分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與步驟(2)

1、精品文檔表達(dá)蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析一、原理細(xì)菌體中含有大量蛋白質(zhì)，具有不同的電荷和分子量。強(qiáng)陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用，通過加熱使蛋白質(zhì)解離，大量的SDS結(jié)合蛋白質(zhì)，使其帶相同密度的負(fù)電荷，在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）上，不同蛋白質(zhì)的遷移率僅取決于分子量。采用考馬斯亮蘭快速染色， 可及時(shí)觀察電泳分離效果。因而根據(jù)預(yù)計(jì)表達(dá)蛋白的分子量，可篩選陽性表達(dá)的重組體。二、試劑準(zhǔn)備1、30%儲(chǔ)備膠溶液： 丙烯酰胺 （ Acr ）29.0g ，亞甲雙丙烯酰胺 （ Bis ）1.0g ，混勻后加 ddH2O，37OC溶解 , 定容至 100ml,棕色瓶存于室溫。2、1.5M Tri

2、s-HCl(pH8.0) ：Tris18.17g 加 ddH2O溶解 ,濃鹽酸調(diào)pH 至 8.0, 定容至 100ml 。3、 1M Tris-HCl(pH 6.8)： Tris 12.11g 加 ddH2O溶解 ,濃鹽酸調(diào)pH 至 6.8, 定容至 100ml 。4、 10% SDS：電泳級(jí)SDS 10.0 g加 ddH2O 68助溶 , 濃鹽酸調(diào)至pH 7.2, 定容至 100ml。5、 10 電泳緩沖液 (pH 8.3)： Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g， 10% SDS 10ml 加 ddH2O溶解 ,定容至 100ml。6、 10%過硫酸銨（ AP）： 1gAP 加 d

3、dH2 O至 10ml。7、 2 SDS電泳上樣緩沖液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，- 巰基乙醇1.0ml ， SDS 0.6 g ，甘油 2.0ml ， 0.1%溴酚蘭 1.0ml ， ddH2 O 3.5ml 。8、考馬斯亮蘭染色液：考馬斯亮蘭0.25 g，甲醇 225ml，冰醋酸46ml ，ddH2O 225ml 。9、脫色液 : 甲醇、冰醋酸、ddH2O以 3 1 6 配制而成。二、 操作步驟采用垂直式電泳槽裝置（一）聚丙烯酰胺凝膠的配制1、分離膠 (10%) 的配制 :24.0mlddH O30%儲(chǔ)備膠3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SD

4、S0.1ml10% AP0.1ml。1歡迎下載精品文檔取 1ml 上述混合液 , 加 TEMED(N,N,N ,N - 四甲基乙二胺 )10 l 封底 , 余加 TEMED4 l ,混勻后灌入玻璃板間，以水封頂，注意使液面平。（凝膠完全聚合需30-60min ）2、積層膠（ 4%）的配制：ddH 2O1.4 ml30% 儲(chǔ)備膠0.33 ml1M Tris-HCl0.25 ml10%SDS0.02 ml10%AP0.02 mlTEMED2 l將分離膠上的水倒去, 加入上述混合液, 立即將梳子插入玻璃板間，完全聚合需15-30min 。（二）樣品處理：將樣品加入等量的2× SDS上樣緩沖

5、液，100加熱 3-5min ，離心 12000g×1min ，取上清作SDS-PAGE分析，同時(shí)將SDS低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作平行處理。（三）上樣 :取 10 l 誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)的處理后的樣品加入樣品池中, 并加入 20 l 低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照。（三）電泳 : 在電泳槽中加入1 電泳緩沖液，連接電源，負(fù)極在上，正極在下，電泳時(shí)，積層膠電壓60V, 分離膠電壓100V, 電泳至溴酚蘭行至電泳槽下端停止（約需3hr ）。（四）染色 : 將膠從玻璃板中取出，考馬斯亮蘭染色液染色，室溫4-6hr 。（五）脫色 : 將膠從染色液中取出, 放入脫色液中 , 多次脫色至蛋白帶清晰。（六）凝膠攝

