實驗四PCR產(chǎn)物的T載體克隆和轉(zhuǎn)化學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1實驗實驗(shyn)四四PCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的T載體克隆和載體克隆和轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化第一頁，共40頁。重組重組(zhn z)DNA技術(shù)操作技術(shù)操作步驟步驟第1頁/共39頁第二頁，共40頁?；驹砘驹砟康幕虻墨@取目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細胞導(dǎo)入受體細胞外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達克隆基因的表達 第2頁/共39頁第三頁，共40頁。主要步驟：主要步驟： 制備目的基因和選擇相關(guān)載體制備目的基因和選擇相關(guān)載體 目的基因和有關(guān)載體進行連接目的基因和有關(guān)載體進行連接(linji) 重組的重組的DNA導(dǎo)入受體細胞

2、導(dǎo)入受體細胞 DNA重組體的篩選和鑒定重組體的篩選和鑒定 DNA重組體的擴增、表達和其他研究重組體的擴增、表達和其他研究第3頁/共39頁第四頁，共40頁。 以以 質(zhì)質(zhì) 粒粒 為為 載載 體體 的的DNA 克克 隆隆 過過 程程第4頁/共39頁第五頁，共40頁。 （三）（三）PCR擴增特定擴增特定(tdng)基因基因 （四）人工合成（四）人工合成(rn n h chn)一、目的一、目的(md)基因的獲得基因的獲得分分 （一）從基因組文庫中獲得（一）從基因組文庫中獲得 （二）從（二）從cDNA文庫中獲得文庫中獲得第5頁/共39頁第六頁，共40頁。組織組織(zzh)或細胞染色體或細胞染色體DNA基因

3、基因(jyn)片斷片斷克隆克隆(k ln)載體載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫文庫存在于轉(zhuǎn)化細胞存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組所有基因組DNA的集合的集合 從基因組從基因組DNA文庫文庫獲取目的基因獲取目的基因第6頁/共39頁第七頁，共40頁。限制酶切位點限制酶切位點限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連

4、接反應(yīng)連接反應(yīng) 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文庫基因文庫用隨機用隨機(su j)切割的真核生物染色體切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫片段構(gòu)建基因文庫 第7頁/共39頁第八頁，共40頁。mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組重組DNA分子分子 cDNA文庫文庫 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 載體載體 受體菌受體菌 復(fù)復(fù)制制 從從cDNA文庫獲取文庫獲取(huq)目的基因目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA

5、聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T第8頁/共39頁第九頁，共40頁。化學(xué)合成法獲取化學(xué)合成法獲取(huq)(huq)目的基因目的基因由已知氨基酸序列由已知氨基酸序列(xli)推測可能的推測可能的DNA序列序列(xli)。第9頁/共39頁第十頁，共40頁。幾種幾種(j zhn)常用克隆載體的比較常用克隆載體的比較注：注：+ +表示表示(biosh)(biosh)可用；可用；- -表示表示(biosh)(biosh)不可用不可用比較比較(bjio)內(nèi)容內(nèi)容 質(zhì)質(zhì) 粒粒 噬菌體噬菌體 黏性質(zhì)粒黏性質(zhì)粒 M13噬菌體噬菌體克隆容量克隆容量 10 kb 22 kb 4050 kb 1 kb基因組基

6、因組DNA文庫文庫 - + + -cDNA文庫文庫 + + - -亞克隆亞克隆 + - - +序列分析序列分析 + + - +表達表達 + + - -二、載體的選擇與準(zhǔn)備二、載體的選擇與準(zhǔn)備選選第10頁/共39頁第十一頁，共40頁。三、三、DNADNA分子分子(fnz)(fnz)的體外連接的體外連接接接（一）黏性末端（一）黏性末端(m dun)（二）人工（二）人工(rngng)接頭的使用接頭的使用（三）加入同聚體尾（三）加入同聚體尾（四）平端連接（四）平端連接第11頁/共39頁第十二頁，共40頁。（一）黏性末端（一）黏性末端(m dun)第12頁/共39頁第十三頁，共40頁。（二）人工（二）人

7、工(rngng)接頭接頭第13頁/共39頁第十四頁，共40頁。（三）加入（三）加入(jir)同聚體同聚體尾尾待克隆待克隆(k (k ln)DNAln)DNA片段片段重組重組(zhn z)質(zhì)粒質(zhì)?；旌?、退火混合、退火空白質(zhì)?？瞻踪|(zhì)粒第14頁/共39頁第十五頁，共40頁。（四）平端連接（四）平端連接(linji)第15頁/共39頁第十六頁，共40頁。5 3 3 5 載體載體(zit)DNA5 3 3 5 目的目的(md)基因基因限制限制(xinzh)酶或機械剪切酶或機械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 3 A(A)nA A(A)nA -核

8、酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體5 3 5 第16頁/共39頁第十七頁，共40頁。四、外源四、外源DNADNA導(dǎo)入宿主導(dǎo)入宿主(szh)(szh)細胞細胞轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)受體菌條件：受體菌條件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重組限制酶和重組(zhn z)酶缺陷酶缺陷處于感受態(tài)處于感受態(tài)(competent) 導(dǎo)入方式：導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化(zhunhu) (transformation)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (transfection)感染感染 (infec

