補(bǔ)充酶催化活性測定方法實用教案

1、一、測定(cdng)酶促反應(yīng)速度的兩類方法（一）酶促反應(yīng)速度的表示方法(fngf)(fngf) 單位時間的底物的消耗量（-dS/min-dS/min） 單位時間的產(chǎn)物的生成量（dP/mindP/min）來表示（二）測定方法分類 定時法 在一定時間內(nèi)通過測定總變化量再計算出速度. . 連續(xù)監(jiān)測(jin c)(jin c)法 直接用來測定速度第1頁/共15頁第一頁，共16頁。（一）定時(dn sh)(dn sh)法1.1.概念 在足量的底物系統(tǒng)中，加入一定量的酶試劑，反應(yīng)一定時間后，加入終止劑終止反應(yīng)，然后測定底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量2.2.酶活性的結(jié)果計算(j sun)(j sun) 假設(shè)某一

2、樣品的酶活性為X X（U/LU/L），取樣品量VsVs毫升與底物緩沖液VrVr毫升孵育，經(jīng)過t t分鐘反應(yīng)，加入終止液 Ve(ml) Ve(ml)，檢測到產(chǎn)物凈吸光度增加為A A，該產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)為 （終點法的摩爾消光系數(shù)一般可通過帶標(biāo)準(zhǔn)求得）比色皿光徑為b(cm)b(cm)第2頁/共15頁第二頁，共16頁。若把A/tA/t以A/minA/min表示，則此定時(dn sh)(dn sh)法測定酶活性的計算公式與連續(xù)監(jiān)測法相同第3頁/共15頁第三頁，共16頁。3.3.定時法與終點(zhngdin)(zhngdin)法和兩點法的區(qū)別定時法 是經(jīng)過一定時間（固定的時間）反應(yīng)后終止反應(yīng) 終點法 指

3、反應(yīng)基本達(dá)到平衡，信號變化很小，但可以不需要終止反應(yīng)兩點法 監(jiān)測反應(yīng)過程中的兩個(lin )(lin )點，即某一段時間內(nèi)的底物或產(chǎn)物的變化第4頁/共15頁第四頁，共16頁。（二）連續(xù)(linx)監(jiān)測法1.1.原理(yunl) (yunl) 連續(xù)監(jiān)測法是將酶與底物在特定條件（緩沖液、溫度等）下孵育，每隔一定時間（2-60s2-60s）連續(xù)測定酶促反應(yīng)過程中某一底物或產(chǎn)物的特征信號（如NADHNADH在340nm340nm的吸光度）的變化，從而計算出每分鐘的信號變化速率2.2.酶促反應(yīng)動力學(xué)曲線 一個典型的酶促反應(yīng)過程一般包括延滯期、線性期和非線性期第5頁/共15頁第五頁，共16頁。1.1.延滯

4、期 對單一酶促反應(yīng)(fnyng)(fnyng)而言，是指酶促反應(yīng)(fnyng)(fnyng)從開始到達(dá)最大反應(yīng)(fnyng)(fnyng)速度所需要的間，包括酶催化位點的暴露、底物解離后與酶結(jié)合位點的結(jié)合、酶與輔酶的結(jié)合、酶的激活等等 對于酶偶聯(lián)反應(yīng)(fnyng)(fnyng)而言，延滯期還包括中間產(chǎn)物堆積到一定程后，導(dǎo)致指示反應(yīng)(fnyng)(fnyng)速度增加，直到與待測酶酶促反應(yīng)(fnyng)(fnyng)速度達(dá)到平衡所需的時間。一般來說，輔助酶越多，延滯期越長2.2.線性期 是指酶促反應(yīng)(fnyng)(fnyng)速度保持恒定的時期，不受底物濃度的影響。此期底物雖被不斷消耗但還不足以

5、明顯改變酶促反應(yīng)(fnyng)(fnyng)的速度，即以初速度進(jìn)行3.3.非線性期 隨著反應(yīng)(fnyng)(fnyng)的進(jìn)行，底物消耗越來越明顯，反應(yīng)(fnyng)(fnyng)速度明顯下降而進(jìn)入非線性期。酶濃度越高在選定條件下線性期就越短。其他造成進(jìn)入非線性期的原因有可逆反應(yīng)(fnyng)(fnyng)增強(qiáng)、產(chǎn)物抑制增加、酶變性失活增加、酶聚合或解離增加等等第6頁/共15頁第六頁，共16頁。（二）連續(xù)監(jiān)測(jin c)法酶活性的結(jié)果計算 假設(shè)某一樣品的酶活性為x（U/L），取樣品量Vs與底物緩沖液Vr孵育，延滯期為t0分鐘，測定間隔時間為t1分鐘，讀數(shù)次數(shù)為n，每間隔時間吸光度變化平均值為

