RPHPLC法測定垂體后葉注射液升壓素與縮宮素效價的研究

1、2013年藥物分析雜志優(yōu)秀論文評選交流會論文集22分離度試驗稱取l、2、3、4適量，用流動相溶解并稀釋制成每l mL中約含40斗g的溶液，作為分離度 測試溶液，按“21”項色譜條件測定，見圖2(圖略)。結(jié)果顯示出峰順序為1、4、3、2，相鄰色譜峰間的分離度 大于30。 23檢測限試驗稱取1、2、3、4適量，用流動相溶解并稀釋制成一系列溶液，按“21”項下色譜條件測定。 結(jié)果3的濃度為020斗g·mL。時的SN為28，1的濃度為012“g·mL一時的SN為25，2的濃度為 025斗g·mL。1時的SN為29，4的濃度為020xg·mL。時的SlV為28。2

2、4強制破壞試驗稱取美索巴莫約01 g，置于50 mL量瓶中，分別經(jīng)酸(1 tool·L。1鹽酸溶液5mL，室溫放置30 min)、堿(1 tool·L。1氫氧化鈉溶液5 mL，室溫放置30 min)、氧化(30過氧化氫 10 mL，室溫放置3 h)、熱(甲醇12 mL，100 oC水浴加熱3 h)和光(甲醇2 mL，自然光下照射5 h)破 壞后，將上述經(jīng)酸、堿破壞的供試品溶液分別中和后，用流動相溶解并稀釋至刻度作為測定液，其余 樣品用流動相溶解并稀釋至刻度作為測定液。按“21”項下色譜條件測定，見圖3(圖略)。試驗結(jié) 果顯示在堿性試驗條件下最不穩(wěn)定，在酸、熱等試驗條件下有降

3、解產(chǎn)物產(chǎn)生，在氧化、光等試驗條件 下基本穩(wěn)定。25影響因素試驗舊。 取本品，分別放置在60電熱恒溫箱中(高溫試驗)，RH 925的容器中(高濕度 試驗)，光強度4500 k的試驗箱中(強光照射試驗)。于第10 d分別稱取上述樣品約01 g，置于50 mL量瓶 中，用流動相溶解并稀釋至刻度作為測定液。按“21”項下色譜條件測定。試驗結(jié)果顯示美索巴莫幾乎沒 有引濕性，在高溫(60)、高濕(RH 925)和光照(4500 lx)條件下基本穩(wěn)定。表明本品在固體狀態(tài)穩(wěn)定 性良好。3討論與結(jié)論根據(jù)美索巴莫的合成工藝，本品可能存在的雜質(zhì)有1(起始原料)、2(中間體)和4副產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)式見圖 4(圖略)。經(jīng)檢測

4、3批樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品中存在2個雜質(zhì)，經(jīng)對雜質(zhì)與雜質(zhì)對照品的相對保留時間和紫 外光吸收圖譜進行比對，確定樣品中的雜質(zhì)為l和4。其中雜質(zhì)1為未反應(yīng)完全的起始原料，雜質(zhì)4為中間 體2氨解時的副產(chǎn)物。同樣，在強制破壞試驗中，采用降解產(chǎn)物與雜質(zhì)對照品的相對保留時間和紫外光吸收圖譜進行比對，確 定了在酸性條件下的主要降解產(chǎn)物為4；在熱、堿性條件下的主要降解產(chǎn)物為I和4。雜質(zhì)l來源于c處酯 鍵的水解，雜質(zhì)4為a處羥基與b處羰基進行的酯交換反應(yīng)產(chǎn)生的，見圖5(圖略)。上述試驗結(jié)果表明：美 索巴莫在溶液狀態(tài)，酸性條件下主要發(fā)生分子內(nèi)的酯交換(重排)反應(yīng)；熱、堿性條件下還會發(fā)生酯鍵的 水解。從以上試驗結(jié)果可以獲

5、知：雜質(zhì)l和4即是工藝雜質(zhì)，也是降解產(chǎn)物。因此，合成工藝中通過優(yōu)化反應(yīng) 條件、工藝參數(shù)等可降低雜質(zhì)的含量；貯藏環(huán)境避免高溫和水分等可降低產(chǎn)生降解產(chǎn)物的風險；同時提示制 劑工藝中應(yīng)避免酸性、堿性輔料的使用和高溫操作的工藝。本文采用HPLCDAD法，結(jié)合雜質(zhì)對照品確證了美索巴莫的雜質(zhì)，方法簡便。參考文獻(略】lipI-1PLC法測定垂體后葉注射液升壓素與縮宮素效價的研究史芳亮，黃堅，邵泓，陳鋼(上海市食品藥品檢驗所，上海201203)摘要 目的：建立測定垂體后葉注射液升壓素與縮宮素效價的高效液相色譜法，探討HPLC法代替生物測定法的可行性。方 法：應(yīng)用InertsiODSSP色譜柱(46 mm x

