流式細(xì)胞術(shù)（課堂PPT）

1、1流式細(xì)胞儀介紹流式細(xì)胞儀介紹 2To help all people live healthy livesTo help all people live healthy lives 流式細(xì)胞術(shù)歷史回顧 1973年BD推出世界第一臺流式細(xì)胞儀FACS I（Fluorescence Activated Cell Sorter） 1980年中國的第一臺流式細(xì)胞儀FACS II 生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域 FACS流式細(xì)胞儀市場占有率：全球75%，中國70%，F(xiàn)ACSAria 市場占有率達(dá)到90。3流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù) 定義：在流動的狀態(tài)中檢測單個(gè)細(xì)胞或顆粒的多項(xiàng)

2、理化及功能性指標(biāo)的一種分析技術(shù) 特點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)多參數(shù)分析 檢測的樣本種類多樣：前提單細(xì)胞懸液 外周血，骨髓，細(xì)胞穿刺液，洗脫液，腹水，實(shí)體組織（腫瘤、腺體、淋巴結(jié)），培養(yǎng)細(xì)胞 流式分選流式分選：以流動狀態(tài)的單個(gè)細(xì)胞的各項(xiàng)特性進(jìn)行細(xì)胞分離4流式檢測原理流式檢測原理 通過激光激發(fā)高速流動的單個(gè)細(xì)胞所攜帶的各種熒光素和熒光染料，并檢測由此產(chǎn)生的散射光和熒光的發(fā)射光，通過各種光信號的強(qiáng)弱來反應(yīng)細(xì)胞的各種特征。5流式細(xì)胞儀的分類流式細(xì)胞儀的分類 臺式機(jī)型 臨床型：FACSCalibur，F(xiàn)ACSCanto，F(xiàn)ACSCount 科研型: LSR，F(xiàn)ACSAria，F(xiàn)ACSArr

3、ay 非臺式機(jī)型: FACSVantage SE， FACSDiVa6流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)：將待測樣本按一定的速度一個(gè)個(gè)通過檢測區(qū)光學(xué)系統(tǒng)：產(chǎn)生并收集散射光和熒光信號電子系統(tǒng)：光學(xué)信號處理和顯示7液流系統(tǒng)樣本流液流系統(tǒng)樣本流細(xì)胞或微粒的懸浮液通過50300um的小孔引入鞘液，使得細(xì)胞或微粒單個(gè)單個(gè)流經(jīng)檢測區(qū)FALS Sensor90LS SensorLaser8樣本細(xì)胞的大小 0.5 - 40微米9液流系統(tǒng)鞘液液流系統(tǒng)鞘液當(dāng)液流系統(tǒng)符合雷諾茲公式時(shí)，樣品流能保持在液流的中心區(qū)流動而不和鞘液混合，即形成層流雷諾茲公式（雷諾茲公式（Reynolds number）當(dāng)當(dāng)R

4、e 2300, 將會發(fā)生湍流將會發(fā)生湍流流體動力學(xué)的聚焦效應(yīng)（Hydrodynamic Focusing）：大量的鞘液流包裹少量的樣本流，并對樣本流在中軸位置具有聚焦的作用Re dv whered tube diameter density of fluidv mean velocity of fluid viscosity of fluid10液流系統(tǒng)壓力系統(tǒng)液流系統(tǒng)壓力系統(tǒng)11液流系統(tǒng)壓力系統(tǒng)液流系統(tǒng)壓力系統(tǒng)1213光學(xué)系統(tǒng)光源光學(xué)系統(tǒng)光源光束需和細(xì)胞或微粒在檢測區(qū)正交特定的熒光染料需要特定波長的激發(fā)光源兩類激發(fā)光源：激光器：易聚焦成高能量的分布的光斑，弧光燈：光束散交，能量低，位置和功率

