食品安全學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、食品安全學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)寧喜斌2007年4月5前言隨著生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)食品安全問題越來越重視。社會(huì)對(duì)食品安全的專 門人才數(shù)量和質(zhì)量都在增加，在此背景下國(guó)內(nèi)許多高校都成立了食品質(zhì)量與安全 專業(yè)。食品安全學(xué)作為該專業(yè)的一們核心課程，不但要求學(xué)生掌握?qǐng)?jiān)實(shí)的食 品安全理論知識(shí)，也要求學(xué)生具備扎實(shí)的實(shí)踐技能，因此，我們組織了相關(guān)人員 編寫這本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，供同學(xué)們參考。本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)由寧喜斌，叢健，張慧，竇勇，王璐華完成。鑒于水平有限，以及時(shí)間較緊，書屮的錯(cuò)誤不可避免，希望使用者能夠給予批評(píng) 指正，以便我們能夠及時(shí)進(jìn)行修正。2007年4月5目錄實(shí)驗(yàn)一 食品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)三

2、 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（elisa）實(shí)驗(yàn)四pcr技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌實(shí)驗(yàn)五3m大腸桿菌和大腸菌群快速檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)六對(duì)硫磷在蘋果中殘留的分析方法實(shí)驗(yàn)七食品中藥殘的快速檢測(cè)5實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一食品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)口的學(xué)習(xí)食品中金黃色葡萄球菌的基木檢驗(yàn)方法。二、基本原理葡萄球菌在自然界分布極廣，空氣、土壤、水、飼料、食品（剩飯、糕點(diǎn)、牛奶、 肉品等）以及人和動(dòng)物的體表粘膜等處均有存在，大部分是不致病，也有一-些致 病的球菌。金黃色葡萄球菌是葡萄球菌屬一個(gè)種。可引起皮膚組織炎癥，還能產(chǎn) 生腸毒素。如果在食品屮大量生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生毒素，人誤食了含冇毒素的食品， 就會(huì)發(fā)生食物中毒，故食品中存在金黃色葡萄球

3、菌對(duì)人的健康是一種潛在危險(xiǎn)， 檢查食品屮金黃色葡萄球菌及數(shù)量具有實(shí)際意義。金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝固酶，使血漿凝固，多數(shù)致病菌株能產(chǎn)生溶血毒索, 使血瓊脂平板菌落周圍出現(xiàn)溶血環(huán)，在試管中出現(xiàn)溶血反應(yīng)。這些是鑒定致病性 金黃色葡萄球菌的重要指標(biāo)。三、設(shè)備和材料實(shí)驗(yàn)器材：顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱（37°c）、冰箱、移液管（iml、5ml、10ml）、 試管（15x 150mm）、錐形瓶（250ml、100ml）、培養(yǎng)皿、l型涂布棒、酒精 燈、接種環(huán)、試管架、試管簍、滅菌鍋、小試管（3x50mm）實(shí)驗(yàn)材料：污染牛奶等。四、培養(yǎng)基和試劑胰酪陳大豆肉湯、血瓊脂平板、baird-prker瓊脂平板、營(yíng)養(yǎng)

4、肉湯、0.85%滅菌 生理鹽水、兔血漿、革蘭氏染色劑五、操作步驟1. 檢樣處理：吸取25ml液體樣品，加入225ml滅菌生理鹽水，置均質(zhì)器中制成混懸液。2. 增菌培養(yǎng)1）增菌及分離培養(yǎng)：吸取5ml±述混懸液，接種于朕酪月東人豆肉湯50ml培養(yǎng)基內(nèi)，置36±1°c溫箱 培養(yǎng)24h,轉(zhuǎn)種血平板和baird-parker平板，36±1°c培養(yǎng)24h,挑取金黃色葡萄 球菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。2）形態(tài)觀察：木菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，排列是葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，致病性葡萄球菌菌 體較小，直徑約為0.5lpm。在肉湯中呈混濁生長(zhǎng)，在胰酪陳