6、A，該產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)為比色皿光徑為b（cm）。反應(yīng)速度(fn yng s d)分別用產(chǎn)物的生成速度和樣品中酶的催化能力來表示 第7頁/共15頁第七頁，共16頁。二、酶活性測定方法原理(yunl) （一）直接(zhji)法 根據(jù)待測酶的酶促反應(yīng)底物或產(chǎn)物有特征性的理化性質(zhì)，然后通過特殊的儀器直接(zhji)檢測1.基于NADH或NADPH的反應(yīng)原理 NADH或NADPH在340nm處有特異吸收峰，而NAD+或NADP+只在260nm處有明顯的吸收峰，監(jiān)測340nm吸光度變化可以反應(yīng)NADH或NADPH的變化。利用該原理可以測定以NAD（P）+或NAD（P）H為輔酶的氧化還原酶例如LD、G-6

7、-PD、-HBD、AD、SD、GLDH等第8頁/共15頁第八頁，共16頁。 一些水解酶類或轉(zhuǎn)移酶類經(jīng)過酶促反應(yīng)將化合物中的某一基團(tuán)水解或移去，使無顏色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛蓄伾漠a(chǎn)物(chnw)。人們把這類底物稱為色素原底物。根據(jù)這一原理，人們有意識地合成一系列底物用來測定酶活性，即人工合成色素原底物，利用這類底物測定的酶2基于人工合成色素原底物反應(yīng)(fnyng)原理色素原底物待測酶產(chǎn)物的毫摩爾吸光系數(shù)4-硝基磷酸酚鈉鹽ALPPNP（4-硝基酚405nm）,18.53-羧基-L-谷氨酰對硝基苯胺GGT5-氨基-2-硝基苯甲酸,405nm,9.872-氯-硝基苯-半乳糖-麥芽糖苷AMS2-氯酚（2-CP

8、405nm）,6.2第9頁/共15頁第九頁，共16頁。3.3.基于氧的消耗 氧化酶在催化反應(yīng)時會不斷消耗氧氣(yngq)(yngq)，可以設(shè)計氧電極來連續(xù)監(jiān)測氧的消耗速度4.4.其他 膽堿酯酶催化乙酰膽堿產(chǎn)生乙酸，造成pHpH下降，可以用pHpH差示法測定膽堿酯酶。脫羧酶在反應(yīng)過程中產(chǎn)生CO2CO2，可以用量積法測定 第10頁/共15頁第十頁，共16頁。（二）間接(jin ji)(jin ji)法 是指酶促反應(yīng)底物和產(chǎn)物之間沒有特征性的理化性質(zhì)，需通過另一個(y )化學(xué)反應(yīng)或生化反應(yīng)，將底物或產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為有明顯特征理化性質(zhì)的另一個(y )化合物。用直接法來測定的酶類非常有限，很多情況下不得不使用

9、間接法 第11頁/共15頁第十一頁，共16頁。 大多數(shù)定時法都是在酶促反應(yīng)終止后加入另一個試劑與底物或產(chǎn)物反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為有色化合物，再用分光光度法檢測。也有個別酶類不終止反應(yīng)，加入與酶促反應(yīng)無關(guān)的試劑，但能與酶促反應(yīng)的某一產(chǎn)物反應(yīng)生成有特征性的化合物。例如：膽堿酯酶催化?；虼憠A類底物后，生成的硫代膽堿（SCh）與5，5-二硫代-雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）反應(yīng)，生成黃色(hungs)陰離子5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-TNBA） 酸性磷酸酶測定，利用-萘酚磷酸鹽做底物，經(jīng)酸性磷酸酶水解后釋放萘酚，與試劑中的固紅TR發(fā)生偶氮反應(yīng)，生成黃色(hungs)化合物 1.1.化學(xué)法第12頁/共15

10、頁第十二頁，共16頁。 在酶活性測定時，常采用另一個（指示酶）或幾個酶（輔助酶和指示酶）將測定酶的某一產(chǎn)物轉(zhuǎn)化(zhunhu)為新的產(chǎn)物，當(dāng)其他酶的反應(yīng)速度與待測酶反應(yīng)速度達(dá)到平衡時，可以用指示酶的反應(yīng)速度來代表待測酶的活性?？梢员硎緸椋褐甘久甘侵改鼙O(jiān)測反應(yīng)速度的酶輔助酶在酶偶聯(lián)反應(yīng)中可以一個或多個，也可以不需要輔助酶 由于NAD（P）+或NAD（P）H在340nm的光吸收特性，很容易進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，因此它是最常用的指示酶，過氧化物酶（POD）也可做指示酶。下表列舉了需要指示酶的酶偶聯(lián)方法來測定酶活性 2.2.酶偶聯(lián)法第13頁/共15頁第十三頁，共16頁。待測酶測定方法輔助酶指示酶丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶IFCC推薦法LD脂肪酶GK-GPO-POD法GK、GPO、POD5-核苷酸酶5-IMP作底物的NP-XOP-POD法核苷磷酸化酶NP黃嘌呤氧化酶XODPOD舉 例第14頁/共15頁第十四頁，共16頁。感謝您的觀看(gunkn)！第15頁/共15頁第十五頁，共16頁。NoImage內(nèi)容(nirng)總結(jié)一、測定酶促反應(yīng)速度的兩類方法。單位時間的底物的消耗量（-dS/min）。單位時間的產(chǎn)物的生成量（dP/min）來表示(