利用實(shí)時(shí)定量PCR和△△CT法分析基因相對(duì)表達(dá)量

1、利用實(shí)時(shí)定雖PCR和2ACT法分析基因相對(duì)表達(dá)雖METHODS 25, 402 408 (2001)Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative_. . _. . . 一 CT _ _ _ .PCR and the 2 Method?,1Kenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen*Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and? Department ofPharmaceutical Scienc

2、es, College of Pharmacy,Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534摘要：現(xiàn)在最常用的兩種分析實(shí)時(shí)定量 PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方法是絕對(duì)定量和相對(duì)定量。 絕對(duì)定量通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算起始棋板的拷貝數(shù)；相對(duì)定量方法則是比較經(jīng)過(guò)處理 的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異。ACT方法是實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)中分析基因表達(dá)相對(duì)變化的一種簡(jiǎn)便方法，即相對(duì)定量的一種簡(jiǎn)便方 法。本文介紹了該方法的推導(dǎo)，假設(shè)及其應(yīng)用。另外，在本文中我們還介紹了兩 種卜ACTffi生方法的推導(dǎo)和應(yīng)用，它們?cè)趯?shí)時(shí)定量 PCR數(shù)據(jù)分析中可

3、能會(huì)被用 到。關(guān)鍵詞：反轉(zhuǎn)錄PCR定量PCR相對(duì)定量 實(shí)時(shí)PCR Taqman反轉(zhuǎn)錄PCR （RT-PCR ）是基因表達(dá)定量非常有用的一種方法（1 - 3 ）。實(shí)時(shí) PCR技術(shù)和RT-PCR的結(jié)合產(chǎn)生了反轉(zhuǎn)錄定量 PCR技術(shù)（4 ,5 ）。實(shí)時(shí)定量PCR 的數(shù)據(jù)分析方法有兩種：絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量一般通過(guò)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線 來(lái)確定我們所感興趣的轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)；相對(duì)定量方法則是用來(lái)確定經(jīng)過(guò)不同處 理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時(shí)相的表達(dá)差異。絕對(duì)定量通常在需要確定轉(zhuǎn)錄本絕對(duì)拷貝數(shù)的條件下使用。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行絕對(duì)定量已有多篇報(bào)道（6 - 9 ），包括已發(fā)表的兩篇研究論文

4、（10,11 ）。在 有些情況下，并不需要對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行絕對(duì)定量，只需要給出相對(duì)基因表達(dá)差異即 可。顯然，我們說(shuō)X基因在經(jīng)過(guò)某種處理彳爰表達(dá)量增加 2.5倍比說(shuō)該基因的表 達(dá)從1000拷貝/細(xì)胞增加到2500拷貝/細(xì)胞更加直觀。用實(shí)時(shí)PCR對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析需要特殊的公式、假設(shè)以及對(duì)這些假設(shè)的驗(yàn)證。卜心方法可用于定量PCR實(shí)驗(yàn)來(lái)計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)變化：2%ACT 公式的推導(dǎo)，以及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，有效性評(píng)估在Applied Biosystems User BulletinNo.2 （P/N4303859）中有介紹。用卜ACT方法分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)在文獻(xiàn)中也有報(bào)道(5,6)。本文介紹了該方法的推導(dǎo)、

5、假設(shè)以及應(yīng)用。另外，本文還介紹了2CT兩種衍生方法的推導(dǎo)和應(yīng)用，它們?cè)趯?shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)分析中都可能被用到。1.2冬方法1.1.2A"方法的推導(dǎo)PCR指數(shù)擴(kuò)增的公式是：& = ¥ X (1 + £x)°II12C T,X是目標(biāo)分子擴(kuò)增達(dá)到閾值時(shí)的這里，Xn是第n個(gè)循環(huán)彳爰目標(biāo)分子數(shù)，X0是初始目標(biāo)分子數(shù)，Ex是目標(biāo)分子擴(kuò) 增效率，n是循環(huán)數(shù)，Ct代表目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。因此：-.I -；"Xt是目標(biāo)分子達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)的分子數(shù)。 循環(huán)數(shù)。K是一個(gè)常數(shù)。對(duì)丁內(nèi)參反應(yīng)而言，也有同樣的公式：/?T = X (1 + Br)