5、大豆肉湯內(nèi)有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈混濁 生長(zhǎng)，血平板上菌落呈金黃色，也有時(shí)為白色，大而突起、圓形、不透明、表而 光滑，周圍有溶血圈。在baird-parker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、直徑 為23mm,顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一 透明圈。用接種針接觸菌落似冇奶油樹膠的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似 菌落；但無混濁帶及透明圈。長(zhǎng)期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型 菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。3）血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)吸取1 ： 4新鮮兔血漿0.5n）l,放入小試管屮，再加入培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球 菌肉浸液肉湯培養(yǎng)物0.5ml,振蕩搖勻，放3

6、6±1°c溫箱內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次, 觀察6h,如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊者，被認(rèn)為陽(yáng)性結(jié)杲。 同時(shí)以已知陽(yáng)性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對(duì)照。3. 直接計(jì)數(shù)方法1）吸取上述1： 10混懸液，進(jìn)行5倍遞次稀釋，根據(jù)樣品污染情況，選擇不同 濃度的稀釋液iml,分別加入三塊baird-parker平板，每個(gè)平板接種量分別為 0.3ml、0.3ml、0.4ml,然后用滅菌l棒涂布整個(gè)平板。如水分不多吸收，可將 平板放在36±1°c溫箱lh,等水分蒸發(fā)后反轉(zhuǎn)平皿置36±1°c溫箱培養(yǎng)。2）在三個(gè)平板上點(diǎn)數(shù)周圍有混濁帶的黑色菌落，

7、并從中任選1個(gè)菌落，接種血 瓊脂平板，36±l°c24h培養(yǎng)后進(jìn)行染色鏡檢、血漿凝固iw試驗(yàn)，步驟同增菌培養(yǎng) 法。3）菌落計(jì)數(shù)：將三個(gè)平板屮疑似金黃色葡萄球菌黑色菌落數(shù)相加，乘以血漿凝同酶陽(yáng)性數(shù)，除 以5,再乘以稀釋倍數(shù)，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1. 鑒別牛奶中是否含有金黃色葡萄球菌。2. 對(duì)牛奶屮含有的金黃色葡萄球菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。5實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二食品屮沙門氏菌的檢驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)食品中沙門氏菌的基本檢測(cè)方法0二、基本原理沙門氏菌為腸桿菌科沙門氏菌屈細(xì)菌，廣泛分布于口然界，是人畜共患的腸道病 原菌，常引起傷寒、腸炎、腸熱癥和食物屮毒，危害人類健康。沙門氏

8、菌可通過 人類、畜、禽的糞便或帶菌者直接或間接污染藥品，生產(chǎn)環(huán)境及生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié), 特別是以動(dòng)物、臟器為原料的食品污染機(jī)率較高。受到污染的食品，不僅直接影 響食用者的安全，并可造成沙門氏菌的傳播和流行。故對(duì)某些食品必須檢查沙門 氏菌。食品屮污染的沙門氏菌常在生產(chǎn)過程中受到損傷而處于瀕死狀態(tài)，故檢驗(yàn)時(shí) 須先在無選擇性的增菌液中使其復(fù)蘇，然后再進(jìn)行選擇性增菌。沙門氏菌在各種 選擇性培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)不同，這可以作為辨別沙門氏菌的一個(gè)簡(jiǎn)單方法，在 實(shí)際工作中，我們還要配合生化實(shí)驗(yàn)以及血清學(xué)實(shí)驗(yàn)來作準(zhǔn)確的鑒定。三、設(shè)備和材料實(shí)驗(yàn)器材：恒溫培養(yǎng)箱（37°c、42°c）、顯微鏡、廣口瓶

9、（500ml）、移液管（10ml）、 錐形瓶（250ml）、培養(yǎng)皿、酒精燈、試管架、試管簍、滅菌鍋實(shí)驗(yàn)材料：污染牛奶等、沙門氏菌株四、培養(yǎng)基和試劑緩沖蛋口豚水、氯化鎂孔雀綠增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、亞硫酸駆瓊脂、 dhl瓊脂、he瓊脂、ws瓊脂、ss瓊脂五、操作步驟1. 前增菌和增菌：吸取檢樣25ml,加在裝有225ml緩沖蛋白腺水的500ml廣口瓶?jī)?nèi),于37°c培 養(yǎng)4h,移取10ml,轉(zhuǎn)種于100ml氯化鎂孔雀綠增菌液內(nèi)，于42°c培養(yǎng)1824h。 同吋，另取10ml,轉(zhuǎn)種于100ml亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于37°c培養(yǎng)18 24ho2. 分離取增菌液1

