蛋白質(zhì)分離純化及鑒定

1、會(huì)計(jì)學(xué)1蛋白質(zhì)分離純化及鑒定蛋白質(zhì)分離純化及鑒定 利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來(lái)進(jìn)行分離。據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來(lái)進(jìn)行分離。Kd=(Ve-Vo)/Via. 溶脹：溶脹：稱取適量凝膠干粉，用約稱取適量凝膠干粉，用約10倍蒸餾水倍蒸餾水浸泡浸泡24小時(shí)以上，待凝膠充分溶脹后，傾去小時(shí)以上，待凝膠充分溶脹后，傾去上層懸浮物及蒸餾水。上層懸浮物及蒸餾水。b. 堿洗：堿洗：用用0.5 M NaOH 溶液浸泡半個(gè)小時(shí)，然溶液浸泡半個(gè)小時(shí)，然后用蒸餾水洗至中性。后用蒸餾水洗至中性。c. 酸洗：酸洗：用用0.5 M HCl 溶液浸泡

2、半個(gè)小時(shí)，然后溶液浸泡半個(gè)小時(shí)，然后用蒸餾水洗至中性。用蒸餾水洗至中性。d. 平衡：平衡：用起始緩沖液浸泡凝膠，直至凝膠液用起始緩沖液浸泡凝膠，直至凝膠液pH與起始緩沖液相同。與起始緩沖液相同。a. 將層析柱垂直固定，加入適將層析柱垂直固定，加入適量溶劑排走空氣。量溶劑排走空氣。b. 將平衡好的凝膠攪勻，連續(xù)將平衡好的凝膠攪勻，連續(xù)傾入柱中，待其自然沉降至傾入柱中，待其自然沉降至1/41/3高時(shí)打開(kāi)下端出口，高時(shí)打開(kāi)下端出口，讓溶劑慢慢流出，繼續(xù)侵入讓溶劑慢慢流出，繼續(xù)侵入凝膠至沉降到所需高度。裝凝膠至沉降到所需高度。裝柱時(shí)要注意操作壓。柱時(shí)要注意操作壓。c.用用3-5倍柱床體積的起始緩沖倍柱

3、床體積的起始緩沖液走柱，使交換劑充分平衡液走柱，使交換劑充分平衡，柱床穩(wěn)定。，柱床穩(wěn)定。4. 裝柱裝柱a. 如圖裝好層析裝置，打開(kāi)下端出如圖裝好層析裝置，打開(kāi)下端出口，使溶液流出至剛好達(dá)到凝膠口，使溶液流出至剛好達(dá)到凝膠膠面膠面b. 沿柱壁緩慢加入沿柱壁緩慢加入2ml樣品，打開(kāi)下樣品，打開(kāi)下端出口，使樣品溶液流出至剛好端出口，使樣品溶液流出至剛好達(dá)到凝膠膠面，再取少量起始緩達(dá)到凝膠膠面，再取少量起始緩沖液洗滌柱壁。沖液洗滌柱壁。c.打開(kāi)起始緩沖液閥門(mén)，連續(xù)洗脫打開(kāi)起始緩沖液閥門(mén)，連續(xù)洗脫。d. 用自動(dòng)部分收集器自動(dòng)或手動(dòng)收用自動(dòng)部分收集器自動(dòng)或手動(dòng)收集，合并同一高峰各管。集，合并同一高峰各管。

4、應(yīng)應(yīng)用用分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%) 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系1.2 1.2 凝膠濃度的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)凝膠濃度的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)圖2 夾心垂直板電泳槽示意圖 1.樣品槽模板 2.長(zhǎng)玻璃板 1.導(dǎo)線接頭 2.下貯槽 3.凹形橡膠框 4.樣品槽模板 5.固定螺絲 6.上貯槽 7.冷凝系統(tǒng)圖3 蛋白質(zhì)微型電泳系統(tǒng)1.5 1.5 不連續(xù)體系凝膠對(duì)蛋白的分離作用不連續(xù)體系凝膠對(duì)蛋白的分離作用2.1 SDS-不連續(xù)體系凝膠制備不連續(xù)體系凝膠制備2. 操

