分子生物學實驗

1、枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)a -淀粉酶一、實驗目的了解枯草芽孢桿菌發(fā)酵的根本過程二、實驗原理a-淀粉酶是一類用途十分廣泛的酶，糧食加工、食品工業(yè)、釀造、發(fā)酵、紡 織品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)都經(jīng)常使用。 a-淀粉酶(EC.3.2.1.1 )作用淀粉時可從分子 內部切開 a-1,4- 糖苷鍵而生成糊精和復原糖，產(chǎn)物的末端殘基碳原子構型為 a- 構型，故稱a-淀粉酶。a-淀粉酶的分子量范圍是15600-139300，通常為45000-60000，可分為耐 熱、耐酸、耐堿和耐鹽酶。a-淀粉酶可由微生物發(fā)酵產(chǎn)生，也可從植物和動物細 胞中提取，目前工業(yè)上都以微生物發(fā)酵法進行大規(guī)模生產(chǎn) a-淀粉酶。三、實驗材料和方法1

2、、 菌種枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis )2、種子培養(yǎng)基牛肉膏 1；蛋白胨 2；Nacl 1 ；3、發(fā)酵培養(yǎng)基可溶性淀粉 10；(NH4) 2SO4 2.6；KH2PO4 5.7；K2HPO41.7；pH 4、儀器設備超凈工作臺、搖床、培養(yǎng)箱、紫外可見分光光度計等。四、實驗步驟一 種子培養(yǎng)將冰箱中保存的斜面菌種在30C恒溫培養(yǎng)箱中活化3h，取一環(huán)接種至搖瓶 中，30T下置于搖床中培養(yǎng)16-18h，即得新鮮種子液。二 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)500mL 搖瓶中裝有 50mL 已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，用無菌的移液管吸取 5mL 種子液接入搖瓶，在搖床中與 30 C和200r/min條件下培養(yǎng)4

3、8h。結束時將培養(yǎng) 液離心，收集上清液放入冰箱中冷藏保存，集中測定 a-淀粉酶的酶活大小。五、實驗結果測發(fā)酵結束時的細胞生物量和 pH 值。此次實驗未進行測量。硫酸銨沉淀法別離純化(透析)a- 淀粉酶一、目的和要求1、了解保有蛋白質活性的濃縮方法。2、掌握硫酸銨沉淀法濃縮a-淀粉酶的方法。二、實驗原理當高濃度鹽存在時，蛋白質往往凝聚并析出沉淀。這一技術稱為“鹽析。 不同的蛋白質在不同濃度的鹽中形成沉淀，所以鹽析常用于蛋白質的別離純化。 幾種因素如pH、溫度、蛋白質純度在測定各種蛋白質的鹽析點時起著重要作用。選擇硫酸銨是因為它具有一些優(yōu)良性質，如鹽析的有效性、pH 范圍廣、溶解度高、溶解散熱少和

4、經(jīng)濟適用。硫酸銨濃度常以百分濃度表示。以 X%表示所要配制的溶液濃度，Xo%表示開始的溶液濃度，所需要的硫酸銨克數(shù)按以下公式計算：g=515 (X-Xo) / (100-0.27X ) (0C時 1L溶液，用量見附錄 3)大多數(shù)蛋白質在 55% 硫酸銨中沉淀，獲得最大量蛋白質沉淀是 85% 硫酸銨 溶液，以不含硫酸銨的 100mL 蛋白質溶液為起始溶液，按以下操作步驟進行鹽 析。三、步驟操作( 1) 將盛有蛋白質溶液的燒杯放在另一裝有冰水的大燒杯內，并置于磁力攪拌器上攪拌； 2 邊攪拌，邊徐徐參加 28.4g 硫酸銨至飽和，該步驟應該在 5-10min 內完成； 3 繼續(xù)攪拌 10-30min

5、 ；410000xg 離心 10min 或 3000xg 離心 30min ； 5 棄去上清液，將沉淀懸浮于 1-2 倍沉淀物體積的緩沖液中，殘留的不溶性物質可能是變性蛋白，通過離心除去； 6 硫酸銨能夠通過透析、超濾或脫鹽柱除去；7得到純化后的a-淀粉酶，溶于20mL緩沖溶液；8紫外分光光度計測定a-淀粉酶的濃度；9測定a-淀粉酶的活性，與原酶液的活性進行比擬。透析實驗一 透析的原理透析是指溶質從半透膜的一側透過膜至另一側的過程，任何天然的如腹膜或人造的 半透膜， 只要該膜含有使一定大小的溶質通過的孔徑，那么這些溶質就可以通過彌散和 對流從膜的一側移動到膜的另一側。人體內的毒物包括代謝產(chǎn)物，