6、250 mm，5斗m)；以002 mol·L“的磷酸二氫鈉溶液為流動相A，以004 t001 L。1磷酸二氫鈉溶液一乙腈(50：50)為流動相B，梯度洗脫；流速為10 mL·min；檢測波長為220 nm。結(jié)果：升壓素和縮宮 素的峰面積與濃度的線性關(guān)系良好(r>09988)，平均加樣回收率升壓素在10951162之間，縮宮素在923。2013年藥物分析雜志優(yōu)秀論文評選交流會論文集985之Pq。RPHPLC法與生物測定法測定結(jié)果有一定差異，但兩者間有很好的相關(guān)性。結(jié)論：RPHPLC法快捷，重復(fù)性 好，易于操作，影響因素少，可替代生物測定法測定垂體后葉注射液的升壓素與縮宮

7、素的效價。 關(guān)鍵詞：垂體后葉注射液；RPHPLC；升壓素效價；縮宮素效價；Studies on RP-HPLC determination of the assaysof vasopressin and oxytocin of posterior pituitary injectionSHI Fangliang，HUANG Jian，SHAO Hong，CHEN Gang(Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China)Abstract 0bjecfive：To establish a RPHPLC meth

8、od for determination of the assays of vasopressin and oxytoein of posterior pituitary injection，and to estimate if the biological assay could be substituted by RPHPLCMethods： The analysis was performed on Inertsil ODSSP column(46 mm×250 mm，5 Ixm)in gradient mode with using 002 tool·Lsodium

9、 dihydrogen phosphate as mobile phase A and 004 mol·L一1 sodium dihydrogen phosphate in 50acetonitrile as mobile phase BThe flow rate was 10 mL·min一1 and the detection wavelength was at 220 nnlResults：The method had good linear relationship between the response and the amount about vasopres

10、sin and oxytoein with the correlation coefficients above 09988The average recoveries of vasopressin were 1095一1 162and those of oxytoein were 923一985There were differences between the results obtained from RPHPLC and the biological methodbut the results obtained from RPHPLC showed good correlation w

11、ith those from biological methodConclusion：The PRHPLC method offers simple and fast operation，high accuracy，and it can replace the biological methodKey words：posterior pituitary injection；RPHPLC；the assay of vasopressin；the assay of oxytocin垂體后葉注射液系由豬或羊或牛等動物的腦垂體后葉經(jīng)脫水、干燥、研細，再用稀醋酸提取制得的無菌 溶液 ，為激素類藥物。本品

12、為生物提取的多組分制劑，主要具有2種生物功效：升壓作用和縮宮作用，而起 這2種功效作用的成分就是升壓素和縮宮素，兩者均為九肽化合物。大多數(shù)哺乳動物來源(如人、牛等)的 升壓素8一位為精氨酸，稱精氨酸升壓素；豬源升壓素有1個氨基酸與前者不同，8一位為賴氨酸，稱賴氨酸 升壓素；不同來源的縮宮素結(jié)構(gòu)均相同2。本品在臨床上可用于肺、支氣管出血，消化道出血，并適用于產(chǎn) 科催產(chǎn)及產(chǎn)后收縮子宮、止血，對尿崩癥有減少排尿量的作用。本品為國家基本藥物，收載于2005年版中國 藥典二部n。升壓素作為效價測定，縮宮素作為檢查項，兩者的測定均采用生物測定法。本文旨在探討RPHPLC法測定垂體后葉注射液升壓素與縮宮素效

13、價的可行性，為本品的質(zhì)量標準提高提供一個方向。1儀器與試藥儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀，Biopac MP十六道生理記錄儀。 試劑：垂體后葉國家標準品(148升壓單位·mg，187縮宮單位·mg，批號5028709)、EP縮宮素標準品(096 mg·瓶，600 IU·mg，批號40)、豬源升壓素(肽含量87，純度98，批號V6879 039K0319，Sigma公司)、牛源升壓素(肽含量89，純度97，水分7，批號V9879038K8728，Sigma公 司)；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。樣品：62批樣品為2011年國家評價性抽驗樣

