近代生物學研究技術

1、1三親本雜交：實驗中，將供體菌、協(xié)助菌與受體菌混合起來，使菌體細胞緊密接觸，供體中的質(zhì)?？梢?在協(xié)助菌的幫助下通過接合轉移方式導入受體菌屮。由于所用供體質(zhì)粒屮不含轉移基因tra,所以，該接合 轉移必須有輔助菌株e.coli參加才能完成（輔助菌株中含tra基因），因此該接合轉移過程稱為三親本雜交。2電轉化原理.影響因素：原理：電穿孔法即是在外加短時強電脈沖時，在細胞膜雙脂層上形成瞬時微孔，使細胞膜的通透性增強， dna等人分子得以進入細胞的一個工物物理過程。其細胞學原理是細胞處于電場中時.細胞膜起著電容器 的作用。電流不能通過，隨著電壓升高，細胞膜組分被極化，并在細胞膜兩邊產(chǎn)生電位差。當電位差超

2、過 某一臨界水平，細胞膜局部被擊穿，形成一瞬時的孔洞，孔徑人小足以讓人分子物質(zhì)進出細胞。只要電場 強度和脈沖時間不超過臨界限度，這種通透性就是可逆的。影響因素：電學因素：當電容值固定時，轉化子數(shù)h隨電場強度升高而增加；在適當電場強度下，使用 較大電容或電阻，則轉化頻率提高。但同時細胞存活數(shù)下降。電介質(zhì)：介質(zhì)的離子強度影響脈沖時間， 強度高則脈沖時間短，應采用低離子強度的電介質(zhì)，避免轉化時存在高鹽濃度。dna濃度：轉化細菌時, 質(zhì)粒dna濃度在一定范圍內(nèi)，濃度增高與獲得的轉化子數(shù)星顯線性關系。dna濃度超過一定范圍，則轉 化子數(shù)目的增加趨于飽和。菌種及生理狀態(tài)：細菌中gram陰性細菌比厚壁的陽性

3、菌易于轉化，真核 細胞電穿孔的電場強度比細菌高；轉化效率和細胞的存活率與細菌的牛長階段冇關。對于多數(shù)細菌來說, 在對數(shù)生長期，細胞對電場敏感，電激后細胞死亡率高，但存活的細胞易于接受外來dna,所以用對數(shù)中 期的細胞較為適宜。另冇少數(shù)gram陽性菌則培養(yǎng)到穩(wěn)定器時易于轉化。3質(zhì)?？焖贆z測法：原理：不經(jīng)抽提純化等步驟,直接在凝膠點樣孔中將質(zhì)粒從菌體中分離：菌體先加溶菌酶和rna酶,在冰 上裂解菌體。再將己裂解點入含冇sds凝膠帶的瓊脂糖凝膠中。sds在堿性條件卜沉淀菌體蛋白和帶組蛋 白的染色體碎片，沉淀留在點樣孔中。質(zhì)粒dna不帶蛋白質(zhì)，得以釋放，在電場作用下進入凝膠。注意事項：供試菌株要充分活

4、化，收集菌液不宜太濃；裂解液添加適量，裂解時間在半小時以上，至 菌液變清亮后方可點樣；在較低室溫卜操作；避免劇烈抽吸、農(nóng)蕩、高溫；點樣時不要冇氣泡，不 要溢出點樣孔。4光學顯微鏡性質(zhì)：放大倍數(shù)：與透鏡的焦距成反比，與光學筒長成正比；工作距離：物鏡下透鏡的下表面與載片物像的距離。物鏡放人倍數(shù)愈人，工作距離愈小；焦距：平行光線經(jīng)透鏡折射后的匯聚點與透鏡中心的距離；數(shù)值口徑（na）：其大小與顯微鏡的分辨率有關；焦深：物鏡視野中能清晰觀察到物像的垂直范闈。一般隨物鏡放人倍數(shù)增加而減??；分辨力：指分辨物體最小間隔的能力；色差：系白色光經(jīng)透鏡后各單色光焦點不一致的現(xiàn)彖，一般町用一個含鈣的雙凸透鏡和外包兩個

