3種植物粗提物對(duì)6種植物病原菌抑菌活性研究

1、    3種植物粗提物對(duì)6種植物病原菌抑菌活性研究    劉曉輝 呂國(guó)忠 楊紅 李季蓉 李林翰 王劍釗摘要：試驗(yàn)研究了平枝構(gòu)子（cotoneaster horizontalis）、蒼耳（xanthium sibiricum）、花椒（zanthoxylum bun-geanum）3種植物粗提物對(duì)玉米彎孢菌（curvularia lunata）、向日葵菌核（sclerotinia sclerotiorum）、人參灰霉（botrytis cinerea）、人參黑斑（alternaria panaz）、瓜果腐霉（pythium aphanidermatum）、辣

2、椒疫霉（phytophthoraca psici）6種植物病原菌的抑菌活性。結(jié)果表明：平枝構(gòu)子和蒼耳粗提物對(duì)6種病原菌均有較好抑菌效果，其中平枝構(gòu)子和蒼耳對(duì)人參灰霉菌抑菌活性較明顯，抑菌率分別為89.87%和83.54%?；ń烦龑?duì)人參灰霉有一定的抑菌效果外，對(duì)其它5種病原菌均存在一定程度上的促生長(zhǎng)作用。關(guān)鍵詞：植物粗提物;抑菌活性;病原真菌：s482.2 ：a ：1674-9944（2019）22-0177-041 引言植物病害是造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)作物損失的重要原因之一，而真菌是引起各類植物病害的重要病原物之一。目前為了提高作物生產(chǎn)力和質(zhì)量，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)依然無法擺脫對(duì)化肥和農(nóng)藥的依賴1。近年來，西方國(guó)家

3、已經(jīng)禁止大量使用合成農(nóng)藥，因其具有高毒性、急性毒性、需要長(zhǎng)期降解期、毒素在食物鏈中累積等問題，過度使用和濫用農(nóng)用化學(xué)品對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，隨著人們環(huán)保意識(shí)和食品安全意識(shí)的提升，人們對(duì)安全、有效的農(nóng)藥替代品需求日益增加2，而植物源抑菌農(nóng)藥已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)。本試驗(yàn)以平枝構(gòu)子、蒼耳、花椒果實(shí)粗提物為研究對(duì)象，對(duì)生產(chǎn)上常見6種作物病害：玉米彎抱菌葉斑病、向日葵菌核病、人參灰霉病、人參黑斑病、瓜果腐霉病和辣椒疫霉病的病原菌的抑菌作用展開研究，為后期活性物質(zhì)的分離提純提供理論基礎(chǔ)。2 材料與方法2.1 供試材料平枝栒子果實(shí)采集于大連民族大學(xué)校園內(nèi)，采集后裝入無菌袋中帶回實(shí)驗(yàn)室并清洗處理，4冰箱保

4、存3;花椒和蒼耳果實(shí)購(gòu)買于學(xué)校附近藥店。供試植物病原菌：玉米彎抱菌（curvularia luna-ta）、向日葵菌核（sclerotinia sclerotiorum）、人參灰霉（botrytis cinerea）、人參黑斑（alternaria panax）、瓜果腐霉（pythium aphanidermatum）、辣椒疫霉（phytoph-thora capsici）6種植物病原菌均由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌實(shí)驗(yàn)室提供。2.2 供試培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（pda）用于活化菌株及其他供試病原真菌的活化和抑菌活性測(cè)定。2.3 主要儀器及試劑dhg-9147a電熱恒溫干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限

5、公司;kg-sx-500蒸汽滅菌器：kagoshi-ma seisakusyo inc;ev923mf7-nrh微波爐：廣東美的廚房電器制造有限公司;c21-sdhcb39電磁爐：浙江蘇泊爾股份有限公司;vs-1300l-u超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司：rh62k6151s8/sc冰箱：蘇州三星電子有限公司;rxz-280b智能人工氣候箱：寧波江南儀器廠;me203e/02電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司等。無水乙醇、蒸餾水、石油醚、冰醋酸、土豆、葡萄糖、瓊脂等。2.4 試驗(yàn)方法2.4.1植物粗提物的制備分別稱取研磨成粉末狀的蒼耳、平枝構(gòu)子、花椒果實(shí)各200g于500ml三