5、作步聚操作步聚 試劑名稱試劑名稱 分離膠分離膠 (8%)濃縮膠濃縮膠 (4%) 分離膠緩沖液分離膠緩沖液1.25 ml /濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液 / 0.5 ml水水2.4 ml 1.2 mlTEMED 10 ul 5 mlAP 60 ul 25 ul聚丙烯酰胺凝膠配制聚丙烯酰胺凝膠配制2.2 樣品處理樣品處理適量濃度蛋白溶液加入適量濃度蛋白溶液加入1上樣緩沖液上樣緩沖液混勻，混勻，95水浴中處理水浴中處理5分鐘。分鐘。2.3 加樣加樣 用微量進(jìn)樣器取用微量進(jìn)樣器取10-15 l上述混合液，通過(guò)上述混合液，通過(guò)電極緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。電極緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹

6、形樣品槽底部。2.4 電泳電泳將電泳儀的正極與下槽連接，負(fù)極與上槽連將電泳儀的正極與下槽連接，負(fù)極與上槽連接，打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)，開(kāi)始時(shí)電流為接，打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)，開(kāi)始時(shí)電流為10 mA，待樣品進(jìn)，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電流調(diào)至入分離膠后，將電流調(diào)至20-30 mA，當(dāng)溴酚藍(lán)染料距，當(dāng)溴酚藍(lán)染料距硅膠框硅膠框1 cm時(shí)，停止電泳，關(guān)閉電源。時(shí)，停止電泳，關(guān)閉電源。2.5 染色與脫色染色與脫色 電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下膠框，用凝膠鏟小心撬開(kāi)短玻璃板，膠框，用凝膠鏟小心撬開(kāi)短玻璃板，從凝膠板上切從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記下一角作為加樣標(biāo)記，在兩側(cè)溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心，在

7、兩側(cè)溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心，加入染色液染色，加入染色液染色1-2 h，再用脫色液脫色，直至，再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計(jì)算相對(duì)遷移率蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計(jì)算相對(duì)遷移率2.6 結(jié)果處理結(jié)果處理 各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離離(cm)，按下式計(jì)算相對(duì)遷移率，按下式計(jì)算相對(duì)遷移率mR: 蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離(cm) 溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離(cm)相對(duì)遷移率相對(duì)遷移率mR=a. 溶脹：溶脹：稱取適量凝膠干粉，用約稱取適量凝膠干粉，用約10倍蒸餾水倍蒸餾水浸泡浸泡24小時(shí)以上，待凝膠充分溶脹后，

8、傾去小時(shí)以上，待凝膠充分溶脹后，傾去上層懸浮物及蒸餾水。上層懸浮物及蒸餾水。b. 堿洗：堿洗：用用0.5 M NaOH 溶液浸泡半個(gè)小時(shí)，然溶液浸泡半個(gè)小時(shí)，然后用蒸餾水洗至中性。后用蒸餾水洗至中性。c. 酸洗：酸洗：用用0.5 M HCl 溶液浸泡半個(gè)小時(shí)，然后溶液浸泡半個(gè)小時(shí)，然后用蒸餾水洗至中性。用蒸餾水洗至中性。d. 平衡：平衡：用起始緩沖液浸泡凝膠，直至凝膠液用起始緩沖液浸泡凝膠，直至凝膠液pH與起始緩沖液相同。與起始緩沖液相同。a. 如圖裝好層析裝置，打開(kāi)下端出如圖裝好層析裝置，打開(kāi)下端出口，使溶液流出至剛好達(dá)到凝膠口，使溶液流出至剛好達(dá)到凝膠膠面膠面b. 沿柱壁緩慢加入沿柱壁緩慢加入2ml樣品，打開(kāi)下樣品，打開(kāi)下端出口，使樣品溶液流出至剛好端出口，使樣品溶液流出至剛好達(dá)到凝膠膠面，再取少量起始緩達(dá)到凝膠膠面，再取少量起始緩沖液洗滌柱壁。沖液洗滌柱壁。c.打