6、'工R = Rr.k|4用Xt除以Rt得到：& & X (1 + Er戶RKr對(duì)丁使用Taqman探針的實(shí)時(shí)擴(kuò)增而言，Xt和Rt的值由一系列因素決定：包 括探針?biāo)鶐У臒晒鈭?bào)導(dǎo)基團(tuán)、探針序列對(duì)探針熒光特性的影響、探針的水解效率 和純度以及熒光閾值的設(shè)定。因此常數(shù) K并不一定等丁 1。假設(shè)目標(biāo)序列與內(nèi)參序列擴(kuò)增效率相同：萼 x (1 += K、Ko151或:林 x(1 + 目g = k6Xn代表經(jīng)過(guò)均一化處理過(guò)的初始目標(biāo)分子量； C T表示目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因Cr 值的差異(Ct,x G,r)整理上式得：Mi = Kx (1 + E)-ACt.7最后用任一樣本q的Xn除以參照

7、因子(calibrator, cb )的Xn得到：知 _KX(1+E)-皿6|8商TKX (1 +"&"1 + 旦 '【81在這里一- 1- 一 ：.一。一 "對(duì)丁一個(gè)少丁 150bp的擴(kuò)增片斷而言，如果 Mg2+濃度、引物都進(jìn)行了適當(dāng)?shù)膬?yōu) 化，擴(kuò)增效率接近丁 1。因此目標(biāo)序列的量通過(guò)內(nèi)均一化處理之后相對(duì)丁參照因子而言就是：1.2. 2 A ACT方法的假設(shè)和應(yīng)用要使 CT計(jì)算方法有效，目標(biāo)序歹0和內(nèi)參序歹0的擴(kuò)增效率必須相等?？磧蓚€(gè) 反應(yīng)是否具有相同的擴(kuò)增效率的方法是看他們模板濃度梯度稀釋彳爰擴(kuò)增產(chǎn)物 CT如何變化。, | . . , -N li

8、lutionl-K-. I, V Hi I Liieii . hi ： i. j i! ii i- Anij .Id ： ,! n I 1 "N A.svnthesizrd from different amounts of RNA. The efficiency of amplifi cution of the targetand irttcrruil control H.-API)H) wasCKamincij using rca t jin( Pl R ,t-id I l'kjMclji lIctvc!L'.in Um。二 wtqitsl trajisrripl

9、ase, cDNA wi、s'iith<Lsipd from 】/ig toll RNA isolated from himian Ritji cc-lis ial dilutjons ( 3i - .nrij ilifi+'d hrrfil-tiine PCR using gerwspec it'k pi infers- The mast concentrated .<LJ i. - .，. 111 & I ” I i【'X LI I h，L i j I : rnTd R.A i r A ' (C nr-noT Chaftfh) w

10、as cajculatcd for each cDNA dilution The data a t 11 I: i js-hir, ' .I'-t *'-.y j 1.11 >. jjh ,i| i f _ i ir i i iNtiK si IA = 圖1顯示的是cDNA樣品在100倍稀釋范圍內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)于每一個(gè)稀釋樣 本，都用GAPDH日c-myc特異的熒光探針及引物進(jìn)行擴(kuò)增。計(jì)算出 c-myc和 GAPDH勺平均G值以及值，通過(guò)cDNA濃度梯度的log值對(duì)Ct值作圖，如 果所得直線斜率絕對(duì)值接近于 0,說(shuō)明目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增效率相同，就 可以通過(guò)

11、CT方法進(jìn)行相對(duì)定量。在圖1中，直線斜率是0.047,因而假設(shè)成 立， ACT方法可以用來(lái)分析數(shù)據(jù)。如果兩個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)效率不同，則需要通過(guò) 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線和絕對(duì)定量的方法來(lái)進(jìn)行相對(duì)定量；或者也可以重新設(shè)計(jì)引物，優(yōu) 化反應(yīng)條件使得目標(biāo)序列和內(nèi)參序列具有相同的擴(kuò)增效率。1.3. 2A ACT內(nèi)標(biāo)和參照因子的選擇使用內(nèi)標(biāo)基因的目的是為了對(duì)加入到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的RNA進(jìn)行均一化處理。標(biāo)準(zhǔn)的看家基因一般都可被用作內(nèi)標(biāo)基因。適合于實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)內(nèi)標(biāo)基因包括GAPDH 6 -actin , 6 2-microglobulin以及rRNA。當(dāng)然，其它的看家基因也同樣能被用作內(nèi)標(biāo)。我們推薦在應(yīng)用某一基因作為內(nèi)標(biāo)之前首