5、含鉛的 單凸透鏡組成的消色差透鏡校正；球面像差：系入射透鏡中部和邊緣部分的光線折射后在不同的點上聚焦而產(chǎn)生，可用含多組透鏡的消錯 透鏡來校正；像散：系透鏡在成像過程中使物像在水平或垂直軸面上產(chǎn)生分散的現(xiàn)象；（10）慧形像差：系透鏡在成像過程中產(chǎn)生慧形拖尾的現(xiàn)象；）像場彎illi：系透鏡在成像過程中發(fā)牛的像場彎illi的現(xiàn)象；（12）畸變：系透鏡在成像過程屮產(chǎn)生畸形像場的現(xiàn)象。4相差顯微鏡原理、優(yōu)點及使用方法：原理：相差顯微鏡一種將光線通過透明標木細節(jié)時所產(chǎn)心的光程弟（即相位差）轉化為光強弟的特種顯微 鏡。相差顯微鏡與普通顯微鏡主要不同之處在于用環(huán)狀光欄代替可變光欄，用帶和板的物鏡代替普通物鏡,

6、 并帶有一個合軸調(diào)屮望遠鏡及濾色片。這些特殊裝置能使活細胞或末經(jīng)染色的標本中各部分的折射率或厚 度的微小差異，產(chǎn)生相位差，然后利用光的衍射和干涉的原理，把相差變成振幅（明暗）之差，使人的肉眼 能夠辨認出來。相差顯微鏡能觀察到透明樣品的細節(jié)，適用于對活體細胞生活狀態(tài)下的生長.運動、增殖 情況及細微結構的觀察。使用方法：依次將物鏡換為相差物鏡，聚光器換為相聚光器，并升至最高位置，并在視場光闌處加上黃 綠色濾光片。將活體標本放在鏡臺上，把相聚光器調(diào)至10處，用1ox相差物鏡觀察并調(diào)節(jié)至物像清晰。 將目鏡換成合軸調(diào)整望遠鏡，把上透鏡適當旋出并調(diào)節(jié)使相板上的亮環(huán)少暗環(huán)準確聚焦。調(diào)節(jié)相聚光 器兩側的調(diào)節(jié)旋

7、鈕（或插入式調(diào)節(jié)桿），使亮環(huán)準確的與暗環(huán)重合。將合軸調(diào)整瑕遠鏡重新?lián)Q為h鏡進 行低倍鏤觀察，并將物像調(diào)至視野中部。依次按的步驟進行20x, 40x物錢和1oox油鏡觀察。注總事項：a一定要將聚光器升至最高位置；b相差物鏡與相聚光器一定婆匹配，否則無法使亮環(huán)暗 環(huán)重合；c視野亮度應隨物鏡倍數(shù)升高而加大。5熒光顯微鏡原理與操作方法：原理：標木物像內(nèi)部的熒光物質(zhì)或經(jīng)熒光染料染色的標木經(jīng)紫外光短波光激發(fā)后能發(fā)出一定波長的熒光， 上述標本可以用熒光顯微鏡觀察。常用的生物細胞內(nèi)部的熒光物質(zhì)主要有熒光索和綠色熒光蛋白等。熒光 染料主要冇金胺叮噪橙異硫鼠酸熒光黃、羅丹明b和熒光抗體等。使用方法：開啟電源轉換器

8、上主開關后，再按卜啟動鈕將汞燈點燃。先用普通光將待檢樣品在10x 物鏡下聚焦，根據(jù)檢測對象的激射和熒光性質(zhì)選擇適合的激射光與分色片組合。關閉普通光，移動汞燈 光路控制拉桿使紫外光射出，適當調(diào)節(jié)汞燈視場光闌，使之在視野中可見，再適當縮小孔徑光闌使物像反 差適當。觀察完畢后將物像移至屮部依2、3介紹的方法作20x、40x物鏡觀察。進行汕鏡觀察時，應 采用無熒光硅油，并在載片樣而上部和聚光器上部（使用透射式熒光顯微鏡吋）均滴上硅油。6顯微操作術：在顯微鏡卞分離單個生物細胞、細胞器或從物理混合物中分離單一微小物體的方法稱為顯 微操作法或顯微操作術。7熒光定量pcr原理及應用：原理：定屋pcr指佔算樣本

