常規(guī)抗血清的制備方法PPT學習教案

1、會計學1常規(guī)抗血清的制備方法常規(guī)抗血清的制備方法 第一節(jié)第一節(jié) 常規(guī)抗血清的制備方法常規(guī)抗血清的制備方法一、動物的免疫二、抗血清的采集第1頁/共37頁1、免疫動物的選擇2、抗原接種3、佐劑的應(yīng)用動物的免疫動物的免疫第2頁/共37頁免疫動物的選擇免疫動物的選擇種屬與品系經(jīng)濟性“R”型與“H”型經(jīng)驗性適配第3頁/共37頁抗原接種抗原接種劑量：注射途徑：間隔與免疫時間：接種次數(shù)：第4頁/共37頁佐劑的概念與種類佐劑的概念與種類概念：與抗原同時或先于抗原進入 機體，以提高抗原的免疫原 性的物質(zhì)。種類：非免疫原性物質(zhì) 免疫原性物質(zhì)第5頁/共37頁佐劑的作用機理佐劑的作用機理延長抗原的作用時間增強吞噬作用

2、刺激抗原提呈促進細胞因子分泌誘導淋巴細胞分裂、增殖影響T細胞“極化”第6頁/共37頁1、采集方法2、血清的分離與滅活抗血清的采集抗血清的采集第7頁/共37頁采集方法采集方法一次性采集多次性采集第8頁/共37頁抗血清的分離與滅活抗血清的分離與滅活血清析出的溫度血清的滅活第9頁/共37頁 第二節(jié)第二節(jié) 單克隆抗體的制備方法單克隆抗體的制備方法一、單克隆抗體與雜交瘤技術(shù)二、單克隆抗體的制備過程三、單克隆抗體的特性第10頁/共37頁單克隆抗體與雜交瘤技術(shù)單克隆抗體與雜交瘤技術(shù)1、單克隆抗體2、雜交瘤技術(shù)第11頁/共37頁表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗體單克隆抗體第12頁/共37頁單克

3、隆抗體單克隆抗體 由一個識別單一抗原決由一個識別單一抗原決定簇（表位）的定簇（表位）的B細胞克隆所細胞克隆所產(chǎn)生的同源抗體。產(chǎn)生的同源抗體。第13頁/共37頁雜交瘤技術(shù)雜交瘤技術(shù) 通過融合經(jīng)免疫的小鼠脾細胞和建系小鼠骨髓瘤細胞，以獲得同時具有抗體分泌功能和保持細胞永生性特征的雜交瘤細胞克隆。是獲取單克隆抗體的主要技術(shù)途徑。第14頁/共37頁單克隆抗體制備過程單克隆抗體制備過程1、致敏淋巴細胞的準備2、骨髓瘤細胞的準備3、細胞融合4、選擇性培養(yǎng)5、抗體分泌細胞的篩選6、克隆化過程7、單克隆抗體的制取第15頁/共37頁抗原致敏淋巴細胞骨髓瘤 細胞融合選擇性 培養(yǎng)抗體分泌細胞篩選克隆化單抗制取單抗純

4、化單抗鑒定第16頁/共37頁致敏淋巴細胞的準備致敏淋巴細胞的準備動物選擇：品系、年齡、性別、健康狀態(tài)抗原接種：方式體內(nèi)、體外 劑量g 次數(shù)視抗原而定 間隔視抗原而定 佐劑視抗原而定收集時間：末次接種后72h第17頁/共37頁骨髓瘤細胞的準備骨髓瘤細胞的準備細胞株處于良好的生長狀態(tài)細胞株保持HGPRT缺陷狀態(tài)第18頁/共37頁細胞融合細胞融合方式：物理、化學、生物PEG融合要點：（見圖）第19頁/共37頁致敏淋巴細胞骨髓瘤細胞離心 1000rpm 10min50%PEG 1ml培養(yǎng)液 10ml離心 1000rpm 7min37。C搖動、由慢漸快1min、靜止加入HAT培養(yǎng)液懸浮細胞，置于培養(yǎng)孔內(nèi)

5、第20頁/共37頁選擇性培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)隨機融合后的細胞類型HAT選擇培養(yǎng)原理第21頁/共37頁隨機融合后的細胞類型隨機融合后的細胞類型細胞組合 HGPRT 生長狀態(tài)淋巴細胞 + 骨髓瘤 + 長期生長淋巴細胞 + 淋巴細胞 + 短期生長骨髓瘤 + 骨髓瘤 不能生長未融合淋巴細胞 + 短期生長未融合骨髓瘤 不能生長第22頁/共37頁HAT選擇培養(yǎng)原理選擇培養(yǎng)原理核苷酸從頭合成途徑（de novo synthesis）核苷酸補救合成途徑（salvage synthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黃嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）第23頁/共37頁抗體分泌細胞的篩選抗體分泌細胞的篩選對篩選方法

6、的要求： 多大量樣品一次檢測 快迅速取得檢測結(jié)果 準檢測結(jié)果可靠性高 靈檢測方法靈敏度高常用篩選方法： ELISA、RIA、CDC、IFA等第24頁/共37頁克隆化過程克隆化過程概念：建立單一細胞克隆方法：有限稀釋法克隆建立的標準：連續(xù)兩次以上100%陽性孔飼養(yǎng)細胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾細胞第25頁/共37頁有限稀釋法有限稀釋法計數(shù)103/ml102/ml10/ml孔第26頁/共37頁單克隆抗體的制取單克隆抗體的制取制取方式：體外培養(yǎng)罐法體內(nèi)腹腔接種純化：鹽析、層析、制備型HPLC鑒定：特征鑒定Ig類型、親和力、效價、特異性決定簇鑒定是否針對同一決定簇第27頁/共37頁多抗與單抗制劑的比較

7、多抗與單抗制劑的比較 多抗 單抗 單抗 （血清） （腹水） （培養(yǎng)上清）特異性抗體含量（mg/ml） 無關(guān)Ig含量（mg/ml） 10 0.5-1 其他血清蛋白 大量 極少 均一性 + +特異性 多決定簇 單決定簇 單決定簇穩(wěn)定性 較好 略差 略差重復性 差 好 好第28頁/共37頁單克隆抗體的特性單克隆抗體的特性1、理化性狀高度均一2、抗原結(jié)合性高度特異3、生物活性高度單一第29頁/共37頁 第三節(jié)第三節(jié) 抗體的純化與鑒定抗體的純化與鑒定一、抗體純化的目的與方法二、純化抗體的鑒定與保存第30頁/共37頁抗體純化的目的抗體純化的目的1、去除雜蛋白2、去除雜抗體3、去除非同類抗體第31頁/共37頁抗體純化的方法抗體純化的方法1、鹽析、層析技術(shù)2、抗原吸附第32頁/共37頁純化抗體的鑒定純化抗體的鑒定1、多克隆抗體的鑒定2、單克隆抗體的鑒定第33頁/共37頁純化抗體的保存純化抗體的保存1、4。C保存2、 20。C保存3、冷凍干燥保存第34頁/共37頁本章小結(jié)本章小結(jié)1、多克隆抗體的制備2、雜交瘤技術(shù)的原理與應(yīng)用3