5、閃爍，14光學(xué)系統(tǒng)散射光信號光學(xué)系統(tǒng)散射光信號前向角散射光（FSC):和細(xì)胞或待測顆粒的大小和表面積有關(guān)可以用來區(qū)分死/活細(xì)胞側(cè)向角散射光（SSC):和細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和顆粒性有關(guān)可以用來區(qū)分粒/非粒細(xì)胞15光學(xué)系統(tǒng)散射光信號光學(xué)系統(tǒng)散射光信號散射光可以用來區(qū)分不同細(xì)胞群體的最基本的形態(tài)差異-常常用散點(diǎn)圖“Dot Plots”來顯示- 圖上的每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞的相應(yīng)信息 16光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)- -熒光信號熒光信號細(xì)胞標(biāo)記上熒光物質(zhì)后，這種熒光物質(zhì)要求特定波長的激發(fā)光來激發(fā)熒光強(qiáng)度是和細(xì)胞上標(biāo)記上的熒光染料的量正相關(guān)熒光在 90角的方向上檢測熒光物質(zhì)被激發(fā)以后產(chǎn)生的發(fā)射光將由特定的熒光通道來接收

6、特定檢測是通過光學(xué)濾片和透鏡來控制的1718熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)FITCPE450500550600650FL1 = FITC + x% PEFL2 = PE + y% FITC19熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)FL2 - %FL1FL-1(FITC)FL-2(PE)FL1 - %FL2(0 30%)(0 1%)20如何進(jìn)行補(bǔ)償？ 1、選擇補(bǔ)償管用的細(xì)胞，一定要含有補(bǔ)償用的抗體陽性和陰性的細(xì)胞群，陽性群體的熒光并盡可能強(qiáng)。 2、染色同型對照，調(diào)節(jié)電壓盡可能高，一定要能看到完整的陰性細(xì)胞群，大一點(diǎn)的沒有太大關(guān)系。 3、選擇細(xì)胞群中自發(fā)熒光相同的細(xì)胞群進(jìn)行分析（例如外周血可選擇淋巴細(xì)胞）。2

7、122光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)濾片光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)濾片長通濾光片 只容許某一波長之上的光通過 短通濾光片 容許某一波長之下的光通過 帶通濾光片 容許某一波長的上下一個(gè)極小范圍內(nèi)的光通，帶寬可以特定化 二向色性 當(dāng)濾光片和光源成45度角的方向放置，原本被通過的光照樣通過，而原本會被封鎖的光將會沿著90度角的方向被反射出去23LONG (700nm)550 Long Pass 650 Short Pass SHORT (500nm)Pass Through Filters600/100 Band Pass Transmitted 550 nm550 - 650 nm (60050)Wavelengths Bloc

8、ked650 nm550 nm650 nmShort PassLong PassBand PassLONG (700nm)550 Long Pass 650 Short Pass SHORT (500nm)Dichroic FiltersTransmitted 550 nmDiflected 90650 nm550 nm24單激光光學(xué)平臺單激光光學(xué)平臺光電二極管光電二極管檢測區(qū)檢測區(qū)高感度高感度 PMTs氬離子激氬離子激光器光器25光學(xué)系統(tǒng)熒光監(jiān)測器光學(xué)系統(tǒng)熒光監(jiān)測器兩種常見的熒光監(jiān)測器光電二級管:用于強(qiáng)信號的探測 (如, 前向散射光探測器)光電倍增管(PMT):比光電二極管更敏感但太強(qiáng)的光會

9、對其造成破壞有最適的波長檢測范圍26電子系統(tǒng)數(shù)據(jù)的采集和處理電子系統(tǒng)數(shù)據(jù)的采集和處理對探測器檢測到的信號加以處理前置放大在從遠(yuǎn)處的探測器傳到中央電子系統(tǒng)前對信號進(jìn)行放大放大調(diào)節(jié)信號的強(qiáng)度線性的或?qū)?shù)的放大計(jì)算脈沖信號的積分，高度或?qū)挾葧r(shí)間調(diào)整多參數(shù)檢測時(shí)所必須的數(shù)模轉(zhuǎn)換272829液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)細(xì)胞周期及倍體分析細(xì)胞周期及倍體分析31 倍體分析原理倍體分析原理 細(xì)胞增殖周期：分為細(xì)胞增殖周期：分為G0G0、G1G1、S S、G2G2、M M期。期。 G0/G1G0/G1期細(xì)胞為二倍體細(xì)胞，其期細(xì)胞為二倍體細(xì)胞，其DNADNA含量用含量用2N2N表示，表示，G2

