現(xiàn)所有類群細(xì)胞生物的形態(tài)特征，如何將多細(xì)胞群體分割成單一細(xì)胞，直接給出單個(gè)細(xì)胞的相關(guān)參數(shù)是需要解決的問題。其次，自動(dòng)分類仍然需要人工操

9、作的輔助，目前只達(dá)到了半自動(dòng)分類，后續(xù)的鑒別工作還需要人工去完成，對(duì)時(shí)間的節(jié)約不是那么的顯著。再次，對(duì)細(xì)胞生理方面的特征信息的獲取還有待開發(fā)。相信隨著圖像分析技術(shù)的不斷完善，流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（flow cam）在技術(shù)方面會(huì)不斷的優(yōu)化和完善，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的研究也會(huì)越來越廣泛。參考文獻(xiàn)：1陳敏藝，袁潔，陳月琴，屈良鵠.（2005）. 海洋超微型浮游植物遺傳多樣性的分子系統(tǒng)學(xué)研究進(jìn)展. 自然科學(xué)進(jìn)展，9，1032-1041.2陳紀(jì)新，黃邦欽，李少菁.（2006）. 海洋微型浮游植物分子生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2，32-39.3劉昕，張俊彬，黃良民。流式細(xì)胞儀在海洋生物學(xué)研究中的應(yīng)用j。海洋科學(xué)，2007，31（1）：92-96.基金項(xiàng)目：國(guó)家海洋局南海分局海洋科學(xué)技術(shù)局長(zhǎng)基金資助項(xiàng)目（1602）。（作者單位：1.國(guó)家海洋局?？诤Ｑ蟓h(huán)境監(jiān)測(cè)中心站;2.國(guó)家海洋局南海規(guī)劃與環(huán)境研究院）科學(xué)導(dǎo)報(bào)&