14、品，來自4家生產(chǎn)企業(yè)，動物來源均為豬源。2方法與結(jié)果21標準品溶液的制備 垂體后葉標準品溶液：參照2010年版中國藥典二部附錄1升壓素生物測定法中標準溶液的配制，將垂體后葉國家標準品制成每1 mL含升壓素3 u和6 U的溶液，此溶液相應(yīng)每1 mL含縮宮素379 U和758 U。2013年藥物分析雜志優(yōu)秀論文評選交流會論文集一73一升壓素標準溶液：精密稱取豬源升壓素適量，加025醋酸溶液制成每1 mL含升壓素50斗g、100斗g的溶液?？s宮素標準品溶液：取EP縮宮素標準品1瓶，加025醋酸溶液制成每1 mL含縮宮素48卜g(288 IU)、96斗g(576 IU)的溶液。22色譜條件色譜柱：In

15、ertsil ODSSP色譜柱(46 mm×250 mm，5 pm)；流動相：A為002 mol·L“的磷酸二氫鈉溶液，B為004 tool·L一磷酸二氫鈉溶液一乙腈(50：50)，梯度洗脫(O30 min：7040A； 30。40 min：40A：40。50 min：40-+10A；5060 min：10A)；流速為l mL·min；檢測波長為220 Ilm；柱溫：30；進樣量：50 IxL；取樣品原液進樣。系統(tǒng)適應(yīng)性溶液各成分間的分離度應(yīng)不小于15，系統(tǒng)適 應(yīng)性溶液、垂體后葉標準品溶液、供試品溶液及025醋酸溶液色譜圖見圖1(圖略)。 23線性、精密

16、度及回收率考察精密稱取豬源升壓素，用025醋酸溶液制成濃度為4646斗g·mL。1 的標準溶液。取EP縮宮素標準品1瓶，加025醋酸溶液制成濃度為4800 ILg·mL。1的標準品溶液。 精密量取上述2種溶液各l、3、5、7、9 mL，分別置同一10 mL量瓶中，用025醋酸溶液稀釋至刻度，制 成6個系列濃度的線性溶液。按“22”液相色譜條件進行測定，以標準品進樣濃度(ILg·mL。1)為橫坐 標，峰面積為縱坐標，進行線性擬合，升壓素在464646。46 Izg·mL一濃度范圍內(nèi)，線性良好，相關(guān)系數(shù) 為09988；縮宮素在48004800斗g·

17、mL1(288288 Iu·mL。1)濃度范圍內(nèi)，線性良好，相關(guān)系數(shù) 為09999。精密量取升壓素濃度為662 U·mL1的垂體后葉標準品溶液50¨L，在“22”項色譜條件下，連續(xù)進樣 6次，升壓素峰面積的RSD為184，縮宮素峰面積的RSD為276。4家企業(yè)各選取一批樣品進行加樣回收率考察，平均回收率升壓素在1095一1162之間，縮宮素在923985之間。24 RPHPLC法與生物測定法結(jié)果比較 以垂體后葉標準品溶液為定量標準品溶液，采用RP HPLC法與2010年版中國藥典二部附錄¨，4 o升壓素與縮宮素生物測定法，分別對62批樣品進行了測 定，結(jié)

18、果見表1(表略)。對2種方法測得的數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，結(jié)果見圖2(圖略)。分析顯示測定 縮宮素效價2種方法相關(guān)性良好，測定升壓素效價2種方法相關(guān)性較好，測定兩者比值2種方法相關(guān) 性較差。3討論31參照BP(2010)”1縮宮素的含量測定方法建立垂體后葉注射液升壓素與縮宮素的RPHPLC測定方 法。本品的成分復(fù)雜，含多種雜蛋白，為使升壓素和縮宮素能與相鄰的色譜峰達到基線分離，并確保各成分 均能洗脫，將梯度進行適當調(diào)整，并延長洗脫時間。該色譜條件可同時分離三氯叔丁醇，樣品的色譜圖表明 有其他成分干擾三氯叔丁醇出峰，因此三氯叔丁醇的測定未采用該方法測定。 32垂體后葉注射液的現(xiàn)行標準中缺少升壓素和縮宮素的鑒別項，本方法可作為本品的鑒別項。在該液相 色譜條件下，豬源升壓素峰與牛源升壓素峰分離度可達到17，升壓素峰、縮宮素峰與相鄰的色