6、角燒瓶中，每個(gè)瓶中分別加入200ml去離子水、200ml石油醚200ml無水乙醇，用封口膜密封且做好標(biāo)記后放入120r/min轉(zhuǎn)速的搖床內(nèi)，震蕩3d（見表1）4。每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。3d后將混合液分別用紗布過濾到棕色收集瓶?jī)?nèi)并做好標(biāo)記（標(biāo)記見表1），同時(shí)將過濾后的固體殘留物繼續(xù)放回原三角瓶?jī)?nèi)，加入150ml原提取液以相同轉(zhuǎn)速搖床震蕩2d;2d后將各混合液分別用紗布過濾到相應(yīng)棕色收集瓶?jī)?nèi)，同時(shí)將過濾后的固體殘留物繼續(xù)放回原三角瓶?jī)?nèi)，加入150ml原提取液以相同轉(zhuǎn)速搖床震蕩1d;1d后將各混合液按照上述方法分別提取到指定收集瓶?jī)?nèi)。3種植物浸提液分別放到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去離子水設(shè)置溫度80，無水

7、乙醇設(shè)置溫度70，石油醚設(shè)置溫度40，得到膏狀物稱質(zhì)量。用乙醇定容0.005g/ml，4冰箱低溫保存。樣品旋轉(zhuǎn)增發(fā)后膏狀物質(zhì)量，見表2。2.4.2 抑菌活性試驗(yàn)用打孔器（直徑0.5cm）在培養(yǎng)710d的植物病原菌培養(yǎng)皿內(nèi)打孔，然后分別轉(zhuǎn)入到混有植物粗提物（濃度為0.005g/ml）的培養(yǎng)基中并做好標(biāo)記，設(shè)立對(duì)照組。菌絲生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。3 結(jié)果與分析3.1 不同萃取溶劑對(duì)3種植物粗提物萃取率的影響由表2可知：去離子水對(duì)蒼耳的提取率最高，萃取率達(dá)到1.15%，乙醇次之，石油醚最低;乙醇對(duì)平枝栒子的提取率最高，萃取率達(dá)

8、到1.01%，去離子水次之，石油醚最低;去離子水對(duì)花椒的提取率最高，達(dá)到1.185%，乙醇次之，石油醚最低。綜合以上結(jié)果，本試驗(yàn)選擇去離子水作為蒼耳和花椒萃取溶劑，選擇無水乙醇作為平枝栒子作為萃取溶劑。3.2 抑菌活性鑒定結(jié)果3.2.1 3種植物粗提物對(duì)玉米彎孢菌葉斑病菌的抑菌活性由圖1可知：去離子水萃取的蒼耳粗提物和去無水乙醇萃取的平枝拘子粗提物對(duì)玉米彎孢菌有顯著的抑菌效果，其中平枝栒子抑菌活性最好，達(dá)到75.34%;蒼耳抑菌活性達(dá)68.49%;而去離子水萃取的花椒粗提物對(duì)玉米彎孢菌葉斑病菌沒有抑菌活性，且試驗(yàn)中粗提物對(duì)玉米彎孢菌的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用。3.2.2 3種植物粗提物對(duì)向日葵菌核病

9、菌的抑菌活性研究由圖2可知：無水乙醇萃取的平枝栒子粗提物對(duì)向日葵菌核病菌抑菌活性最好，達(dá)到81.69%;去離子水萃取的蒼耳粗提物對(duì)向日葵菌核病菌抑菌率達(dá)到46.47%;而去離子水萃取的花椒粗提物抑菌效果為負(fù)值，即花椒內(nèi)某些物質(zhì)促進(jìn)了向日葵菌核病菌的生長(zhǎng)繁殖，促生長(zhǎng)率達(dá)到16.9%。3.2.3 3種植物粗提物對(duì)人參灰霉病菌的抑菌活性研究由圖3可知：無水乙醇萃取的平枝栒子粗提物抑菌活性最好，達(dá)到89.87%;去離子水萃取的蒼耳粗提物抑菌率達(dá)到83.54%，略次于平枝栒子;去離子水萃取的花椒粗取物對(duì)人參灰霉有一定的抑菌活性，抑菌率為20.25%。結(jié)果表明：平枝栒子和蒼耳的粗提物對(duì)人參灰霉生長(zhǎng)有明顯抑