6、像和保存：在圖像處理系統(tǒng)下將脫色好的凝膠攝像，結(jié)果存于軟盤中，凝膠可保存于雙蒸水中或7%乙酸溶液中。三、注意事項(xiàng)1、實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組所加總蛋白含量要相等。2、為達(dá)到較好的凝膠聚合效果，緩沖液的 pH 值要準(zhǔn)確， 10%AP在一周內(nèi)使用。 室溫較低時(shí)，TEMED的量可加倍。3、未聚合的丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，可通過皮膚和呼吸道吸收，應(yīng)注意防護(hù)。2歡迎下載精品文檔表達(dá)蛋白的分離與純化大腸桿菌表達(dá)蛋白以可溶和不溶兩種形式存在，需要不同的純化策略。 現(xiàn)在， 許多蛋白質(zhì)正在被發(fā)現(xiàn)而事先并不知道它們的功能，這些自然需要將蛋白質(zhì)分離出來后，進(jìn)行進(jìn)一步的研究來獲得。分析蛋白質(zhì)的方法學(xué)現(xiàn)已極大的簡化

7、和改進(jìn)。必須承認(rèn)，蛋白質(zhì)純化比起DNA克隆和操作來是更具有藝術(shù)性的，盡管 DNA序列具有異乎尋常的多樣性 （因而它是唯一適合遺傳物質(zhì)的） ，但它卻有標(biāo)準(zhǔn)的物理化學(xué)性質(zhì)，而每一種蛋白質(zhì)則有它自己的由氨基酸序列決定的物理化學(xué)性質(zhì) （因而它具有執(zhí)行眾多生物學(xué)功能的用途）。正是蛋白質(zhì)間的這些物理性質(zhì)上的差異使它們得以能進(jìn)行純化但這也意味著需要對(duì)每一種待純化的蛋白質(zhì)研發(fā)一套新的方法。 所幸的是，盡管存在這種固有的困難，但現(xiàn)已有多種方法可以利用，蛋白質(zhì)純化策略也已實(shí)際可行。 目前， 待研究蛋白或酶的基因的獲得已是相當(dāng)普遍的事?？烧T導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)特別是 Studier 等發(fā)展的以噬菌體T7RNA聚合酶為基礎(chǔ)的表

8、達(dá)系統(tǒng)的出現(xiàn)使人們能近乎常規(guī)地獲得過表達(dá) （ overexpression），表達(dá)水平可達(dá)細(xì)胞蛋白的2%以上，有些甚至高達(dá) 50%。一、可溶性產(chǎn)物的純化（融合 T7· Tag 的表達(dá)蛋白）（一）試劑準(zhǔn)備采用 T7· Tag Affinity Purification Kit1 T7· Tag 抗體瓊脂。2 B/W 緩沖液： 4.29mM Na2HPO4， 1.47 mM KH2PO4， 2.7 mM KCl ， 3. 0.137mM NaCl ，1%吐溫-20 ， pH7.3 。4. 洗脫緩沖液 : 0.1M 檸檬酸， pH2.2 。5. 中和緩沖液： 2M Tr

9、is ， pH10.4 。1. PEG 20000 。（二）操作步驟1.100ml含重組表達(dá)質(zhì)粒的菌體誘導(dǎo)后，離心5000g× 5min，棄上清，收獲菌體，用10ml預(yù)冷的 B/W緩沖液重懸。2.重懸液于冰上超聲處理，直至樣品不再粘稠，4離心 14000g × 30min，取上清液， 0.45m膜抽濾后作為樣品液。3. 將結(jié)合 T7· Tag 抗體的瓊脂充分懸起，平衡至室溫，裝入層析柱中。4. B/W 緩沖液平衡后樣品液過柱。5. 10ml B/W 緩沖液過柱，洗去未結(jié)合蛋白。3歡迎下載精品文檔6. 用 5ml 洗脫緩沖液過柱，每次 1ml ，洗脫液用含 150l