12、先確證該基因的表 達(dá)不會(huì)受實(shí)驗(yàn)處理的影響。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)處理是否對(duì)內(nèi)標(biāo)基因表達(dá)產(chǎn)生影響的方法在 2.2部分有描述。卜HT方法中參照因子的選擇決定于基因表達(dá)定量實(shí)驗(yàn)的類型。最簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)就 是把未經(jīng)處理的樣品作為參照因子 (calibrator )。經(jīng)內(nèi)標(biāo)基因均一化處理彳爰， 通過(guò)方法計(jì)算，目標(biāo)基因表達(dá)差異通過(guò)經(jīng)過(guò)處理的樣本相對(duì)于未經(jīng)處理的樣本的 倍數(shù)來(lái)表示。對(duì)于未經(jīng)處理的參照樣，MM t=0,而20=1。所以根據(jù)定義，未處 理樣本的倍數(shù)變化為1。而對(duì)于那些經(jīng)過(guò)處理的樣本，相對(duì)于參考因子基因表 達(dá)的倍數(shù)為卜ht。同樣的分析也可用于不同時(shí)相的基因表達(dá)差異，在這種情況 下，一般選0時(shí)刻的樣本作為參照因子。有

13、些情況下，并不是比較不同處理樣本基因表達(dá)差異。 例如，有的是想看某一器 官中特定mRNA的表達(dá)。在這種情況下，參照因子可能是另一器官中該 mRNA的 表達(dá)。表1顯示了大腦和腎臟總 RNA中c-myc和GAPDH專錄本的CT值。在這 一個(gè)例子中，大腦被人為的選擇為參照因子，通過(guò)計(jì)算得到腎臟c-myc表達(dá)量經(jīng)GAPDHJ正彳爰相對(duì)于大腦的表達(dá)量的結(jié)果。盡管相對(duì)定量方法可用于這種組 織之間的比較，但結(jié)果的生物學(xué)解釋是相當(dāng)復(fù)雜的。 不同種類細(xì)胞中目標(biāo)和參照 轉(zhuǎn)錄本單一的相對(duì)量變化可能在任何特定的組織中都存在。TABLE 1TrRiEifirni n4 die Data Wlw” and Rtfr An

14、1 Mifdldkd in 判響蝴 W?IhFTlwc ffltr Cjf.AlW(VACi 眺呷 r me <1 - AW GAPDH Ctm "Ma. m i抻Mirulwd r mrlinZ3 7DZ3L5«踞47明昭2!$歸30 43跨6S91)44 = 41N 型 m 0 OHii K z Q1T1J INI - »i fc 7i & fu v i k iKJdnsvZ7 0622梅£J 0322.tlM ili aIV 10A wiBAI粉熟K n27(13 = 006UM = OU<_ir z u.l仆50 - 0SA

15、(5 1 ft 5TtoM RNA Chun hwwn brain alMl Uftrny舟 w punrhavd fnm c Bmarh L nrvm» trawriptaa eDNA ws vynrUwlAMl frm I “ EntiiS KNA A4kpwl 哦 «t r：|iNA wn? iiwt aitw vwl4klTV RC 區(qū) rtsirl lorn rooUii n喂導(dǎo).twr prlra*rs sweI prvto far C-flyr cr jrdimor*and pretw IW QWH :Kfeth frarEfem gni-md eDNA Wr

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19、1.L'| -I Lir. L !：m e "- It 1 'I v«h n L'1 hw «k Th> HBV.U t « 1 Ji I ItuM1 teFU HIl! IktAH HuAtfwd iMlilHklli CAfaulfLiicn lor ktu kiftd tharuii 噂 廠4 斯 itdjLk bax)1.4. 2 A HT方法的數(shù)據(jù)分析實(shí)時(shí)定量PC晰得到CT值可以很容易的輸出到表格程序如 Microsoft Excel 中 去。為了顯示數(shù)據(jù)分析過(guò)程，我們?cè)谶@里給出了一個(gè)基因表達(dá)定量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和 樣本

