應(yīng)用生物質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)-生物質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)磷酸化位

1、應(yīng)用生物質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)項(xiàng)目完成人員：王紅霞 李衛(wèi)華 李?lèi)?ài)玲 劉炳玉項(xiàng)目完成單位：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心摘 要 蛋白質(zhì)的可逆磷酸化具有重要的生物學(xué)意義，對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析有助于闡明蛋白質(zhì)磷酸化的機(jī)制與功能。生物質(zhì)譜是目前進(jìn)行蛋白質(zhì)磷酸化分析最有力的方法之一。我們用天然磷酸化蛋白建立了中性丟失掃描和固相金屬親和色譜（IMAC）兩種基于質(zhì)譜的磷酸化蛋白分析方法。應(yīng)用這兩種方法均可將從蛋白質(zhì)酶切混合物中找出磷酸化肽段，進(jìn)而通過(guò)序列分析定位磷酸化位點(diǎn)。兩種方法具有不同的特點(diǎn)及局限性，具體研究中還要視具體情況優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。蛋白質(zhì)可逆磷酸化是最普遍、最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾

2、（PTM）。在哺乳動(dòng)物中大約有三分之一的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是磷酸化修飾的，對(duì)眾多生物化學(xué)功能起開(kāi)/關(guān)調(diào)控作用，是一種普遍的調(diào)控機(jī)制。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化在信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著非常重要的作用。蛋白質(zhì)組研究的一個(gè)重要方面就是蛋白質(zhì)磷酸化修飾的分析鑒定。目前沒(méi)有一個(gè)自動(dòng)測(cè)序方法能夠?qū)θN主要的磷酸化氨基酸，即磷酸化絲氨基酸（pSer）、磷酸化蘇氨基酸（pThr）和磷酸化酪氨酸（pTyr）。毛細(xì)管電泳（CE）可以分析蛋白質(zhì)或多肽的磷酸化及磷酸化氨基酸，但是鑒定蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)首先要用高效液相色譜（HPLC）分離蛋白的酶解肽段，然后用CE篩測(cè)磷酸化肽，最后用自動(dòng)Edman降解氨基酸分析法確定其磷酸化位點(diǎn)，工作量大

3、，不是快速和高通量分析方法。生物質(zhì)譜（MS）是揭示蛋白質(zhì)許多翻譯后修飾和蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析的一個(gè)不可缺少的工具，所用的蛋白質(zhì)樣品量在fmol水平。是唯一能夠與蛋白質(zhì)組研究水平相匹配的方法。近年來(lái)，生物質(zhì)譜的發(fā)展顯著地促進(jìn)了對(duì)具有生物學(xué)功能的磷酸化蛋白質(zhì)的研究，是國(guó)際上當(dāng)前最重要的一個(gè)前沿領(lǐng)域，也是目前蛋白質(zhì)組研究的一個(gè)重要方面。這種方法的成功建立，將使人們對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)的研究跨上一個(gè)新的臺(tái)階，對(duì)功能性蛋白的尋找和作用機(jī)制探尋具有重要意義，在國(guó)內(nèi)具有廣泛的需求。但由于一起條件等限制，國(guó)內(nèi)此方面的報(bào)道還不多。我們用天然磷酸化蛋白建立了中性丟失掃描和固相金屬親和色譜（IMAC）兩種基于質(zhì)譜的磷酸化蛋

4、白分析方法。中性丟失掃描法具有很高的靈敏度，檢測(cè)限在fmol級(jí)。固相金屬親和色譜（IMAC）法是近年來(lái)應(yīng)用最廣泛的特異性富集磷酸化肽段的方法，該方法適用于微量復(fù)雜樣品的處理。目前微量IMAC 預(yù)裝柱ZipTipMC已經(jīng)商品化，可以方便的與Nanospray微量分析系統(tǒng)相匹配。這兩種方法的建立和成熟運(yùn)用將為磷酸化蛋白的研究提供便利條件。一、材料與方法1材料試劑：ZipTipMC，ZipTip-C18 為millipore公司產(chǎn)品。磷酸化蛋白-casein蛋白為sigma產(chǎn)品，純度90。Trypsin為德國(guó)Roche診斷公司經(jīng)修飾的測(cè)序級(jí)的酶（產(chǎn)品編號(hào)1418025），硝酸鉫（Ga(NO3)3）為

5、Aldrich公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水器制備的超純水。色譜純乙腈為美國(guó)Fisher Scientific 產(chǎn)品；a-氰基-4-羥基肉桂酸(a-CCA)為Bruker提供；三氟乙酸(TFA)為 Fluka公司產(chǎn)品。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。儀器：電噴霧四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Q-Tof2，Micromass），配有masslynx數(shù)據(jù)系統(tǒng)?；|(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Autoflex，Bruker)。2方法1) 蛋白的溶液酶切：稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白-casein 50g，溶于50L 25mM NH4HCO3中。 加入分裝保存的胰蛋白酶1 ug，37，12h后取出部分稀釋成所

