干擾素α5AZACdR對(duì)白血病細(xì)胞HL60和K562的作用

1、干擾素、5-AZA-CdR對(duì)白血病細(xì)胞HL-60和K562的作用 作者：黃云燕， 夏 焱， 郭海霞， 李文益【關(guān)鍵詞】 白血病，髓樣； 干擾素刺激基因； 5-雜氮脫氧胞嘧啶核苷； 甲基化； Xaf1 凋亡（apoptosis）是受基因調(diào)控的細(xì)胞固有的主動(dòng)消亡過(guò)程，在維持組織穩(wěn)態(tài)中起著極其重要的作用，細(xì)胞凋亡受阻是導(dǎo)致腫瘤發(fā)病和耐藥的主要病理學(xué)基礎(chǔ)之一。凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis，IAPs）家族是目前已知的唯一的內(nèi)源性凋亡執(zhí)行者-天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（cysteine aspartate-specific protease，Caspase）的抑制物，其中

2、XIAP（X-chromosome-linked inhibitors of apoptosis）的作用最強(qiáng)有力1。最近從酵母雙雜交系統(tǒng)中獲得了一種XIAP負(fù)調(diào)節(jié)蛋白-Xaf1（XIAP-associated factor 1），能直接結(jié)合XIAP而阻斷后者抗Caspase的活性2。IAPs在白血病等多種惡性腫瘤中過(guò)度表達(dá)3，4，相反，Xaf1廣泛表達(dá)于所有的正常組織中，但在NCI 60種腫瘤細(xì)胞株中表達(dá)很低或不能檢測(cè)到5。Xaf1降低不能拮抗XIAP抗凋亡的活性，細(xì)胞存活幾率增加可能導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生6，通過(guò)增加X(jué)IAP內(nèi)源性拮抗劑Xaf1的表達(dá)是一個(gè)新的癌癥治療靶點(diǎn)?；蚬こ炭梢栽黾幽[瘤細(xì)胞

3、Xaf1表達(dá)并誘導(dǎo)其凋亡7，但是由于其靶向性差、轉(zhuǎn)染率低、導(dǎo)致基因突變等具體技術(shù)問(wèn)題尚未解決，限制了臨床應(yīng)用。應(yīng)用化療藥物干擾素（interferon，INF）和5-雜氮脫氧胞嘧啶核苷（5-aza-2-deoxycytidine，5-AZA-CdR）8，9誘導(dǎo)其表達(dá)并促進(jìn)凋亡可能更切實(shí)際。它們是否能在白血病細(xì)胞中誘導(dǎo)Xaf1表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)單獨(dú)和聯(lián)合INF和5-AZA-CdR作用于髓系白血病細(xì)胞株HL-60和K562，探討其作用機(jī)制。 1 材料與方法 1.1 細(xì)胞株和主要試劑 HL-60和K562細(xì)胞株分別來(lái)自中山大學(xué)腫瘤防治中心和中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。200 mL/L胎牛血清（FCS

4、）購(gòu)自杭州四季青公司，DMEM低糖型細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司。TRIzol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司，ReverTra DashTM RT-PCR Kit和Taq酶購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司鑒定和合成。Bcl-2、Bcl-xl和Bax抗體購(gòu)自美國(guó)Southern Biotech公司和Labvision公司。JC-1購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Annexin V-FITC/kit細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Caltag Laboratoyies公司。IFN購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。5-AZA-CdR購(gòu)自美國(guó)Merck公司。 1.2 細(xì)胞培

5、養(yǎng) 髓性白血病細(xì)胞株HL-60和K562常規(guī)懸浮培養(yǎng)于含10%熱滅活（56 ，30 min）FBS的DMEM低糖型細(xì)胞培養(yǎng)液（pH 7.27.4），置于37 、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每23 d傳代1次。 1.3 藥物處理 每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、IFN組、不同濃度5-AZA-CdR組以及IFN和5-AZA-CdR聯(lián)合作用組（共6組），終濃度分別設(shè)置為IFN 1 000 U/mL、5-AZA-CdR 1 mol/L和5 mol/L。經(jīng)上述藥物處理48 h后，離心收集細(xì)胞備用。 1.4 RT-PCR檢測(cè) TRIzol提取細(xì)胞總RNA，在10 g/L瓊脂糖

6、凝膠電泳下見(jiàn)3條清晰的條帶（28 S、18 S、5 S），并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)260 nm和280 nm的吸光度值，計(jì)算總RNA的濃度和純度。根據(jù)ReverTra DashTM RT-PCR Kit提示20 L逆轉(zhuǎn)錄體系含總RNA 2 L、隨機(jī)引物1 L、RNase Free H2O 9 L、5× RT Buffer 4 L、dNTP Mixture 2 L、RNase Inhibitor 1 L、ReverTra Ace 1 L，42 20 min，99 5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，獲得cDNA保存于-20 。取10 L cDNA、系列特異性上、下游引物各0.5 L和KOD Dash