10、制活性，花椒粗提物對(duì)人參灰霉病菌抑菌效果不顯著。3.2.4 3種植物粗提物對(duì)人參黑斑抑菌活性研究由圖4可知：無水乙醇萃取的平枝栒子粗提物對(duì)人參黑斑病菌抑菌效果最好，達(dá)到73.01%;去離子水萃取的蒼耳粗提物對(duì)該病菌的抑菌率為39.68%;而去離子水萃取的花椒粗取物對(duì)人參黑斑病菌有促生長(zhǎng)作用，促生長(zhǎng)率為15.87%。3.2.5 3種植物粗提物對(duì)瓜果腐霉的抑菌活性研究由圖5可知：無水乙醇萃取的平枝栒子粗提物對(duì)瓜果腐霉菌抑菌活性達(dá)到69.81%;去離子水萃取的蒼耳粗提物對(duì)該菌的抑菌率為52.63%;而去離子水萃取的花椒粗提物對(duì)瓜果腐霉無抑制作用，反而促進(jìn)該菌生長(zhǎng)，且促生率為52.83%。3.4.6

11、3種植物粗提物對(duì)辣椒疫霉菌的抑菌活性研究由圖6可知：無水乙醇萃取的平枝拘子粗提物對(duì)辣椒疫霉有顯著的抑菌效果，抑菌率達(dá)到75.00%;去離子水萃取的蒼耳粗提物對(duì)該菌也有較顯著抑菌效果，抑菌率達(dá)到65.38%;而去離子水萃取的花椒粗取物對(duì)辣椒辣椒疫霉菌存在促生長(zhǎng)作用，且促生率達(dá)到了59.61%。4 結(jié)論與討論植物次生物質(zhì)的抑菌作用的研究是現(xiàn)階段植物源抑菌農(nóng)藥開發(fā)的重要方向。本研究表明：平枝拘子和蒼耳粗提物抑菌普遍較廣，平枝拘子粗提物對(duì)6種植物病原菌抑菌率均達(dá)到69%以上，其中對(duì)人參灰霉病菌的抑菌率高達(dá)89%;蒼耳對(duì)人參灰霉抑菌率達(dá)到83%以上。由此可見，以上2種植物中均含有一定的農(nóng)用抗菌成分，可作

12、為兩種潛在的植物源農(nóng)藥開發(fā)資源對(duì)其穩(wěn)定性、抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行深入研究。此外，研究中發(fā)現(xiàn)花椒除對(duì)人參灰霉病菌具有一定抑菌作用，對(duì)其它病原菌均有促進(jìn)生長(zhǎng)作用，對(duì)瓜果腐霉、辣椒疫霉菌促生長(zhǎng)率達(dá)到50%以上。陸寧海等研究發(fā)現(xiàn)花椒在甲醇、乙醇、丙酮和二甲苯4種不同溶劑提取物對(duì)水稻紋枯病菌、番茄早疫病菌、大蔥紫斑病菌和棉花枯萎病菌4種植物病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用存在顯著差異，其中甲醇的提取物抑菌活性最低5。而本研究中采用去離子水作為提取溶劑，其粗提物對(duì)所研究的參試6種病原菌中的5種具有促生作用，說明不同的溶劑提取的花椒粗提物的活性物質(zhì)存在顯著差異且復(fù)雜，需要根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際選擇合適的萃取溶劑，以便獲得所期活性物質(zhì)。本研究結(jié)果表明，從植物源生防抑菌活性物質(zhì)角度，盡量避免使用去離子水作為花椒萃取溶劑，以減少促生成分對(duì)抑菌效果的不良影響。參考文獻(xiàn)：1周汛，李桂明.10種中藥的不同制劑對(duì)常見致病菌體外抗菌活性研究j.中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（2）：237239.2bertschinger hu，nief v，tsch？ pe h.active oral immunizationof suckling piglets to prevent colonization afterweaning by entero-toxigenic escherichia coli with fimbr