10、 中和緩沖液的離心管收集，混勻后置于冰上，直接 SDS-PAGE分析。7.將洗脫下來的蛋白放入透析袋中，雙蒸水透析24hr ，中間換液數(shù)次。8. 用 PEG 20000 濃縮蛋白。（三）注意事項(xiàng)蛋白在過層析柱前，要0.45 m膜抽濾，否則幾次純化后，柱子中會(huì)有不溶物。二、包涵體的純化包涵體是外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，尤其在大腸桿菌中高效表達(dá)時(shí)，形成的由膜包裹的高密度、 不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在顯微鏡下觀察時(shí)為高折射區(qū)，與胞質(zhì)中其他成分有明顯區(qū)別。包涵體形成是比較復(fù)雜的，與胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)生成速率有關(guān)，新生成的多肽濃度較高，無充足的時(shí)間進(jìn)行折疊，從而形成非結(jié)晶、無定形的蛋白質(zhì)的聚集體；此外，包涵體的形

11、成還被認(rèn)為與宿主菌的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分、溫度、pH 值、離子強(qiáng)度等因素有關(guān)。細(xì)胞中的生物學(xué)活性蛋白質(zhì)常以可融性或分子復(fù)合物的形式存在，功能性的蛋白質(zhì)總是折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)型。包涵體內(nèi)的蛋白是非折疊狀態(tài)的聚集體，不具有生物學(xué)活性，因此要獲得具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)必須將包涵體溶解，釋放出其中的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行蛋白質(zhì)的復(fù)性。包涵體的主要成分就是表達(dá)產(chǎn)物，其可占據(jù)集體蛋白的40% 95%，此外，還含有宿主菌的外膜蛋白、 RNA聚合酶、 RNA、 DNA、脂類及糖類物質(zhì)，所以分離包涵體后，還要采用適當(dāng)?shù)姆椒ǎㄈ缟V法）進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的純化。（一）試劑配制1緩沖液A： 50mM Tris-HCl （

12、pH8.0 ）,2mM EDTA,100mM NaCl。2緩沖液B： 50mM Tris-HCl （ pH8.0 ）,1mM EDTA,100 mM NaCl,1%NP-40。3緩沖液： 50mMTris-HCl（ pH8.0 ）,2mM EDTA,100 mMNaCl,0.5%TritonX-100(V/V),4M脲素。4緩沖液：50M Tris-HCl（ pH8.0 ）,2mM EDTA,100 mM NaCl,3% Triton X-100。1緩沖液：50mM Tris-HCl （ pH8.0 ） ,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,2M鹽酸胍。

13、5緩沖液C： 8M脲素， 10mM - 巰基乙醇， 100 mM Tris-HCl（ pH8.0 ）， 2mM EDTA及脫氧膽酸鈉。（二）操作步驟1用緩沖液A 漂洗菌體細(xì)胞 （ 10ml/g ）,離心 6000g× 15min ，收集菌體細(xì)胞， 重復(fù)此步驟，。4歡迎下載精品文檔將菌體細(xì)胞再在緩沖液A 中洗滌一次。2將漂洗過的菌體細(xì)胞懸浮于緩沖液B 中，超聲破碎，鏡檢，破碎率高于95%，離心 1500g×30min ，收集包涵體沉淀。3將包涵體沉淀用緩沖液、緩沖液、緩沖液分別超聲洗滌一次，1500g 離心收集包涵體沉淀。4包涵體的溶解：用含高濃度脲素的緩沖液室溫放置30mi

14、n，然后離心1500g× 30min，留上清。將溶解后的蛋白質(zhì)適當(dāng)稀釋，磁力攪拌，透析過夜。5溶解后的包涵體蛋白可通過親和層析進(jìn)一步純化。表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性的檢測(cè)一、 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性（一）原理活細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶能催化無色的MTT形成藍(lán)色的甲肷，其形成的量與活細(xì)胞數(shù)和功能狀態(tài)呈正相關(guān)。對(duì)細(xì)胞活力有影響的表達(dá)蛋白活性檢測(cè)可以通過MTT比色法進(jìn)行。（二）試劑準(zhǔn)備1、青鏈霉素溶液（100X）：青霉素100 萬 U，鏈霉素100 萬 U，溶于 100mlddH2O中 ,抽濾除菌。2、L15 基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 1000mlL15 培養(yǎng)基， 加 2g碳酸氫鈉， 10ml 100X