10、環(huán)，劃線接種于一個(gè)亞硫酸鈕瓊脂平板和一個(gè)dhl瓊脂平板、he瓊 脂平板、ws和ss瓊脂平板。兩種增菌液可同時(shí)劃線接種在同一個(gè)平板上。于36±1°c分別培養(yǎng)1824h（亞硫酸祕(mì)瓊脂、dhl、he、ws、ss）或4048h（bs）, 觀察各個(gè)平板上生氏的菌落，沙門氏菌i、ii、iv、v、vi和沙門氏菌iii在各個(gè) 平板上的菌落特征見表1。表1 沙門氏菌屬各群在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板沙門氏菌i、11、iv、v、vi沙門氏菌111（即亞利 桑那菌）亞硫酸鋌瓊脂產(chǎn)硫化氮菌落為黑色冇金屬光 澤、棕褐色或灰色，菌落周圍 培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；冇些 菌株不產(chǎn)生硫化氫，

11、形成灰綠 色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變黑色冇金屬光澤dhl瓊脂無色半透明，產(chǎn)硫化氫菌落中 心帶黑色或幾乎全黑色乳糖遲緩陽(yáng)性或陰 性的菌株與沙門氏 菌 i、ii、iv、v、 vi相同；乳糖陽(yáng)性的 菌株為粉紅色，中心 帶黑色he瓊脂ws瓊脂藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌株產(chǎn)硫 化氫，菌落屮心黑色或兒乎全 黑色乳糖陽(yáng)性的菌株為 黃色，屮心黑色或兒 乎全黑色；乳糖遲緩 陽(yáng)性或陰性的菌株 為藍(lán)綠色或藍(lán)色，中 心黑色或幾乎全黑 色ss瓊脂無色半透明，產(chǎn)硫化氫菌株有 的菌落中心帶黑色，但不如以 上培養(yǎng)基明顯乳糖遲緩陽(yáng)性或陰 性的菌株，與沙門氏 菌 i、ii、iv、v、 vi相同；乳糖陽(yáng)性的 菌株為粉紅色，屮心 黑色，但中

12、心無黑色 形成時(shí)與大腸艾希 氏菌不能區(qū)分六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1. 辨別牛奶污染菌株是否為沙門氏菌株。2. 辨別污染牛奶的沙門氏菌株的屬群。實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（間接elisa）一、目的要求1. 了解elisa的基本原理，及其優(yōu)缺點(diǎn)。2. 掌握間接elisa法的試驗(yàn)操作過程。二、基本原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,簡(jiǎn)稱elisa）是免疫酶 技術(shù)的一種，是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶反應(yīng)的敏感性相結(jié)合而建立的一種 新技術(shù)。elisa的技術(shù)原理是：將酶分了與抗體（或抗原）結(jié)合，形成穩(wěn)定的酶 標(biāo)抗體（或抗原）與同相載體上的相應(yīng)抗原（或抗體）結(jié)合時(shí)

13、，即可在底物溶液 參與下，產(chǎn)生肉眼可見的顏色反應(yīng)，顏色的深淺與抗原或抗體的量成比例關(guān)系， 使用elisa檢測(cè)儀，即iw標(biāo)測(cè)定儀，測(cè)定其吸收值可做出定量分析。此技術(shù)具 特異、敏感、結(jié)果半段客觀，簡(jiǎn)便和安全等優(yōu)點(diǎn)，仃益受到重視，不僅在微生物 學(xué)中應(yīng)用廣，而且也被其他學(xué)科領(lǐng)域廣為采用o elisa類型繁多，國(guó)內(nèi)已有市售, 可根據(jù)需要選用，按說明書操作。三、器材1. 血清兔陰性血清2. 溶液或試劑（1）包被液（0.05mol/l,ph9.6 的碳酸鹽緩沖液）:naco3 1.59g, nahco3 2.93g, 加去離子水定容至loooml （加入0.5%的甲醛，4°c可保存約2周）,現(xiàn)配現(xiàn)