20、歹0表。通過(guò)6-actin 均一化處理，我們對(duì)目標(biāo)基因fos-glo-myc 的表達(dá)變 化進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。在8h的時(shí)間范圍內(nèi)，在每一時(shí)間點(diǎn)都取3個(gè)重復(fù)樣本，每一樣 本在cDNA合成之彳爰都做定量PCR,數(shù)據(jù)分析用到了公式9,即：aiiioitnt of taiget = 2-AAC r|9|-actin 校正后1倍量的目標(biāo)基因Time x表示任意時(shí)間點(diǎn)，Time 0表示經(jīng) 表達(dá)。0時(shí)刻目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的平均 G （見圖2第8欄）被用丁公式9中。通過(guò) 公式9計(jì)算出每一個(gè)樣本目標(biāo)基因表達(dá)通過(guò) 6 -actin 均一化處理彳爰相對(duì)丁 0 時(shí)刻的倍數(shù)（見圖2第9欄）。平均SD, CV由每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)所取的

21、三個(gè)重復(fù) 樣求得。用這種分析方法，在0時(shí)刻的平均倍數(shù)變化接近于1。我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)檢 測(cè)在0時(shí)刻平均倍數(shù)變化是否為1可以很方便的驗(yàn)證三個(gè)重復(fù)樣品之間是否 有錯(cuò)誤或者誤差。如果得到的結(jié)果與1偏差很大，則表明存在計(jì)算錯(cuò)誤或者是很 Hj的實(shí)驗(yàn)誤差。在前面的例子中，在每一時(shí)間點(diǎn)上分別取了三個(gè)獨(dú)立的RNA樣本進(jìn)行了分析。因此對(duì)每一個(gè)樣本分別處理，通過(guò)計(jì)算彳爰取結(jié)果的平均值就非常重要。如果是同 一樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增的重復(fù)，這就需要首先求出平均 CT,然彳爰再進(jìn)行 計(jì)算。 怎么樣計(jì)算平均值就要看目標(biāo)基因和內(nèi)參基因是在同一個(gè)管子中擴(kuò)增還是在不 同的管子中擴(kuò)增。表1給出了目標(biāo)基因（c- myc ）和內(nèi)參基因（GAP

22、DH在不 同管中擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在這里不應(yīng)該把任一單個(gè)的 c-myc管子和GAPDH管子 作比較，而應(yīng)該分別計(jì)算出c-myc和GAPDH的平均G來(lái)計(jì)算 Ct。重復(fù)實(shí)驗(yàn) 中G值的估計(jì)偏差通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)計(jì)算轉(zhuǎn)化成最彳爰結(jié)果中相對(duì)量的變化。但其 中的一個(gè)難點(diǎn)是Ct值與相應(yīng)的拷貝數(shù)成指數(shù)關(guān)系（見第 4部分），因此，在最 彳爰的計(jì)算中，的誤差通過(guò)t加上標(biāo)準(zhǔn)偏差和（： t減去標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)評(píng)估， 這就使得求得的數(shù)值相對(duì)于平均值呈不對(duì)稱分布。不對(duì)稱分布是因?yàn)榻Y(jié)果經(jīng)指數(shù)處理彳爰轉(zhuǎn)化成量的線性比較造成的。通過(guò)不同熒光染料標(biāo)記的探針，我們可以在同一管中同時(shí)擴(kuò)增目標(biāo)序列和內(nèi)標(biāo)序 列。表2給出了目標(biāo)基因（c- my

23、69;和內(nèi)標(biāo)基因（GAPDH在同一管中擴(kuò)增的實(shí) 驗(yàn)數(shù)據(jù)。對(duì)于任意一個(gè)管子，目標(biāo)基因（c- myc ）和內(nèi)參基因（GAPDH擴(kuò)增時(shí) 加入的cDNA量都是一樣多的，所以可以分別對(duì)每個(gè)管子計(jì)算AC t值，這些值取 平均后再進(jìn)行計(jì)算。在這里估計(jì)誤差值也是一個(gè)不對(duì)稱的范圍，反映了誤差經(jīng)指數(shù)處理轉(zhuǎn)化為線性差異。在表1和表2中，估計(jì)誤差在從AC t到的計(jì)算中未見有增加，這是因?yàn)?我們把參照基因和檢測(cè)基因的誤差都顯示出來(lái)了。我們把CT, cb當(dāng)作一個(gè)人為設(shè)定的常數(shù)來(lái)減去，得到 ACT。這樣得到的結(jié)果就與圖2所顯示的在求平 均之前對(duì)不同重復(fù)樣本分別通過(guò)各自的 CT值求實(shí) 所得結(jié)果 相當(dāng)。另一種方 法是將參照基因