9、tion)第17頁/共39頁第十八頁，共40頁。 外源基因?qū)胨拗骷毎?，篩選外源基因?qū)胨拗骷毎?，篩選(shixun)含有目的基因的陽性克隆含有目的基因的陽性克隆并加以擴增。并加以擴增。 所用的方法主要有遺傳學(xué)方法、所用的方法主要有遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、核酸雜交法、免疫學(xué)方法、核酸雜交法、PCR等。等。五、目的基因五、目的基因(jyn)(jyn)的篩選和鑒定的篩選和鑒定篩篩第18頁/共39頁第十九頁，共40頁。1. 借助載體上的遺傳標(biāo)志進行篩選借助載體上的遺傳標(biāo)志進行篩選 (1) 利用抗生素抗性標(biāo)志篩選利用抗生素抗性標(biāo)志篩選(2) 利用基因的插入失活利用基因的插入失活/插入表達插入表達

10、特性特性(txng)篩選篩選(3) 利用標(biāo)志補救篩選利用標(biāo)志補救篩選(4)利用噬菌體的包裝特性利用噬菌體的包裝特性(txng)進行篩選進行篩選2. 序列特異性篩選序列特異性篩選(shixun) (1) RE酶切法酶切法 (2) PCR法法 (3) 核酸雜交法核酸雜交法(4) DNA測序法測序法 第19頁/共39頁第二十頁，共40頁。（一）（一） 遺傳學(xué)方法遺傳學(xué)方法(fngf) (fngf) 1. 1. 插入插入(ch (ch r)r)滅活法滅活法第20頁/共39頁第二十一頁，共40頁。插入失活篩選帶有重組插入失活篩選帶有重組(zhn z)(zhn z)載體的克隆載體的克隆 第21頁/共39頁

11、第二十二頁，共40頁。第22頁/共39頁第二十三頁，共40頁。2. 藍藍-白篩選白篩選(shixun)（互補）互補） 許多載體（如許多載體（如M13系列系列(xli)、pUC系列系列(xli)、pGEM系列系列(xli)）都含有）都含有-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)）的調(diào)控序列和氨基端控序列和氨基端145個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點。這種載體適用于可編碼插入了一個多克隆位點。這種載體適用于可編碼-半乳糖半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細胞。宿主和載體編碼的片段苷酶羧基端部分序列的宿主細胞。宿主和載體編碼的片段各自均無酶活性

12、，但它們可以互補形成具有活性的各自均無酶活性，但它們可以互補形成具有活性的-半乳半乳糖苷酶，使人工底物糖苷酶，使人工底物X-gal轉(zhuǎn)化成藍色的代謝產(chǎn)物，出現(xiàn)藍轉(zhuǎn)化成藍色的代謝產(chǎn)物，出現(xiàn)藍色的菌落。如果在多克隆位點上插入外源色的菌落。如果在多克隆位點上插入外源DNA片段，將使片段，將使lac Z基因滅活，不能生成有活性的基因滅活，不能生成有活性的-半乳糖苷酶，結(jié)果菌半乳糖苷酶，結(jié)果菌落呈現(xiàn)白色。落呈現(xiàn)白色。第23頁/共39頁第二十四頁，共40頁。 互補互補(h b)(h b)篩選（藍篩選（藍- -白篩選）白篩選） 第24頁/共39頁第二十五頁，共40頁。第25頁/共39頁第二十六頁，共40頁。P

13、CR產(chǎn)物的T載體(zit)克隆和轉(zhuǎn)化 第26頁/共39頁第二十七頁，共40頁。第27頁/共39頁第二十八頁，共40頁。第28頁/共39頁第二十九頁，共40頁。質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmidplasmid） 是存在是存在(cnzi)(cnzi)于細菌染色體外的小型環(huán)狀于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈雙鏈DNADNA 分子。大小約為分子。大小約為 數(shù)千堿基對。常數(shù)千堿基對。常 有有1 31 3個抗藥個抗藥 性基因，以利于性基因，以利于 篩選。篩選。第29頁/共39頁第三十頁，共40頁。質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體(zit)(zit)克隆克隆(k ln)(k ln)的質(zhì)粒載體的質(zhì)粒載體 允許外源的允許外源的DNADNA

14、插入，儲存。主要插入，儲存。主要是是DNADNA水平上的操作。水平上的操作?；虮磉_的質(zhì)粒載體基因表達的質(zhì)粒載體 允許外源允許外源DNADNA的插入、儲存和表達的插入、儲存和表達。第30頁/共39頁第三十一頁，共40頁。第31頁/共39頁第三十二頁，共40頁。第32頁/共39頁第三十三頁，共40頁。載體結(jié)構(gòu)的三大要素：載體結(jié)構(gòu)的三大要素： 多克隆位點多克隆位點 選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記(bioj)（耐藥性（耐藥性，LacZ） 獨立的復(fù)制單位獨立的復(fù)制單位第33頁/共39頁第三十四頁，共40頁。pGEM-T 載體載體(zit)的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)第34頁/共39頁第三十五頁，共40頁。第35頁/共39頁第三十六頁，共40頁。第36頁/共39頁第三十七頁，共40頁。第37頁/共39頁第三十八頁，共40頁。第38頁/共39頁第三十九頁，共40頁。NoImage內(nèi)容(