6、藥物，外源性毒物，只要其原子量或分子量大小適宜，就 能夠通過透析去除體外。 其根本原理是彌散和對流。彌散就是半透膜兩側液體各自所含 溶質濃度梯度及它所形成的不同滲透濃度， 溶質從濃度高的一側通過半透膜向濃度低的 一側移動。 對流也稱超濾， 是指溶質和溶劑因透析膜兩側的靜水壓和滲透壓梯度的不同 而跨膜轉運的過程。二 透析袋的使用方法一 透析袋前處理方法如下：1. 把透析袋剪成適當長度 10-20cm 的小段。2. 在大體積的 2 W/V 碳酸氫鈉和 10mmol/L EDTAph8.0 中將透析袋煮沸 10 分3. 用蒸餾水徹底清洗透析袋。4. 放在 10mmol/L EDTAph8.0 中將之

7、煮沸 10 分鐘。5. 冷卻后，存放于四度，必須確保透析袋始終浸沒在溶液內。從此時起取用透析袋時 必須戴手套。二 透析除鹽1. 蛋白質在用鹽析沉淀別離后，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的方法是透析，即將 蛋白質溶液裝入透析袋內常用的是玻璃紙，用緩沖溶液進行透析，并不斷的更 換緩沖溶液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。2. 0.02 mol/LPH7.4PBS 溶解蛋白質沉淀至 10ml 裝入透析袋。3. 4 °C 下，對 PBS 充分透析、換液 3 次，至萘氏試劑測透析外液無黃色，即無 NH4+ 為止。4. 取透析袋內樣品少許作適當倍數(shù)稀釋后， 以 751 型紫外分光光度計測

8、定蛋白質含量。方法如下：蛋白質含量 mg/ml =1.4 5XOD280nm-0.74XOD260nm樣品稀釋度。四、儀器 1 燒杯 2 磁力攪拌器和攪拌子 3 離心機和轉頭五、試劑 1 硫酸銨 2 用于懸浮沉淀物的緩沖液六、考前須知1 攪拌必須是有規(guī)那么的和溫和的。 攪拌太快將引起蛋白質變性， 其變性特征 是起泡。用磁力攪拌器不明顯產(chǎn)熱，這一點也很重要。2大多數(shù)蛋白質在鹽溶解后的前 20min沉淀，一些蛋白質要經(jīng)數(shù)小時才能 完全沉淀。3 為了平衡硫酸銨溶解時產(chǎn)生的輕微酸化作用，沉淀反響至少在50mmol/L 緩沖液中進行。4緩沖液應該含有螯合劑如EDTA以除去硫酸銨中微量的重金屬離子，因為

9、這些離子對目的蛋白質是有害的。5 為確保獲得最大量沉淀，使用蛋白質初始濃度至少為1mg/mL。6硫酸銨沉淀反響通常是貯存和穩(wěn)定蛋白質的良好方法。7少數(shù)蛋白質在硫酸銨濃度低于 24%時就產(chǎn)生沉淀，而大多數(shù)要在 80%以 上才能沉淀。在純化的初始階段，常利用蛋白質在硫酸銨中溶解度的差異 別離蛋白質。硫酸銨沉淀可除去 RNA和DNA。8在蛋白質的等電點其溶解度降低，在此條件下，靜電的相互作用可導致蛋 白質凝集和沉淀，在蛋白質的等電點，低濃度的硫酸銨就能沉淀蛋白質。9在蛋白質結晶實驗中，采用硫酸銨沉淀十分有效。七. 實驗結果與分析酶活力測定中吸光度的1-9組測量結果硫酸銨沉淀法測酶活OD660平均值空

10、白10.4240.4180.4300.424空白20.4740.4670.4730.471空白30.4900.4970.5050.49710.4760.4800.4880.48120.4900.5010.4950.49530.4560.4460.4490.45040.4850.4910.4860.48750.4270.4360.4400.43460.4770.4730.4660.47270.4630.4700.4760.47080.4500.4500.4450.44890.4750.4810.4780.478酶濃度1-9組測定結果編號濃度mg/mlA28010.360.54420.360.48