7、 1 L等50 L反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件94 30 s、60 30 s、72 1 min，35次循環(huán)后72 10 min延長(zhǎng)。產(chǎn)物經(jīng)SYBR GREEN I染色后10 g/L瓊脂糖凝膠電泳（80 V、40 min），紫外燈下照相，并用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，以相關(guān)基因與內(nèi)參照G3PDH的比值代表其mRNA水平。Xaf1上游引物5TCC GGA ATT CAT GCT CCA CGA GTC CTA CTG 3；下游引物5ACG CGT CGA CAA ACT CTG AGT CTG GAC AAC 3，PCR產(chǎn)物為260 bp。XIAP上游引物5GAA GAC CCT TGG G

8、AA CAG CA 3；下游引物5CGC CTT AGC TGC TCT TCA GT 3，PCR產(chǎn)物為380 bp。內(nèi)參照G3PDH上游引物5ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3；下游引物5TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3，PCR產(chǎn)物為450 bp。 1.5 流式細(xì)胞檢測(cè) 1.5.1 Bcl-2家族成員 收集1×106/mL細(xì)胞用PBS洗滌2次后重懸為50 L，加入100 L FIX&PERM試劑A液，室溫放置15 min，PBS洗滌1次，再加入100 L FIX&PERM試劑B液,分別加入10 L相應(yīng)抗體

9、搖勻，4 避光放置20 min，PBS洗滌2次，0.5 mL PBS重懸，細(xì)胞儀檢測(cè)。 1.5.2 線粒體膜電位 收集（12）×106/mL細(xì)胞用1 mL 37 培養(yǎng)液重懸，加入5 L 1 mg/mL JC-1充分混勻，37 、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，離心去除上清并用PBS洗滌兩次，重懸后取少量細(xì)胞懸液涂片在熒光顯微鏡下觀察，其余送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 1.5.3 細(xì)胞凋亡 收集1 × 106/mL細(xì)胞用PBS洗滌2次，用稀釋的結(jié)合緩沖液重懸為(25)×105/mL，195 L細(xì)胞懸液加入5 L Annexin V-FITC混勻，室溫孵育10

10、 min，PBS洗滌1次，再用190 L結(jié)合緩沖液重懸，加入10 L PI，細(xì)胞儀檢測(cè)。 1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以（±）表示,采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用q檢驗(yàn)（Newman-Keuls法），檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。 2 結(jié) 果 2.1 Xaf1、XIAP mRNA的表達(dá) 單獨(dú)用INF和5-AZA-CdR處理白血病細(xì)胞HL-60和K562 48 h可見(jiàn)Xaf1 mRNA表達(dá)增加，且與5-AZA-CdR呈劑量依賴性，三者中5-AZA-CdR（5 mol/L）作用最明顯。聯(lián)合應(yīng)用INF和5-AZA-CdR，X

11、af1 mRNA的表達(dá)亦增加，但與相同劑量的5-AZA-CdR比較無(wú)顯著性差異（P >0.05）。單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用INF和不同劑量的5-AZA-CdR，HL-60和K562細(xì)胞XIAP mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化。 2.2 Bcl-2家族成員的改變 INF不影響HL-60細(xì)胞Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)，而使Bax的表達(dá)增加。而5-AZA-CdR使Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)降低，并具有劑量依賴性；同時(shí)也降低Bax的表達(dá)。二者聯(lián)合可使HL-60的Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)更低，Bax的表達(dá)亦降低，但與相同劑量的5-AZA-CdR比較無(wú)顯著性差異（表1）。 K562細(xì)胞Bcl-

12、2表達(dá)很低，而B(niǎo)cl-xl高表達(dá)。INF或不同劑量的5-AZA-CdR不改變Bcl-xl的表達(dá)，卻明顯提高Bax的表達(dá)，三者中以INF的作用最明顯；二者無(wú)協(xié)同作用（表2）。 2.3 跨膜電位的影響 INF和5-AZA-CdR可使HL-60和K562細(xì)胞線粒體膜電位降低，胞漿內(nèi)的綠色熒光增加，二者并無(wú)協(xié)同作用（圖1）。 2.4 細(xì)胞凋亡的影響 INF和不同劑量的5-AZA-CdR均能使HL-60和K562細(xì)胞凋亡，并隨著5-AZA-CdR劑量增加，腫瘤細(xì)胞凋亡增多；INF和5-AZA-CdR對(duì)HL-60和K562細(xì)胞都具有協(xié)同作用（表1、2）。 3 討 論 凋亡異常與腫瘤等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)

