抗腫瘤藥物評價技術

1、抗腫瘤藥物評價技術抗腫瘤藥物評價技術南京凱基生物科技發(fā)展公司聯(lián)系電話025-52880812抗腫瘤藥物藥效學指導原則抗腫瘤藥物藥效學指導原則細胞毒類抗腫瘤藥物非臨床研究細胞毒類抗腫瘤藥物非臨床研究技術指導原則技術指導原則化學藥物一般藥理學研究技術指導原則化學藥物一般藥理學研究技術指導原則中藥、天然藥物一般藥理學研究技術指導原則中藥、天然藥物一般藥理學研究技術指導原則指導原則指導原則 體內抗腫瘤試驗必須選用三種以上腫瘤模型，其中至體內抗腫瘤試驗必須選用三種以上腫瘤模型，其中至 少一種為人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。少一種為人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。

2、 試驗結果三種模型均為有效，再重復一次也為有效試驗結果三種模型均為有效，再重復一次也為有效 體外實驗選用體外實驗選用10-15株人癌細胞株株人癌細胞株 ，至少重復一次，至少重復一次23抗腫瘤藥物藥效學研究的要求抗腫瘤藥物藥效學研究的要求 體內、體外實驗方法相結合；以體內實驗為主體內、體外實驗方法相結合；以體內實驗為主1南京凱基生物科技發(fā)展公司聯(lián)系電話025-52880812體外抗腫瘤活性試驗體外抗腫瘤活性試驗 對候選化合物進行初步篩選對候選化合物進行初步篩選了解候選化合物的抗瘤譜了解候選化合物的抗瘤譜為隨后進行的體內抗腫瘤試驗提供參考為隨后進行的體內抗腫瘤試驗提供參

3、考試驗目的試驗目的體外抗腫瘤活性試驗體外抗腫瘤活性試驗試驗方法試驗方法 選用選用10-1510-15株人癌細胞株株人癌細胞株 試驗還應考察受試物對耐藥腫瘤細胞系和正常人源細胞的作用和影試驗還應考察受試物對耐藥腫瘤細胞系和正常人源細胞的作用和影響響 使用使用MTTMTT還原法、磺酰羅丹明還原法、磺酰羅丹明B(SRB)B(SRB)染色法染色法 藥物與細胞共培養(yǎng)時間一般為藥物與細胞共培養(yǎng)時間一般為48-72 48-72 小時，貼壁細胞需先貼壁小時，貼壁細胞需先貼壁24 24 小時后再給藥。小時后再給藥。 試驗應設陰性、陽性、溶媒對照組，陽性對照用一定濃度的標準抗試驗應設陰性、陽性、溶媒對照組，陽性對

4、照用一定濃度的標準抗腫瘤藥。腫瘤藥。 試驗至少應重復一次試驗至少應重復一次 四氮唑鹽還原法體外抗腫瘤活性試驗體外抗腫瘤活性試驗后，值。值- 磺酰羅丹明染色法體外抗腫瘤活性試驗體外抗腫瘤活性試驗水。OD和 染料排斥法體外抗腫瘤活性試驗體外抗腫瘤活性試驗） 阿拉馬藍法體外抗腫瘤活性試驗體外抗腫瘤活性試驗的 集落形成法體外抗腫瘤活性試驗體外抗腫瘤活性試驗， 生長曲線測定法體外抗腫瘤活性試驗體外抗腫瘤活性試驗體外抗腫瘤活性試驗體外抗腫瘤活性試驗白血?。ò籽。?株）：株）：CCRF-CEM、HL-60、K562、MOLT-4、RPMI-8226、SR肺癌（肺癌（9株）：株）：A549、EKVX、HOP

5、-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H322、 MNCI-H460、NCI-H522乳腺癌：乳腺癌：BT-549、HS578T、MCF-7、MCF-7/ADR、MDA-MB-231、ATCC、 MDA-MB-435、MDA-N、T-47D卵巢癌：卵巢癌：IGROV1、OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3腎癌：腎癌：786-0、A498、ACHN、CAKI-1、RXF-393、SN12C、TK-10、UO-31前列腺癌：前列腺癌：DU-145、PC-3中樞神經系統(tǒng)腫瘤：中樞神經系統(tǒng)腫瘤：SF-268 、SF-295 、SF-5