24、當(dāng)作沒有任何誤差的1倍的量，在這種情況下，平均T,cb的誤差值被引入到每一樣本的t中。在表1中，腎臟中（: t變成-2.50 土0.20 而經(jīng)過(guò)校正的c-myc量是5.6倍，范圍從4.9到5.6 。而在大腦中的結(jié)果是 沒有誤差的1倍。IAULL ZTi ! Ill |Lb I |E id L I i II ! I W| - I I T I I,' .i » IM i| J iEi- I i . d i. Hl IH % | 時(shí)r jffjvrAC| 俊,r et 瑋 MC'iNornruiliiMl cdnir amminlr®c 1AiVCf)標(biāo)R Z U

25、kNrfllatlwm br聞 2-4 .KiilnyAvryIZ1Z3A Ofl JS M 34 .13£S器tki'時(shí)IfIT2H.73JI24 細(xì)£4247 03 A H-l? I?S l 二 <> 16 434524«|«524.524J7 * 1LI4“偈 O- S.lliJ ri II hM I I ili i - 0 W |. I |fH-r iri b rihi« a I jrf'i- I |« I： ' . |H Nj. ! , f ! I r .“ u ，： i 】卜. . i

26、1 | i .% i -i « k j< -， 心 |CAFDH Thft fMMMNMMl wlU*b llto FAkl and lb# fMtal tt BAPfSH wns LstalM wMBdy* JQLmaw of IJ1# diHrtwfil gpsrtBTtk MHlniB1 PCRfar MpnM GATCH CM M-Mm ClioqgRi ttltt Miumjei miweUm Lil Um1 miuw rJl.2. 2 言方法2.1.2、f方法的推導(dǎo)通過(guò)內(nèi)標(biāo)RNA可以對(duì)加入RNA的量的差異進(jìn)行校正。卜ht方法的數(shù)據(jù)分析的 一個(gè)特點(diǎn)就是能夠利用實(shí)時(shí)PC

27、R實(shí)驗(yàn)的一部分?jǐn)?shù)據(jù)來(lái)完成這種校正。在其它的 方法不能定量初始RNA量的時(shí)候：例如，在能得到的RNA量非常有限的時(shí)候或 者需要處理高通量的樣品的時(shí)候， 這一方法的優(yōu)勢(shì)就格外明顯。當(dāng)然我們也可以 利用PCR實(shí)驗(yàn)以外的方法來(lái)完成這種校正。最常用的一種方法就是用紫外吸收 來(lái)確定用丁 cDNA合成的RNA量，然彳爰將相同的RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA用丁 PCR定量反應(yīng)。這種外標(biāo)法校正的一個(gè)應(yīng)用例子就是研究某種實(shí)驗(yàn)處理是否影響 內(nèi)標(biāo)基因的表達(dá)。在這里，目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)合二為一。在這個(gè)例子中，公式2不 被公式3除，公式5 變成："(1 + &)% = &110整理得：名=版x H +

28、 Ex）g為任一樣品Xo,q除以參照品Xo,cb得：|11|勰=斜滋=，51121在這里 CT = G, q-CT,cb o A Cy T與前面計(jì)算中用的ZXC T （用目標(biāo)基因G值減去參 照基因G值）相互區(qū)別。就象在1.1部分所描述的，如果條件優(yōu)化較好，效率接近丁 1,內(nèi)標(biāo)相對(duì)丁參照 因子為：Z-AG.|132.2. 2 一胃方法的應(yīng)用2一HT '方法的一個(gè)應(yīng)用就是確定實(shí)驗(yàn)處理對(duì)某一候選內(nèi)標(biāo)基因的影響。為了顯示 這一過(guò)程，我們做了血活饑餓/誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)（7）。血活饑餓/誘導(dǎo)是研究某些mRNA 降解的常用方法（8）。然而，血活可能影響一些基因的表達(dá)包括標(biāo)準(zhǔn)的看家基 因的表達(dá)。在24-h血活