14、用。（2）pbst 洗滌劑（吐溫磷酸鹽緩沖液 ph7.4） : nacl 8g , kh2po4 0.2g ,na2hpo412h2o 2.9g,kc10.2g, i止溫20 0.5ml,蒸惚水加至 1 oomll 磷酸鹽檸檬酸緩沖液（ph5.0）:分別取甲液24.3ml,乙液25.7ml,加去 離子水定容至loomllo甲液（o.olmol/1的檸檬酸c6h8o7 h2o）:稱取c6h8o7 h2o19.2g,加去離子水 定容至looomlo乙液（0.2mol/l 的磷酸氫二鈉 na2hpo412h2o）:稱取 na2hpo412h2o 71.7g, 加去離了水定容至looomllo 底物溶

15、液：40mg鄰苯二胺溶于loooml ph5.0的磷酸鹽檸檬酸緩沖液，臨 用前加入150|ill 30%的h2o2,現(xiàn)配現(xiàn)用。 終止液 2mol/l h2so4：吸取 10.66ml 的 98%濃 h2so4 （密度為 1.84g/ml）, 加去離子水定容至loomlo 酶標(biāo)二抗（山羊抗兔ig-hrp）稀釋液：分別吸取10ml小牛血清和50|il的 tween-20,加上述pbs緩沖液定容至loomlo3. 儀器或其他用具 聚苯乙烯微量反應(yīng)板，酶標(biāo)儀，吸管，橡皮吸頭等，紫外 分光光度計(jì)，20ul、100ul、500 ul移液槍各一只，elisa試劑盒。四、操作步驟1 .包被抗原 用100ul移

16、液槍吸取用包被液稀釋好的金黃色葡萄球菌抗原，沿孔壁準(zhǔn)確滴加 100pl至每個(gè)塑料板孔中，防止氣泡產(chǎn)生，置37°c過夜。2詵板倒出包被液，用另一根習(xí)慣吸取洗滌液，加入板孔中，洗滌液量以加滿但不 溢出板孔為宜。均勻振蕩3min ,甩出洗滌液。再加洗滌液，重復(fù)上述操作三次, 扣干。3. 加血清用三根套有橡皮吸頭的0.2mll吸管，小心吸取稀釋好的血清（待檢、陽(yáng)性、陰性血清），準(zhǔn)確加1ooul于對(duì)應(yīng)板孔中，第4孔中加100 ul的 pbst洗滌液，37°c放置lomin,在水池邊甩出血清，洗板三次（方法同2）。注意：切忌溢出互混！4. 加酶標(biāo)抗體用吸管沿孔壁上部小心準(zhǔn)確加入ioop

17、l酶標(biāo)抗體（不能讓血清玷污吸管）,37°c 放置lomin,同上倒空，洗滌三次。5. 加底物按比例加h2o2于配制的底物溶液中，立即用吸管吸取此種溶液，分別加于板孔 屮，每孔o(hù).lmlo置3tc,顯色515min （經(jīng)常觀察），待對(duì)照冇明顯顏色后, 立即加一滴2mol/l h2so4終止反應(yīng)。6. 判斷結(jié)果肉眼觀察（白色背景），陽(yáng)性對(duì)照孔應(yīng)明顯黃色，陰性孔應(yīng)無色或微黃色，待測(cè) 孔顏色深于陽(yáng)性對(duì)照孔則為陽(yáng)性；酶標(biāo)儀測(cè)定，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)取x=492nm （適 用于底物為opd） ,p/n22.1時(shí)陽(yáng)性,p/nw1.5陰性，2.12p/n21.5可疑陽(yáng)性，應(yīng)予復(fù)查。（p/n=檢測(cè)孔o(hù)d值空