6、39、 SFB-19 、SFB-75、U251黑色素瘤：黑色素瘤：M14、MALME-3M、SK-MEL-2、SK-MEL-5、SK-MEL-28、UACC-62、 UACC-257、LOCIMV美國美國NCI抗腫瘤藥物體外篩選使用的抗腫瘤藥物體外篩選使用的60種人類細胞種人類細胞體外抗腫瘤活性試驗體外抗腫瘤活性試驗瘤譜細胞株結合我國瘤譜細胞株結合我國實際情況實際情況呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、婦科腫、血液系統(tǒng)、婦科腫瘤瘤選用人正常細胞株選用人正常細胞株初步確定受試樣品對初步確定受試樣品對正常組織和腫瘤組織正常組織和腫瘤組織的選擇性的選擇性選用耐藥細胞株選用耐藥細胞株考察受

7、試樣品的抗耐考察受試樣品的抗耐藥作用藥作用國內國內體外體外篩選篩選的細的細胞株胞株選擇選擇選用人血管內皮細胞選用人血管內皮細胞株進行同步考察株進行同步考察細胞株有相當一部分細胞株有相當一部分是國內自己建株是國內自己建株胃癌、肝癌胃癌、肝癌體外初篩經典三株細胞體外初篩經典三株細胞A549HepG-2HCT-116兼顧選擇使用動物（小鼠）腫瘤與人的腫瘤細胞；兼顧選擇使用動物（小鼠）腫瘤與人的腫瘤細胞；篩選實驗以快速生長的細胞為主；篩選實驗以快速生長的細胞為主；兼顧選擇使用貼壁生長細胞與懸浮生長細胞兼顧選擇使用貼壁生長細胞與懸浮生長細胞樣品初篩時應該注意三點樣品初篩時應該注意三點體外抗腫瘤活性試驗體

8、外抗腫瘤活性試驗 凱基現(xiàn)用的濃度為凱基現(xiàn)用的濃度為1、2、4、8、16、32、64、128、256、藥物與細胞共培養(yǎng)時間一藥物與細胞共培養(yǎng)時間一般為般為48-72 小時，貼壁細胞小時，貼壁細胞需先貼壁需先貼壁24 小時后再給藥。小時后再給藥。體外抗腫瘤活性試驗體外抗腫瘤活性試驗評價標準評價標準以同一樣品不同濃度對腫瘤細胞抑制率作圖可得到劑量效應以同一樣品不同濃度對腫瘤細胞抑制率作圖可得到劑量效應曲線采用曲線采用Logit法計算半數(shù)有效濃度法計算半數(shù)有效濃度(IC50值或值或EC50值值)合成化合物或植物提取純品的合成化合物或植物提取純品的IC5010 gm1或植物粗提或植物粗提物的物的IC50

9、20 gm1時，則判斷樣品在體外對腫瘤細胞有時，則判斷樣品在體外對腫瘤細胞有殺傷作用。殺傷作用。體外試驗至少重復一次體外試驗至少重復一次體外抗腫瘤活性試驗體外抗腫瘤活性試驗體外篩選其他方法：體外篩選其他方法：MTS法、刃天青法法、刃天青法以線粒體為作用靶點的受試物不宜采用四氮唑鹽還原法以線粒體為作用靶點的受試物不宜采用四氮唑鹽還原法 溶媒對照組與陰性對照組比較，溶媒對照組與陰性對照組比較，OD值應在值應在5%，且無統(tǒng)計學差異，且無統(tǒng)計學差異應考慮到受試物在水溶液中的穩(wěn)定性，比如環(huán)磷酰胺在水溶液中的半衰應考慮到受試物在水溶液中的穩(wěn)定性，比如環(huán)磷酰胺在水溶液中的半衰 期為期為3h脂溶性的受試物常用

10、脂溶性的受試物常用DMSO助溶，但助溶，但DMSO終濃度不低于終濃度不低于0.1%測出的測出的OD值有事會出現(xiàn)假陰性（加值有事會出現(xiàn)假陰性（加MTT等染色劑時更換培養(yǎng)基）等染色劑時更換培養(yǎng)基）注意事項注意事項體內抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤活性試驗舉舉例例HepG-2 72hGroupMeanSDInhibitive RateNegative Control 0.9550.010Positive Control 0.9520.0100.29%Solvent Control 0.1650.00782.74%化合物XXXIC50=22.588uM100M0.0510.00594.66%80M0.101

11、0.00989.47%60M0.1520.00884.08%40M0.2850.00470.16%20M0.6620.01330.72%10M0.7660.02019.81%5M0.8470.01111.31%2.5M0.9180.0103.92%1.25M0.9400.0101.59%表表 化合物化合物XXX對人肝癌細胞對人肝癌細胞HepG-2體外增殖的影響體外增殖的影響化合物XXX對人肝癌細胞HepG-2體外增殖的影響化合物XXX對人肝癌細胞HepG-2體外增殖的影響020406080100020406080100XXX濃度 uM抑制率（%）體外抗腫瘤活性試驗體外抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤試