6、需濃度備用。2) 離子親和層析IMAC法富集磷酸化肽段：ZipTipMC用0.1乙酸50乙腈水溶液洗3次，用200mM Ga(NO3)3溶液洗10次，用超純水洗3次，用1乙酸10乙腈水溶液洗3次， 0.1乙酸10乙腈水溶液洗5次，蛋白質(zhì)酶解混合物用酸性溶液（20乙酸或1甲酸水溶液）調(diào)pH至2以下，用ZipTipMC吸取、排出10次以上，ZipTipMC用0.1乙酸10乙腈水溶液洗6次，用超純水洗3次，23L 0.3N氨水洗脫；3) 質(zhì)譜分析： 電噴霧質(zhì)譜儀為英國(guó)Micromass公司的電噴霧四極桿正交加速飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀Q-TOF2。配備毛細(xì)管液相色譜和納升噴霧源。鍍金屬鈀的硼硅酸鹽電噴霧針

7、（palladim-coated borosilicate electrospray needle）(Protana, Odense, Denmark)是一次性使用的專(zhuān)用needle。碰撞氣體為氬氣。源溫80°C，錐孔電壓50V左右。TOF 加速電壓為9.1KV。MCP 檢測(cè)器電壓為2200V。當(dāng)進(jìn)行手動(dòng)測(cè)序時(shí)，毛細(xì)管電壓為800-1200V可得到穩(wěn)定的噴霧。調(diào)節(jié)碰撞能量和碰撞氣體的大小使得到一個(gè)好的串聯(lián)質(zhì)譜圖。該質(zhì)譜圖經(jīng)Micromass的專(zhuān)用軟件MaxEnt3處理后，用Micromass的專(zhuān)用軟件MasSeq直接推倒出肽段序列。Nanoflow probe進(jìn)樣毛細(xì)管電壓為3000

8、v。所有測(cè)定均在正離子方式下進(jìn)行，用Glu-fib(sigma)的串聯(lián)質(zhì)譜碎片校正，質(zhì)量準(zhǔn)確度±0.2Da。中性丟失掃描：設(shè)定掃描范圍4002000，掃描方式為中性丟失掃描，尋找中性丟失49的雙電荷離子?；|(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀為Bruker公司的Autoflex，將樣品溶于0.1%TFA中，取1L與飽和CCA基質(zhì)上清液混合，取1µL點(diǎn)在Scorce384靶上，送入離子源中進(jìn)行檢測(cè)。反射檢測(cè)方式；飛行管長(zhǎng)2.5m；氮激光器：波長(zhǎng)337nm；加速電壓25KV；檢測(cè)電壓1.6KV；反射電壓23KV。校正用Peptide Calibration Standard(Br

9、uker)。二、結(jié)果與討論1、中性丟失掃描：1L 1g/L -casein酶解混合物用50乙腈水溶液稀釋為100L（約500fmol/L）注射泵進(jìn)樣，正離子中性丟失掃描模式掃描中性丟失49的雙電荷離子（圖1）。掃描得到一質(zhì)荷比為1031.50的雙電荷峰。圖1：上半部分為中性丟失49掃描的離子流色譜圖，下半部分為掃描總離子流色譜圖。圖中所示的肽段為掃描得到的磷酸化肽段，與-casein理論酶切所得到的磷酸化肽段質(zhì)荷比一致。將儀器切換至正離子MS/MS模式下，選擇離子1031.50進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析得到磷酸化肽段的序列（圖2）FQSEEQQQTEDELQDK其中S為磷酸化的絲氨酸。該段序列為牛-ca

10、sein 前體蛋白的48 63位氨基酸序列。圖2 ：m/z為1031.50肽段的denovo測(cè)序結(jié)果圖中上方序列由左至右為肽段的C端到N端。標(biāo)記處為磷酸化絲氨酸。-casein有5個(gè)磷酸化位點(diǎn)，除50位絲氨酸外， 30、32、33、34位均有磷酸化，但胰酶酶解后四個(gè)位點(diǎn)在一個(gè)肽段上，有文獻(xiàn)報(bào)道磷酸化位點(diǎn)較多的肽段在正離子模式下不易電離，因此我們都沒(méi)能得到這一肽段的質(zhì)譜峰。中性丟失掃描可以高靈敏度準(zhǔn)確的定位磷酸化肽段。但不適于分析在復(fù)雜混合物中的相對(duì)含量較低的磷酸化肽段。2. IMAC法選擇性富集磷酸化肽段： 用1甲酸水溶液將樣品稀釋為不同濃度（100fmol/L, 500fmol/L,2pmo

11、l/L 5pmol/L），各取 5L分別用鉫離子親和色譜ZipTipMC處理，洗脫后取1L 直接進(jìn)行MAILD-Tof質(zhì)譜檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明經(jīng)濃度為2pmol/L 以上的樣品ZipTipMC處理之后的樣品中非磷酸化肽段幾乎全部被除去，磷酸化肽段信號(hào)顯著增強(qiáng)；低于此濃度的樣品經(jīng)處理后質(zhì)譜圖中無(wú)磷酸化肽信號(hào)。AB圖3：2pmol/l胰酶酶解混合物ZipTipMC處理前后的肽指紋譜。A為處理前；B為處理后，箭頭所指為磷酸化肽段有文獻(xiàn)報(bào)道不同的金屬離子富集磷酸化肽段的選擇性和靈敏度不同，我們選擇的金屬鉫離子是選擇性和靈敏度均比較理想的一種能金屬離子，其缺點(diǎn)是比較昂貴。另外，研究表明該方法具有一定的局限性：1、磷酸化肽段的損失，一部分磷酸化肽段不能吸附在色譜柱上，另外一部分磷酸化肽段難于洗脫下來(lái)。2、洗