18、白孔o(hù)d值/陰性孔o(hù)d值空白孔o(hù)d值。） 滴加試劑量要準(zhǔn)，且試劑不可從-孔流到另一孔屮；每種試劑對(duì)應(yīng)一種吸管，不能混淆。底物溶液中的h2o2要臨用時(shí)再加，否則，放置時(shí)間過長(zhǎng)，影響 試驗(yàn)結(jié)果判定。五. 實(shí)驗(yàn)報(bào)告1結(jié)果運(yùn)用圖示表現(xiàn)你所進(jìn)行的elisa的反應(yīng)原理，并寫出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 2思考題（1） elisa實(shí)驗(yàn)過程中，洗板這一步驟能否省去，為什么？（2）酶底物溶液為什么需要現(xiàn)配現(xiàn)用？5實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四pcr技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)副溶血弧菌dna的提取方法2. 學(xué)習(xí)副溶血弧菌的pcr檢測(cè)方法二、基木原理副溶血弧菌是弧菌的一種，主要存在于海洋中，是一種致病菌。人類會(huì)因進(jìn)食未 煮熟的海產(chǎn)

19、胡或被該菌污染的食物而感染，引起食物屮毒。pcr是利用基因擴(kuò) 壇技術(shù)，具有特異、敏感、快速的分子生物學(xué)方法，該技術(shù)在微生物、分子流行 病學(xué)及疾病診斷燈方面的應(yīng)用顯示出極大的優(yōu)越性。16s1dan具有分了大小適 屮，突變率小等優(yōu)點(diǎn)，素冇”細(xì)菌化石”z稱，常被用于細(xì)菌分類及分子系統(tǒng)發(fā)育 樹的建立。木次實(shí)驗(yàn)利用16srdan的通用引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，來檢測(cè)副溶血弧菌。三、設(shè)備和材料實(shí)驗(yàn)器材：pcr擴(kuò)增儀、電泳儀、高速冷凍離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱（30°c）、酒 精燈、培養(yǎng)血、試管（15x 150mm）、接種環(huán)、離心管（1.5ml）、一次性手套、 一次性口罩、移液槍（1 10ul、10-100u

20、 l）、槍頭（0.5 loul、1-200 ul）、配套槍頭盒、顯微鏡、載玻片、滅菌鍋、試管架、試管簍實(shí)驗(yàn)材料：副溶血弧菌24h培養(yǎng)物四、試劑dna提取試劑盒、pcr擴(kuò)增試劑盒、引物（27f、1492r）、瓊脂糖、eb染色液、 dna markertae pcr電泳緩沖液、革蘭氏染色液、tcbs培養(yǎng)基、3%nacl營(yíng)養(yǎng)肉湯、生理 鹽水五、操作步驟1. 培養(yǎng)基培養(yǎng)：取副溶血弧菌24h培養(yǎng)物分別接種在tcbs培養(yǎng)基以及3%nacl營(yíng)養(yǎng)肉湯中，30°c 培養(yǎng)24ho2. 鏡檢：取固體培養(yǎng)基上的菌體進(jìn)行革蘭氏染色，觀察具體形態(tài)，副溶血弧菌為革蘭 氏陰性菌，在油鏡下觀察，菌體弧狀，0.5x1.

21、 53.0微米，單個(gè)或偶爾聯(lián)成s 形。3. dna捉取：取液體培養(yǎng)物進(jìn)行dna提取，按照dna提取試劑盒說明操作。4. dna擴(kuò)增：利用細(xì)菌16srdna的通用引物來進(jìn)行dna擴(kuò)增?？傮w積25 u 1的反應(yīng)體系中， 10umol/l 的上下游引物各 1ul,模板 dnalul, mg+1.5ul, dntp2.5 u l, taq 酶 0.3pl, loxbuffei緩沖液 2.0 u l,雙蒸水 15.2 ul。引物序列為：27f： agagtttgatcctggctcag1492r： ggttaccttgttacgacttpcr反應(yīng)條件為：預(yù)變性 95°c3min,變性 95&#