12、驗結果是評價候選化合物有效性的最重要指標體內抗腫瘤試驗結果是評價候選化合物有效性的最重要指標體內抗腫瘤試驗必須選用三種以上腫瘤模型，其中至少一種為體內抗腫瘤試驗必須選用三種以上腫瘤模型，其中至少一種為人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。試驗結果三種模型人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。試驗結果三種模型均為有效，再重復一次也為有效，評定該化合物對這些實驗性均為有效，再重復一次也為有效，評定該化合物對這些實驗性腫瘤具有治療作用。腫瘤具有治療作用。通常情況下，以人癌異體移植模型試驗結果來評價細胞毒類抗通常情況下，以人癌異體移植模型試驗結果來評價細胞毒類抗腫瘤藥物的有效性。腫瘤藥物的有效性。體內

13、抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤活性試驗小鼠腫瘤模型小鼠腫瘤模型大鼠腫瘤模型大鼠腫瘤模型人源異種移植腫瘤模型人源異種移植腫瘤模型動物模型動物模型實驗動物實驗動物體內抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤活性試驗動物要求健康，符合等級動物要求，三證動物要求健康，符合等級動物要求，三證 裸鼠：裸鼠：SPF級，小鼠：清潔級、級，小鼠：清潔級、SPF級級 實驗動物質量合格證實驗動物質量合格證 實驗動物生產許可證實驗動物生產許可證 實驗動物使用許可證實驗動物使用許可證雌雄均可，但同一批實驗中動物性別必須相同雌雄均可，但同一批實驗中動物性別必須相同 婦科腫瘤使用雌性小鼠、前列腺癌等使用雄性小

14、鼠婦科腫瘤使用雌性小鼠、前列腺癌等使用雄性小鼠小鼠鼠齡為小鼠鼠齡為5-6周，體重為周，體重為18-22克克 裸鼠裸鼠6周齡以后，會產生體液免疫、周齡以后，會產生體液免疫、NK細胞、細胞、B淋巴細胞免疫，成瘤率會下降淋巴細胞免疫，成瘤率會下降 同批動物體重相差不超過同批動物體重相差不超過20%評價同一物質的活性時，不同批次的實驗必須采用同一品系的小鼠評價同一物質的活性時，不同批次的實驗必須采用同一品系的小鼠體內抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤活性試驗腫瘤瘤株腫瘤瘤株用體外試驗敏感細胞株進行體內抗人癌裸小鼠移植瘤試驗。用體外試驗敏感細胞株進行體內抗人癌裸小鼠移植瘤試驗。 模模型建立和使用應注意：型建立和使

15、用應注意：(1) 移植瘤一般由相應的細胞株移植而建立，對細胞株和移植瘤的化療敏感性應予了解。(2) 移植瘤復蘇后一般應傳2-3代后再用于體內抗腫瘤試驗。(3) 對模型生長情況應全面了解，尤其是生長快的模型(4) 為了保持移植瘤的生物學特性和遺傳特性，復蘇后移植瘤體內傳代應少于 15-20代 呼吸系統(tǒng)腫瘤婦科腫瘤人肺癌 NCI-H460小鼠宮頸癌 U14人肺腺癌 A549人乳腺癌 MDA-MB-435消化系統(tǒng)腫瘤小鼠胃癌 MFC人乳腺癌 MDA-MB-231人胃癌 BGC-803人乳腺癌 MX-1人胃癌 HGC-27人乳腺癌 BCaP-37人低分化胃癌 BGC-823人宮頸癌 SiHa人低分化胃

16、癌 MGC-803人宮頸癌 Hela人低分化胃癌 MKN-45人卵巢癌 A2780人中分化胃癌 SGC-7901人卵巢癌 SK-OV-3人高分化胃癌 MKN-28生殖系統(tǒng)腫瘤人腎癌 Ketr-3小鼠肝癌 H22人膀胱癌 EJ人肝癌 QGY-7701人膀胱癌 T24人肝癌 SMMC-7721人前列腺癌 PC-3人肝癌 Bel-7402人前列腺癌 PC-3M人肝細胞性肝癌 IM3白血病人白血病 HL-60人肝癌 HepG-2人白血病 K562人結腸癌 Ls-174-T人耐阿霉素白血病 K562/Adr人結腸癌 CL187皮膚腫瘤小鼠黑色素瘤 B16F1人結腸癌 HCT-116小鼠黑色素瘤 B16F