9、中的原始模板數(shù)。它是通過一定循環(huán)次數(shù)的pcr的擴增后，pcr產(chǎn)物量來判 斷品質(zhì)的原始模板數(shù)。定量pcr是以pcr擴増為基礎的，而pcr擴増是有規(guī)律可循的。定量一般是在pcr 擴坍的指數(shù)期進行的。如果用no代表pcr反應中的原始模塊數(shù)，n為擴增次數(shù)，那么擴增產(chǎn)物的初期直 線增長：而經(jīng)過-定循環(huán)次數(shù)擴增后，進入平臺期。定mpcr就是在指數(shù)增長期實現(xiàn)對原始摸板定量的（備 注：在指數(shù)增長期內(nèi)n=no（1+c）n,如果知道擴增的產(chǎn)物最n及pcr擴增的效率c,便可知道原始模塊no 值。）熒光定量pcr技術融匯pcr和dna探針雜交技術的優(yōu)點，直接pcr過程屮熒光信號的變化，根據(jù)pcr反應酶動力學特點，獲得

10、dna模板的準確定量結果。 應用：實時熒光定量pcr技術是dna定量技術的一次飛躍。運用該項技術，我們可以對dna、rna樣 品進行定量和定性分析。定量分析包括絕對定量分析和相對定是量分析。前者可以得到菜個樣木中基因的 拷貝數(shù)和濃度；后者可以對不同方式處理的兩個樣本中的堆因表達水平進行比較。除此之外我們不定期可 以對pcr產(chǎn)物或樣品進行定性分析：例如利用熔解曲線分析識別擴增產(chǎn)物和引物二聚體。以區(qū)分菲特異擴 增；利用特片性探針進行基因型分析及snp檢測等。h前實時熒光pcr技術已經(jīng)被廣泛應用于基礎科學 研究、臨床診斷、疾病硏究及藥物研發(fā)等領域。其中最主要的應用集中在以下幾個方面：比較經(jīng)過不處 理

11、樣木z間特定基因的表達差異（如藥物處理.物理處理、化學處理等），及特定基因在不同相的表達差異。 比較正常組織與病理組織中各種mrna表達量差異。驗證基因芯片實驗結果。驗證rna t擾實驗 結果。熒光定量pcr技術的兩種檢測模式：（dsybr green i檢測模式:sybr green i是一種結合于小溝中的雙鏈dna結合染料，與雙鏈dna結合后， 其熒光大大增強。pcr溫度循環(huán)為945572°c三步法，只冇引物，無探針，熒光染料特異性地摻入dna 雙鏈后，發(fā)射強熒光信號，而不摻入鏈小的sybr熒光染料僅冇微弱熒光信號背景。該方法通過對特定方 向的強熒光檢測獲得信號，這種試劑檢測模式

12、易產(chǎn)生非特異信號，且本底光較大。此外，由于一個pcr產(chǎn) 物可以與多個分子的染料結合，因此sybr green i的檢測靈敏度很高。但是，由于sybr green【與所冇 的雙鏈dna和結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的 精確性。通過測屋升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。山熔解曲線來分析產(chǎn)物的均一 性有助于更準確地分析sybr green i real-time pcr定杲結果。解探針模式：溫度循環(huán)為9460° c二 步法，不僅冇引物，還冇另外一個特異針對擴增模板的探針在引物對z間。在探針相鄰兩個堿基上分別結 合兩個熒光染料，

13、一個染料接受激發(fā)光得到的能量傳給了第二個染料，接受能量的第二個染料通過發(fā)射特 征光子回到穩(wěn)定態(tài)。當taq酶在60° c延伸擴增鏈時，遇到探針，利用taq酶5 一3外切酶活性將探針 水解成單個堿基，單個堿基之間距離較遠，第一個染料的能量無法傳給第二個染料，只好通過發(fā)射特征光 子回到穩(wěn)定態(tài)，通過對溶液屮第一個染料的熒光檢測獲得信號。這種試劑檢測模式增加了檢測信號的特異 性，但是由于利用了 taq酶5, 一3夕卜切酶活性，一般試劑廠家只給taq酶的聚合酶活性定標，沒有同時 給taq酶5 一3外切酶活性定標，不同批號試劑之間會給定量帶來差異。另外對探針的熔點溫度（tm） 僅要求英高于6（）。