22、176;clmin,退火 55°clmin,延長(zhǎng) 72°c2min, 30 個(gè)循環(huán), 再延 72°c10mino5. 電泳檢測(cè)： 餐飲業(yè)管理與學(xué)習(xí) 取15卩1擴(kuò)增液經(jīng)2%瓊脂糖凝膠及tae電泳緩沖液電泳90min,在eb染色液 中染色30min,然后漂洗，用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告觀察擴(kuò)壇后的dna條帶，根據(jù)marker判斷其dna大小。5實(shí)驗(yàn)五實(shí)驗(yàn)五3m大腸桿菌和大腸菌群快速檢驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆绽?m測(cè)試片快速檢測(cè)人腸桿菌的方法。二基木原理petrifilm coliform coliform 測(cè)試片含有 vrb 培養(yǎng)劑（violet red b訂

23、e）, 一種冷水可溶性的凝膠劑和四啤翁（tetrazollium）指示劑，可增強(qiáng)菌落計(jì)數(shù)效 果。絕大多數(shù)e.coli （約占97%）能產(chǎn)生-葡萄糖甘酸iw與培養(yǎng)基屮的指示劑反 應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色沉淀環(huán)繞在人腸桿菌菌落周圍，表面覆蓋的膠膜，可留住發(fā)酵乳糖 的大腸菌群產(chǎn)生的氣體，約有95%的大腸桿菌產(chǎn)生，形成藍(lán)色或深藍(lán)上菌落并有 氣泡相連接，氣泡大小約為1個(gè)菌落直徑。a0ac和fda細(xì)菌學(xué)分析手冊(cè)（ram）規(guī)定大腸菌群為革蘭氏陰性桿菌，發(fā)酵乳糖 產(chǎn)酸產(chǎn)氣。大腸菌群菌落在petrif訂mcc測(cè)試片上生長(zhǎng)產(chǎn)酸，ph指示劑使培養(yǎng) 基顏色變深，在紅色菌落周圍有氣泡者，為大腸菌群細(xì)菌。三設(shè)備和材料3m 公司的 p

24、ertri film o培養(yǎng)箱等。四操作步驟（1）樣品準(zhǔn)備稱取或吸取食品樣品，置于適宜的無菌容器內(nèi)，加入適量無菌稀釋液攪拌或均質(zhì) 樣品。（2）接種將測(cè)試片放置在平坦表面處，揭起上層膜，使用吸管將ln）l的樣品垂直滴在測(cè)試 片的屮央處。將上層膜緩緩蓋下，避免氣泡進(jìn)入，切勿讓上層膜直接蓋回。使用 壓板（平面底朝上）放置在上層膜中央處，輕輕壓下，切勿扭轉(zhuǎn)或滑動(dòng)壓板。靜 止lmin使凝膠凝固。（3）培養(yǎng)測(cè)試片的透明的一面向上，可堆疊至20片，于35°c±1°c或37°c土 1°c下培養(yǎng) 24h±2h （培養(yǎng)后的菌落在測(cè)試片上可能看不到，因?yàn)橹?/p>

25、示劑是含在金黃色葡萄 球菌檢測(cè)反應(yīng)片上）。將檢測(cè)片移至62°c±2°c培養(yǎng)箱，培養(yǎng)lh4h （注意：如 果菌落需要進(jìn)一步測(cè)試，檢測(cè)片培養(yǎng)不要超過lh）。使用無菌銀子取出圓形的反應(yīng)片，再揭開上層覆蓋膜小心置入反應(yīng)片。再將上層膜放下（為了使反應(yīng)片與 培養(yǎng)膠均勻接觸及避免夾帶任何氣泡，可用一彎曲的玻璃棒（l玻棒）輕壓檢測(cè) 片）。將已置入反應(yīng)片的金黃色葡萄球菌檢測(cè)片培養(yǎng)于35°c±rc或37°c±1°c, 1 3h o將測(cè)試片置于平坦表面使用吸管將iml樣液垂 處，揭開上層膜直加在測(cè)試片的中央處上層膜直接落f輕輕的壓下，使