10、/MG2/M期為四倍體細(xì)胞，其期為四倍體細(xì)胞，其DNADNA含量用含量用4N4N表示，表示，S S期細(xì)期細(xì)胞胞DNADNA含量介于此兩者之間。含量介于此兩者之間。 利用熒光染料如利用熒光染料如PIPI（Propidium iodidePropidium iodide）與細(xì)胞內(nèi)）與細(xì)胞內(nèi)的的DNADNA結(jié)合，結(jié)合量多少可反映細(xì)胞內(nèi)結(jié)合，結(jié)合量多少可反映細(xì)胞內(nèi)DNADNA含量。含量。 FCMFCM分析一個(gè)群體細(xì)胞峰分析一個(gè)群體細(xì)胞峰DNADNA倍體與細(xì)胞周期時(shí)，將倍體與細(xì)胞周期時(shí)，將DNADNA含量直方圖分為三部分，即含量直方圖分為三部分，即G0/G1, S, G2/MG0/G1, S, G2/M

11、期期三個(gè)細(xì)胞峰。三個(gè)細(xì)胞峰。 G0/G1G0/G1和和G2/MG2/M細(xì)胞峰細(xì)胞峰DNADNA的含量成正態(tài)分布，的含量成正態(tài)分布，S S期細(xì)期細(xì)胞峰則是一個(gè)加寬的正態(tài)分布。胞峰則是一個(gè)加寬的正態(tài)分布。32細(xì)胞周期示意圖及細(xì)胞周期示意圖及DNADNA含量直方圖含量直方圖 細(xì)胞周期示意圖及細(xì)胞周期示意圖及DNADNA含量直方圖含量直方圖33熒光信號的面積 一般對DNA倍體測量時(shí)采用面積（如FL2-A），這是因?yàn)闊晒饷}沖的面積比熒光脈沖的高度更能準(zhǔn)確反映DNA的含量，當(dāng)形狀差異較大，而DNA含量相等的二個(gè)細(xì)胞，得到的熒光脈沖高度是不等的，經(jīng)過對熒光信號積分后，所得到的信號值就相等。 34寬度FL2-

12、W FL2-W常用來區(qū)分雙聯(lián)體細(xì)胞，由于DNA樣本極容易聚集，當(dāng)兩個(gè)G1期細(xì)胞粘連在一起時(shí)，其測量到的DNA熒光信號（FL2-A）與G2期細(xì)胞相等，這樣得到的測量數(shù)據(jù)G2期細(xì)胞比例會增高，影響測量準(zhǔn)確性 3536幾個(gè)概念幾個(gè)概念 DNA指數(shù)指數(shù)(DI)：通過比較通過比較G0/G1G0/G1期細(xì)胞峰位期細(xì)胞峰位置的變化顯示，為置的變化顯示，為 測量樣本測量樣本G0/G1G0/G1期期DNADNA熒熒光通道數(shù)與正常人淋巴細(xì)胞光通道數(shù)與正常人淋巴細(xì)胞G0/G1G0/G1期期DNADNA熒光熒光通道數(shù)比值。通道數(shù)比值。 CVCV值：變異系數(shù)，由于儀器及實(shí)驗(yàn)樣本的影值：變異系數(shù)，由于儀器及實(shí)驗(yàn)樣本的影響

13、，測定過程中存在的漂移現(xiàn)象，其包括兩響，測定過程中存在的漂移現(xiàn)象，其包括兩部分，即反應(yīng)儀器精密度的部分，即反應(yīng)儀器精密度的CVCV值及實(shí)驗(yàn)樣本值及實(shí)驗(yàn)樣本的的CVCV值。值。37Channels (FL2-A)0306090120150ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: day1.001Date analyzed: 15-May-2007Model: 1DA0n_DSFAnalysis type: Automatic analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 76.51 % at 41.20 Dip G2: 5.19 % at 83.2

14、9 Dip S: 18.30 % G2/G1: 2.02 %CV: 4.19Total S-Phase: 18.30 %Total B.A.D.: 1.12 % Debris: 1.67 %Aggregates: 1.10 %Modeled events: 18232All cycle events: 17727Cycle events per channel: 411RCS: 3.507DebrisAggregatesDip G1Dip G2Dip SFSC-H0306090120R1FL2-W0306090120R238 細(xì)胞凋亡的流式檢測39凋亡與壞死凋亡與壞死 凋亡-細(xì)胞主動參與自身死