11、330.280.37840.290.41050.160.23960.140.21070.160.24480.300.44290.210.284所以本組(7)的酶活力測定結果為0.11U，酶濃度為0.16 mg/ml常用的鹽析劑是硫酸銨，其溶解度大、價格廉價。硫酸銨沉淀蛋白質的能力很強,其飽和溶液能使大多數(shù)的蛋白質沉淀下來。對酶沒有破壞作用pH 的控制：應從酶的溶解度與穩(wěn)定性兩個方面考慮，在酶等電點時其溶解度最 小易沉淀，但有些酶再等電點時穩(wěn)定性較差， 因此要選擇最正確 pH 值.一般要求在 酶最穩(wěn)定的 pH 值的前提下再考慮最適宜酶沉淀的 pH 值。在操作中一旦確定最 佳 pH 值后，在添加硫

12、酸銨之前甲酸或堿調節(jié)好酶液的 pH 值，要盡量防止溶液 pH 值的波動以免破壞酶的穩(wěn)定性。在添加硫酸銨時要注意攪拌，并注意硫酸銨 的參加速度，一般是由少到多，緩慢參加，硫酸銨盡可能磨成細粉。 溫度的控制： 有些酶在較高溫度下穩(wěn)定性能較好， 可在常溫下進行鹽析操作， 而 對于大多數(shù)酶，盡可能在低溫下操作。有機溶劑沉淀法別離純化a-淀粉酶一、 目的和要求1、了解保有蛋白質活性的濃縮方法。2、掌握有機溶劑沉淀法濃縮 a- 淀粉酶的方法。二、 實驗原理將有機溶劑例如丙酮和乙醇參加蛋白質溶液時，和高濃度鹽類似產(chǎn)生沉淀，這是因為它們能夠降低蛋白質的溶解度。在溫度為 10 C左右時蛋白質在有機溶 劑中容易變

13、性，所以在沉淀時必須特別注意冷卻溶液和離心轉頭(0-4 C為佳)。有機溶劑的濃度按體積百分數(shù)計算， 累加體積并不精確。 例如用簡便的方法將100mL水溶液要配置成50%(v/v)乙醇溶液，就是向100mL水溶液加100mL 乙醇溶液。盡管最后總體積是192mL。大多數(shù)蛋白質的分子量大于15kD，一般 用 50% 有機溶劑進行沉淀。三、儀器(1)燒杯( 2)磁力攪拌器和攪拌子( 3)離心機和轉頭四、試劑(1)無水乙醇( 2)再懸浮沉淀的緩沖液五、 操作步驟(1) 在4 C下，向50mL蛋白質溶液中緩緩參加 50mL丙酮或乙醇(冷卻至 -20 C),在冰水浴上持續(xù)溫和的攪拌；(2) 在冰水上持續(xù)攪

14、拌10-15min ;(3) 低溫離心 10000xg 10min ；(4) 除去上清液；(5) 用沉淀的2倍體積的冷緩沖液再使沉淀懸浮。實際上變性蛋白質難于溶解，可用過濾或離心的方法除去；(6) 得到純化后的a-淀粉酶，溶于20mL緩沖溶液。(7) 紫外分光光度計測定a-淀粉酶的濃度，與原酶液的濃度進行比擬。(8) 測定a-淀粉酶的活性，與原酶液的活性進行比擬。六、考前須知(1) 酸性蛋白質在二價陽離子例如 Mg2+存在下，以復合物的形式較易被沉淀。(2) 大分子的蛋白質及親水的蛋白質往往在較低濃度的有機溶劑中就能析出。(3) 在溶液pH值接近蛋白質的等電點時，蛋白質在有機溶劑中的溶解度降低

15、。 七實驗結果酶活力測定中吸光度的1-9組測量結果有機溶劑沉淀酶活OD660平均值空白11.0121.0241.0211.019空白21.0831.0821.0831.083沉淀0.4490.4600.4580.45610.4130.4150.4130.41420.3150.3140.3200.31630.4660.4660.4670.46640.4840.4850.4840.48450.2610.2600.2570.25960.4900.4920.4880.49070.5160.5250.5160.51980.4330.4380.4340.43590.4960.4920.4950.494酶濃度1-9組測定結果編號濃度mg/mlA28010.120.17320.060.130.030.0640.210.3650.110.19660.