14、c,這就使不同試劑盒z間的特異性參差不齊，而且無法做質(zhì)控檢測。9熒光定量pcr技術如何獲得樣品的起始拷貝數(shù)（相對標準曲線法）？所謂的實時熒光定mpcr,其反應體系中，引入了一種熒光化學物質(zhì)，隨著pcr反應的進行，pcr反應 產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過-個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以 通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到-條熒光擴增曲線。一般而言，熒光擴增曲線可以分三個 階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴坍階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴増的熒光信號被熒 光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。pcr的

15、 終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據(jù)最終的pcr產(chǎn)物量不能計算出起始dna拷貝數(shù)。只 冇在熒光信號指數(shù)擴增階段，pcr產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，我們可以選擇在這個 階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定ttpcr技術中引入了兩個非常重要的概念：熒 光閾值和ct值。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段 任意位置匕 但一般我們將熒光域值的缺省設置是3j5個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。每個反應 管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為ct值。定量熒光擴增曲線是熒光量少循環(huán)數(shù)的圖表。熒光閾值線的位置一般

16、事實上位于減去木底的位置上，這時 的熒光信號超過了熒光背景信號并且開始增加。對某一樣品的c值就定義為熒光量與熒光閾值線交義時 的循環(huán)數(shù)。ct值與起始模板的關系研究表明，每個模板的ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關 系，起始拷貝數(shù)越多，ct值越小。利用己知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準川1線，英中橫坐標代表ct值, 縱坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)。因些只要獲得未知樣品的ct值，即可從標準曲線上計算出該樣甜的起始 拷貝數(shù)。10宏基因組學：環(huán)境宏基因組定義：不依賴于培養(yǎng)物的微生物群落基因組分析或環(huán)境微生物菌群的混合基因組分析。宏蛋白組學：大規(guī)模鑒定在一個特定的時間，微生物菌群產(chǎn)生的整個蛋白質(zhì)。確定

17、樣品中微生物的種類: 收集樣品一一提取dna構建16srrna文庫一一測序分析。構建宏基因組文庫的過程：收集樣品一一提取dna一一葩切一一與載體連接一一轉化一一篩選轉化子一 確定基因。z后對文庫屮的dna進行序列分析（測序，生物信息學分析，共他分析）和具冇特定表型的功 能篩選?；』钚裕üδ埽┑暮Y選：確定具有所需耍表型的克隆一一對選定的克隆進行序列分析和生化分析一一對 冇用活性快速測定一一功能所需要的所冇基因都在一個克隆并在宿主細胞內(nèi)表達。優(yōu)點：能產(chǎn)生全新的基 因或化合物；缺點：頻率低下，工作量人。基于序列分析的篩選：利用保守序列設計pcr引物或探針篩選整個宏基因紐文庫以獲得我們所感興趣的 克

18、隆。優(yōu)點：不依賴于某因的表達；缺點：選擇性不好。功能基因的篩選策略：探索構建新的載體.擴大宿主范圍等提高宏基因的表達水平；通過富集特定 類群的基因組提高冃標基因在文庫中的頻率.如在擬采樣壞境中添加穩(wěn)定同位索c標記底物，與底物降解 冇關的微生物代謝活躍，c就進入到英基因組屮，捉取帶c標記的dna片段建庫則町以獲得較多的相關 底物降解活性克隆；開發(fā)dna芯片和蛋白質(zhì)芯片提高篩選頻率；隨著技術的不斷進步，宏基因組克 隆必將成為微生物活性物質(zhì)篩選的重耍手段并發(fā)揮巨大作用。11酵母雙雜交原理：酵母雙雜交技術是一種直接在酵母細胞內(nèi)檢測蛋白與蛋白相互作用、靈敏性很高的遺傳學方法。許多真核 生物的轉錄激活因了由兩個或兩個