17、10人結腸癌 SW1116小鼠黑色素瘤 B16BL6人結腸癌 HT-29人黑色素瘤 A375人胰腺癌 BxPC-3人黑色素瘤 M14頭頸部腫瘤人喉表皮癌 Hep-2其它腫瘤小鼠肉瘤 S180體內抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤活性試驗小鼠腫瘤模型小鼠腫瘤模型優(yōu)點：潛伏期短、移植瘤成活率高、生長均勻、無自發(fā)緩解、試驗優(yōu)點：潛伏期短、移植瘤成活率高、生長均勻、無自發(fā)緩解、試驗周期短、費用低周期短、費用低缺點：動物腫瘤在生物學和遺傳學上與臨床不一致，在藥物敏感性缺點：動物腫瘤在生物學和遺傳學上與臨床不一致，在藥物敏感性方面與人體腫瘤方面與人體腫瘤 不一致不一致僅可用于候選化合物的初步篩選僅可用于候選化合物的

18、初步篩選常用小鼠腫瘤常用小鼠腫瘤H22、S180、Lewis人癌裸鼠異種移植腫瘤模型人癌裸鼠異種移植腫瘤模型優(yōu)點：實驗結果與臨床較符合、優(yōu)點：實驗結果與臨床較符合、可用于研究獲得性藥物抗性可用于研究獲得性藥物抗性缺點：飼養(yǎng)條件要求高、接種成活率低、移植瘤個體差異大、缺點：飼養(yǎng)條件要求高、接種成活率低、移植瘤個體差異大、部分模型部分模型 很難構建、生存時間不適合作為試驗終點很難構建、生存時間不適合作為試驗終點人癌裸鼠皮下移植瘤操作簡單、易于觀察與結果判定，但皮下移植瘤缺人癌裸鼠皮下移植瘤操作簡單、易于觀察與結果判定，但皮下移植瘤缺乏腫瘤最典型的特性乏腫瘤最典型的特性- -轉移，是現(xiàn)在評價抗腫瘤藥

19、物活性的主要模型轉移，是現(xiàn)在評價抗腫瘤藥物活性的主要模型體內抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤活性試驗溶于水的藥物，用生理鹽水或蒸餾水配制；如用酸、堿溶解者，可先用溶于水的藥物，用生理鹽水或蒸餾水配制；如用酸、堿溶解者，可先用小量酸小量酸(0.1-0.5N HCl)或堿或堿(NaHCO3、Na2CO3、NaOH)溶解，調節(jié)溶解，調節(jié)pH在在4.5-9.0的范圍內。用乙醇、丙二醇、吐溫的范圍內。用乙醇、丙二醇、吐溫80、DMSO助溶的藥物，或助溶的藥物，或用吐溫用吐溫60、吐溫、吐溫80、2-3%淀粉、淀粉、0.5%羧甲基纖維素制成混懸液的藥物，羧甲基纖維素制成混懸液的

20、藥物，可腹腔注射或口服，但必須設相同濃度的溶劑對照組。用注射用花生油可腹腔注射或口服，但必須設相同濃度的溶劑對照組。用注射用花生油配制的溶液或乳劑可口服、皮下或肌肉注射配制的溶液或乳劑可口服、皮下或肌肉注射藥物配制藥物配制體內抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤活性試驗試驗設模型對照組、陽性對照組、治療組。試驗設模型對照組、陽性對照組、治療組。治療組設高、中、低三個劑量組。小鼠腫瘤和腹水瘤接種治療組設高、中、低三個劑量組。小鼠腫瘤和腹水瘤接種后次日將動物隨機分組，裸鼠移植瘤用游標卡尺測量移植后次日將動物隨機分組，裸鼠移植瘤用游標卡尺測量移植瘤直徑，待腫瘤生長至瘤直徑，待腫瘤生長至100300mm3后將動物

21、隨機分組。后將動物隨機分組。動物數(shù)普通小鼠每組動物數(shù)普通小鼠每組10只，裸鼠只，裸鼠6只。只。組別設置組別設置試驗設計試驗設計體內抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤活性試驗治療組設高、中、低劑量治療組，一般按治療組設高、中、低劑量治療組，一般按4:2:1設置設置如何確定試驗劑量如何確定試驗劑量臨床等效劑量（根據(jù)體表面積換算）臨床等效劑量（根據(jù)體表面積換算）根據(jù)半數(shù)致死量（根據(jù)半數(shù)致死量（1/10-1/20預摸）或者高劑量使用最大耐受量或預摸）或者高劑量使用最大耐受量或LD10的劑量的劑量根據(jù)文獻估計劑量根據(jù)文獻估計劑量劑量設置劑量設置試驗設計試驗設計體內抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤活性試驗模型對照組給予相應