26、樣液均勻覆蓋于圓形的 培養(yǎng)面積上，切勿扭轉(zhuǎn)樣板拿起壓板，靜止至少1分鐘以使培養(yǎng) 基凝固測(cè)試片的透明面朝上，可 可目視及用標(biāo)準(zhǔn)菌落計(jì) 堆疊至20片數(shù)器或其它的照明放大* 丁鏡計(jì)數(shù)，并可參考判讀卡 計(jì)算菌落數(shù)可以分離菌落作進(jìn)一步 鑒定，即掀起上層膜，由 培養(yǎng)膠上挑取單個(gè)菌落細(xì)心將上層膜緩慢蓋下, 避免冇氣泡產(chǎn)生,切勿使圖1 3m測(cè)試片的操作方法四檢測(cè)結(jié)果的判讀卡和計(jì)算菌落數(shù)方法aoac和fda細(xì)菌學(xué)分析手冊(cè)（ram）規(guī)定大腸菌群為革蘭氏陰性桿菌，發(fā)酵乳 糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。大腸菌群菌落在pertrifilm測(cè)試片上生長(zhǎng)產(chǎn)酸，ph指示劑使培養(yǎng)基顏色變深，在紅色菌落周圍冇氣泡者，為大腸菌群。具體判定方法參見圖

27、2。大腸菌群菌落總數(shù)二69大腸菌群鑒定方法，在不同國(guó)家可以 有變更（見培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度提 示）。a0ac確認(rèn)大腸菌群菌落總數(shù)為 69 （冇氣泡的菌落）無生長(zhǎng)=0注意圖2-5培養(yǎng)基顏色的變化，隨著 人腸菌群菌數(shù)增多，培養(yǎng)基顏色變深, 背景的泡（沫）為培養(yǎng)對(duì)象，不是大 腸菌群生長(zhǎng)結(jié)呆大腸菌群菌落總數(shù)二79petrifilm cc測(cè)試片菌落數(shù)適宜計(jì)數(shù) 范圍是15-150,不要計(jì)算圓形培養(yǎng)基 外的菌落，因?yàn)榕菝奚弦巡缓x擇性 培養(yǎng)基（岡圈1）估計(jì)的大腸菌群菌落總數(shù)二220 測(cè)試片面積為20cm2,當(dāng)菌落數(shù)超過 150個(gè)，為了估計(jì)菌落數(shù)可選擇其中一 個(gè)或數(shù)個(gè)有代表性菌落的小方格（lcm2）計(jì)算平均菌落

28、數(shù)，再乘以20 方得到整個(gè)測(cè)試片上的菌落數(shù)。菌落 太多吋需進(jìn)一步稀釋樣品，方能獲得 準(zhǔn)確計(jì)數(shù)大腸菌群菌落總數(shù)二tntc （菌落太多無 法計(jì)數(shù)）petri film co測(cè)試片菌落無法計(jì)數(shù)時(shí) 至少有下列現(xiàn)象z-：有很多小菌 落；冇許多氣泡；培養(yǎng)的顏色深 暗大腸菌群菌落總數(shù)二2食物顆粒為不規(guī)則形狀，且不帶氣泡大腸菌群菌落總數(shù)=4當(dāng)有大量的非大腸菌群細(xì)菌如假單胞 菌屬存在時(shí),petrifi im co測(cè)試片培 養(yǎng)基顏色呈黃色氣泡可有不同形狀，氣泡可使菌落撐 散，使菌落輪廓似氣泡（見圓圈1和 圜圈2），人為的氣泡可能是不當(dāng)?shù)牟?作所致，或是來自樣品里的氣體，它 們呈不規(guī)則形狀，口不與菌落相連接 （見圓圈3）o 09»®s910圖2人腸菌群檢測(cè)的判讀卡和計(jì)數(shù)方法五實(shí)驗(yàn)報(bào)告培養(yǎng)后，判斷大腸桿菌菌落并計(jì)數(shù)。5實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六、對(duì)硫磷在蘋果中殘留的分析方法一、目的1學(xué)習(xí)農(nóng)藥殘留樣木預(yù)處理、凈化、濃縮等操作技術(shù)。2. 重點(diǎn)學(xué)習(xí)凈化柱的填充和使用。3學(xué)習(xí)氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀的使用。二、實(shí)驗(yàn)儀器和試劑1儀器：氣相色譜儀與質(zhì)譜聯(lián)用