13、，由于凋亡抑制蛋白的減少或缺失，和/或親凋亡蛋白過(guò)度表達(dá)，細(xì)胞凋亡受阻則導(dǎo)致了惡性腫瘤的發(fā)生。Xaf1和XIAP是一對(duì)相互作用的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中普遍存在Xaf1低表達(dá)或/和XIAP高表達(dá)的失調(diào)，逆轉(zhuǎn)Xaf1/XIAP的異常狀態(tài)可以作為血液系統(tǒng)腫瘤治療的策略。Fong等5在K562細(xì)胞中基本上檢測(cè)不到Xaf1 mRNA，而XIAP mRNA高表達(dá)；相較在HL-60細(xì)胞中存在Xaf1 mRNA表達(dá)，略低于XIAP mRNA表達(dá)。我們希望在這兩種Xaf1和XIAP表達(dá)狀態(tài)不同的白血病細(xì)胞株中，是否都可以通過(guò)改變Xaf1/XIAP的比例而達(dá)到凋亡誘導(dǎo)的目的？ Xaf1作為新發(fā)現(xiàn)的干擾

14、素刺激基因（IFN-stimulated genes,ISGs）8可以上調(diào)Xaf1 mRNA的表達(dá)，并致敏人類黑素瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL/Apo2L誘導(dǎo)的凋亡10，11，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)INF可以誘導(dǎo)HL-60和K562 Xaf1表達(dá)。在胃腸道腫瘤細(xì)胞中Xaf1低表達(dá)或表達(dá)缺失可能與基因甲基化有關(guān)9。目前已應(yīng)用于臨床試驗(yàn)的5-AZA-CdR（5-aza-2-deoxycytidine）是特異的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，不參與RNA和DNA的合成，通過(guò)與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶形成共價(jià)鍵而使后者失活，恢復(fù)DNA的低甲基化狀態(tài)，有利于基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中不同劑量的5-AZA-CdR也可使HL-60和K56

15、2細(xì)胞的Xaf1 mRNA表達(dá)增加，且Xaf1表達(dá)與5-AZA-CdR呈劑量依賴性；5-AZA-CdR的作用優(yōu)于INF，二者不具有協(xié)同作用。單用或聯(lián)合INF和5-AZA-CdR都不改變它們XIAP mRNA的表達(dá)。推測(cè)INF和5-AZA-CdR可以通過(guò)增加X(jué)af1的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)Xaf1/XIAP的比例，拮抗XIAP抗Caspase的作用而誘導(dǎo)這兩種白血病細(xì)胞凋亡。 細(xì)胞凋亡中線粒體有著舉足輕重的作用，其跨膜電位（m）下降致細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）釋放，Caspase-9活化細(xì)胞死亡。Bcl-2家族成員主要是通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)外膜的通透能

16、力或穩(wěn)定屏障功能而實(shí)現(xiàn)其凋亡調(diào)節(jié)的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)INF對(duì)HL-60和K562 Bcl-2家族的調(diào)節(jié)作用相同，不影響B(tài)cl-2和Bcl-xl而增加Bax的表達(dá)。5-AZA-CdR對(duì)HL-60和K562的作用機(jī)制卻是不同的，前者的Bcl-2、Bcl-xl、Bax表達(dá)都降低，Bcl-2和Bcl-xl的下降更明顯；后者的Bcl-2和Bcl-xl不受影響而B(niǎo)ax增加。它們最終均改變了抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl和親凋亡蛋白Bax的比例，使線粒體膜電位降低，細(xì)胞凋亡增加。 JC-1（5,5,6,6-tetrachloro-1,1,3,3-tetrethyl benzimidalyl carbocy

17、anine iodide）是一種熒光染料，它能滲透到細(xì)胞內(nèi)與線粒體特異性結(jié)合。在正常的細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位高，JC-1聚集于線粒體中形成多聚體呈紅色熒光，此時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm；在凋亡細(xì)胞中線粒體膜電位降低，JC-1不能聚集在線粒體內(nèi)，而以單體形式存在于胞漿中呈綠色熒光，此時(shí)的激發(fā)波長(zhǎng)是488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)是527 nm。JC-1與若丹明123（Rhodamin123）比較能更好地反映線粒體膜電位的變化12。本實(shí)驗(yàn)顯示INF和5-AZA-CdR作用于HL-60和K562細(xì)胞后呈綠色熒光的細(xì)胞增多，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光增加，紅色熒光減弱。 INF和5-AZA-Cd

18、R對(duì)HL-60和K562 Xaf1 mRNA的表達(dá)、Bcl-2家族成員的調(diào)節(jié)以及線粒體膜電位的降低都沒(méi)有協(xié)同作用，卻能協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡，說(shuō)明還存在其它作用位點(diǎn)，這有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 HOLCIK M, KORNELUK R G. XIAP, the guardian angelJ. Nat Rev Mol Cell Bio,2001,2(7):550-556.LISTON P, FONG W G, N. KELLY L, et al. Identification of XAF1 as an antagonist of XIAP anti-Caspase activityJ. Nat

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