15、亡的過程。凋亡程序有一些特殊形態(tài)學(xué)特征，包括質(zhì)膜的改變，如細(xì)胞膜不對稱性和細(xì)胞附著消失，胞漿和細(xì)胞核固縮，核內(nèi)DNA裂解。到了晚期，凋亡細(xì)胞斷裂成“凋亡小體”，并很快被巨噬細(xì)胞清除，而不會引起周圍細(xì)胞的炎癥損傷 壞死-通常是由細(xì)胞損傷或細(xì)胞毒物作用引起，在形態(tài)學(xué)和細(xì)胞生物特性上，與凋亡有著本質(zhì)的區(qū)別。壞死細(xì)胞的早期變化是細(xì)胞和線粒體腫脹，繼而細(xì)胞膜破壞。不同于凋亡的是，壞死的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)容物（多為蛋白水解酶）釋放，會引起周圍組織的炎癥反應(yīng) 40細(xì)胞凋亡檢測方法 細(xì)胞凋亡檢測的常用手段主要分為形態(tài)學(xué)檢查、分子生物學(xué)方法、免疫電泳法和細(xì)胞學(xué)檢查。其中，用流式細(xì)胞術(shù)研究細(xì)胞凋亡在技術(shù)和應(yīng)用領(lǐng)域方面應(yīng)用

16、日益廣泛。由于可以對凋亡的多種特征多種特征進(jìn)行快快速速、靈敏靈敏、特異特異的定性分析和定量分析，流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)成為凋亡分析的重要檢測手段。41流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞形態(tài)的變化 細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻導(dǎo)致的細(xì)胞膜不對稱性消失 線粒體膜電位的改變 蛋白水解酶Caspase酶 的活化 核酸內(nèi)切酶活化導(dǎo)致的DNA斷裂 凋亡峰的檢測42 細(xì)胞散射光變化 在細(xì)胞凋亡的初始階段，細(xì)胞膜發(fā)生皺縮，導(dǎo)致FSC減小，而SSC增加或者維持不變434445 凋亡峰檢測：在凋亡細(xì)胞中，利用流式檢測PI染色后的DNA，可以發(fā)現(xiàn)一個(gè)亞群，稱為A0細(xì)胞，該細(xì)胞DNA染色減少。研究者認(rèn)為DNA染色減少的原因是因?yàn)?/p>

17、細(xì)胞內(nèi)DNA的程序性減少，源于DNA片斷化，而導(dǎo)致小分子量的DNA漏出照成的。凋亡峰檢測凋亡峰檢測PI - Fluorescence# EventsApoptotic cellsNormal G0/G1 cells46ProtocolsProtocols 用70%的乙醇固定細(xì)胞 1ml細(xì)胞懸液(1-5 X 106)均勻,快速混合于10ml預(yù)冷的70%乙醇中,置于4冰箱中2小時(shí) 從細(xì)胞中萃取出小分子量DNA 離心收集細(xì)胞,徹底去除乙醇,加入50ulDNA萃取緩沖液 置于37 水浴30分鐘 離心細(xì)胞 加入1ml PI/RNAse染液,室溫避光孵育30分鐘 流式檢測47磷脂酰絲氨酸的翻轉(zhuǎn)磷脂酰絲氨酸

18、的翻轉(zhuǎn)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)會有一系列的形態(tài)學(xué)特征性改變，其中，質(zhì)膜的改變是早期凋亡的特征之一。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）從胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，暴露于細(xì)胞外表面。Annexin V是一個(gè)35-36kD的Ca2+依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，它與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，可以與細(xì)胞外暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)合。Annexin V標(biāo)記上FITC、PE或生物素，可以在流式細(xì)胞儀上靈敏地檢測凋亡細(xì)胞。 48Protocol 收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞12次，然后用binding buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度在106/ml 取100ul細(xì)胞懸液，加入5ul Annexin V及5ul PI； 輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘 加入400ul binding buffer，流式檢測4950Quadrant StatisticsFile: Data.004Log Data Units: Linear ValuesSample ID: Patient ID: Tube: Panel: Acquisition Date: 14-Dec-06Gate: No GateGated Events: 10000Total Events: 10000X Par