29、饑餓培養(yǎng)之彳爰，在 NIH 3T3細(xì)胞中加入15%血活誘導(dǎo)基因表達(dá)。 從細(xì)胞中提取Poly（A） +RNA，并將之反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用SYBRGreen通過(guò)實(shí) 時(shí)定量 PCR檢測(cè) GAPDH 6 2 -microglobulin cDNA 的量。GAPDHK 6 2 -microglobulin各自的相對(duì)量通過(guò)2一官丁'公式求得。細(xì)胞處理對(duì)丁 GAPDH勺基因表達(dá)有明顯影響，但對(duì) 6 2 -microglobulin沒有什么影響。因此 6 2-microglobulin很適合做血活刺激定量實(shí)驗(yàn)的內(nèi)標(biāo)，而 GAPDH1不適合。這一例子向大家展示了在只研究一個(gè)基因的時(shí)候怎么用2一A&qu

30、ot;'的方法分析基因相對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)。3. 實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)時(shí)PCR最終分析的是閾值循環(huán)或 G。G值通過(guò)PCR信號(hào)的對(duì)數(shù)值和循環(huán)數(shù)來(lái)確定。因此 G值是一個(gè)指數(shù)而非線性概 念。因此，在任何統(tǒng)計(jì)分析中都不要用原始的G值來(lái)表示結(jié)果。正如我們?cè)谇拔闹兴枋龅囊粯樱琍CR相對(duì)量通常和內(nèi)標(biāo)和參照樣本一起計(jì)算而很少直接用 CT值來(lái)表示，除非我們想檢驗(yàn)重復(fù)樣本之間的差別。為了向大家顯示這一點(diǎn)，我 們用SYBR Green通過(guò)real-time PCR 來(lái)檢測(cè)相同cDNA的96個(gè)重復(fù)反應(yīng)。所 有反應(yīng)組分在同一管中混好彳爰分裝到 96個(gè)管中，做實(shí)時(shí)PCR分析，得到了每 一個(gè)樣本的C T值。為了比

31、較樣品問(wèn)變化，計(jì)算了 96個(gè)樣本的平均土 SD如 果通過(guò)原始 G值計(jì)算，平均 土 SD是20.00 土 0.193 , CV為0.971%。但是如果 把原始G值用2 -CT轉(zhuǎn)化成線性形式，平均土 SD是9.08 X 10-7 土 1.33 X 10-7, CV為13.5 %從這個(gè)簡(jiǎn)單的例子我們可以看出，通過(guò)原始G值來(lái)反映變化是錯(cuò)誤的，應(yīng)該避免。用2 CT將單個(gè)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成線性形式來(lái)說(shuō)明重復(fù)樣本之間的變化 和差異更準(zhǔn)確可靠。4. 結(jié)論實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析可以采用相對(duì)定量和絕對(duì)定量?jī)煞N方法，研 究人員在設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)分析基因表達(dá)的時(shí)候首先要問(wèn)的一個(gè)問(wèn)題就 是：數(shù)據(jù)最彳爰會(huì)以一個(gè)什

32、么樣的形式得到。如果需要知道絕對(duì)的拷貝數(shù)，就必須用絕對(duì)定量的方法，否則只需要給出基因表達(dá)相對(duì)量就足夠了。相對(duì)定量可能比絕對(duì)定量要更容易一些，因?yàn)樗恍枰鳂?biāo)準(zhǔn)曲線。本文所給出的公式對(duì)于每個(gè)用相對(duì)定量的方法分析基因表達(dá)差異的研究人員都足夠了。下面，我們總結(jié)一下實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和評(píng)估中的一些重要步驟：選擇一個(gè)內(nèi)標(biāo)基因。確定內(nèi)標(biāo)的有效性，確保它不會(huì)受到實(shí)驗(yàn)處理的影響。通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因RNA或cDNA的一系列梯度稀釋棋板確保它 們的擴(kuò)增效率相同。最彳爰通過(guò)2*CT計(jì)算將統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成線性形式而不是原始G值。參考文獻(xiàn)1. Murphy, L. D., Herzog, C. E., Rudick, J. B., Fojo, A. T., and