22、的溶劑；模型對照組給予相應的溶劑；陽性對照藥選用對該動物敏感的、臨床應用的抗腫瘤藥物（陽性組陽性對照藥選用對該動物敏感的、臨床應用的抗腫瘤藥物（陽性組必須作出陽性結果，否則有理由懷疑篩選方法和指標的可信度）必須作出陽性結果，否則有理由懷疑篩選方法和指標的可信度）如受試物為一抗癌藥物的衍生物或類似物時，必須選用該抗癌藥物如受試物為一抗癌藥物的衍生物或類似物時，必須選用該抗癌藥物作為陽性對照藥作為陽性對照藥原型劑對照原型劑對照陽性對照藥選擇原則陽性對照藥選擇原則 療效確切與被試物質化學結構類似；與被試物質有類似的作用機理 對照組設置對照組設置試驗設計試驗設計體內抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤活性試驗分組

23、當日開始給藥，根據(jù)不同藥物的代謝動力學和毒性反應等確定分組當日開始給藥，根據(jù)不同藥物的代謝動力學和毒性反應等確定給藥方案。給藥方案。給藥途徑應與推薦臨床用藥的途徑相同。給藥途徑應與推薦臨床用藥的途徑相同。 給藥次數(shù)較多，或被試物質溶解性較差，靜脈給藥有困難時，可考給藥次數(shù)較多，或被試物質溶解性較差，靜脈給藥有困難時，可考慮使用腹腔給藥，但在評價藥效時要注意這兩種給藥途徑是有差別慮使用腹腔給藥，但在評價藥效時要注意這兩種給藥途徑是有差別的。的?？刹扇×鲋堋⒘鰞?、肌肉、皮下給藥途徑?？刹扇×鲋?、瘤內、肌肉、皮下給藥途徑。腹水瘤試驗時一般不能應用腹腔給藥途徑腹水瘤試驗時一般不能應用腹腔給藥途徑。給藥

24、方案和給藥途徑給藥方案和給藥途徑試驗設計試驗設計腹水瘤模型腹水瘤模型接種給藥后，觀察和記錄動物接種給藥后，觀察和記錄動物死亡時間，計算生存天數(shù)。死亡時間，計算生存天數(shù)。如陰性對照組如陰性對照組20%動物存活動物存活時間超過時間超過4周，表明腹水瘤生周，表明腹水瘤生長不良，實驗作廢長不良，實驗作廢。裸鼠移植瘤模型裸鼠移植瘤模型推薦使用測量瘤徑的方法，動推薦使用測量瘤徑的方法，動態(tài)觀察受試物抗腫瘤的效應。態(tài)觀察受試物抗腫瘤的效應。腫瘤直徑的測量次數(shù)根據(jù)移植腫瘤直徑的測量次數(shù)根據(jù)移植瘤的生長情況而定，一般為瘤的生長情況而定，一般為每周每周2-3次次,每次測量同時還需每次測量同時還需稱鼠重稱鼠重。免疫

25、缺陷小鼠皮下移植的腫瘤很少發(fā)生轉移，多數(shù)死于原發(fā)腫免疫缺陷小鼠皮下移植的腫瘤很少發(fā)生轉移，多數(shù)死于原發(fā)腫瘤。而臨床腫瘤病人大多死于腫瘤轉移，動物和臨床腫瘤病人瘤。而臨床腫瘤病人大多死于腫瘤轉移，動物和臨床腫瘤病人的死亡原因不同。因此，對于人癌異體移植試驗，生命延長率的死亡原因不同。因此，對于人癌異體移植試驗，生命延長率并不是理想的觀測指標。并不是理想的觀測指標。體內抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤活性試驗體內抗腫瘤活性試驗裸鼠皮下移植瘤模型裸鼠皮下移植瘤模型腫瘤體積腫瘤體積(tumor volume,TV)的計算公式為：的計算公式為：V = 1/2ab2 或或/6abc其中其中a、b、c分別表示長寬高。兩公式的相關性極好，可采用任一公式。分別表示長寬高。兩公式的相關性極好，可采用任一公式。根據(jù)測量結果計算出相對腫瘤體積（根據(jù)測量結果計算出相對腫瘤體積（relative tumor volume，RTV），）， RTV = Vt / V0。其中其中V0為分籠給藥時為分籠給藥時(即即d0)測量