15、青鏈霉素， 5mlHEPES。3、MTT 液： 5mg/ml 溶于 L15 基礎(chǔ)培養(yǎng)基。4、SDS 處理液： 20gSDS， 50 l 二甲基甲酰胺，加雙蒸水50ml 溶解。5、L- 多聚賴氨酸： 50 g 溶于 1ml 雙蒸水中。6、L15 基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解的不同濃度的蛋白液。（三）操作步驟（以背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)為例）1、 無菌條件下取新生一天的SD大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）。2、 鏡下去除神經(jīng)根和外膜，放入 1ml 0.1% 膠原酶中 37消化 30min，每 5min 搖勻一次。3、 洗去膠原酶， 吹打分散后， 接種于預(yù)先涂有 L- 多聚賴氨酸的 96 孔培養(yǎng)板中， 每孔含 100 l 無血

16、清 L15 培養(yǎng)基，細(xì)胞約 800 個(gè)。4、 實(shí)驗(yàn)組分別加入純化的表達(dá)蛋白（分別以不同的蛋白濃度），陰性對(duì)照加入等體積表達(dá)。5歡迎下載精品文檔蛋白的溶劑。5、 37 5%CO2培養(yǎng) 48hr 后，每孔加入10 l MTT ， 37 5%CO2孵育 4hr 。6、 加入 100 l 20% 的 SDS處理液， 37孵育 20hr 。7、 用 EL× 800 微孔酶標(biāo)儀測(cè)定OD570 值，數(shù)據(jù)分析。二、 DRG無血清培養(yǎng)檢測(cè)促神經(jīng)生長作用（一）操作步驟：1、無菌條件下取新生一天的SD大鼠 DRG。2、鏡下去除神經(jīng)根和外膜，接種于預(yù)先涂有L- 多聚賴氨酸的96 孔培養(yǎng)板中， 每孔 1 個(gè)

17、DRG。3、待 DRG貼壁后加入100 l 無血清 L15 基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 實(shí)驗(yàn)組加入純化的表達(dá)蛋白（分別以不同的蛋白濃度），陰性對(duì)照加入等體積的溶解表達(dá)蛋白的溶劑。4、 37 5%CO2培養(yǎng)，每天在Olympus 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況，并進(jìn)行測(cè)量，其數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)分析。二、注意事項(xiàng)1、 MTT有毒，注意防護(hù)。2、單個(gè) DRG貼壁實(shí)驗(yàn)操作難度較大，需仔細(xì)耐心。放射性同位素標(biāo)記的DNA序列測(cè)定分析測(cè)定 DNA的核苷酸序列是分析基因結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的前提。從小片段重疊法到加減法、雙脫氧鏈終止法、化學(xué)降解法、自動(dòng)測(cè)序，DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展很快。目前在實(shí)驗(yàn)室手工測(cè)序常用 Sanger 雙脫氧鏈終止法。

18、Sanger 法就是使用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止物測(cè)定DNA核苷酸序列的方法。它要求使用一種單鏈的DNA模板或經(jīng)變性的雙鏈DNA模板和一種恰當(dāng)?shù)腄NA合成引物。其基本原理是DNA聚合酶利用單鏈的DNA模板，合成出準(zhǔn)確互補(bǔ)鏈，在合成時(shí)，某種dNTP換成了 ddNTP，這時(shí)， DNA聚合酶利用2,3 - 雙脫氧核苷三磷酸作底物，使之摻入到寡核苷酸鏈的3末端，導(dǎo)致3末端無 3 -OH，從而終止DNA鏈的生長，雙脫氧核苷酸的種類不同，摻入的位置不同就造成了在不同的專一位置終止的長度不同的互補(bǔ)鏈。通過摻入放射性核苷酸和聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可讀出模板DNA的互補(bǔ)鏈序列。一、試劑準(zhǔn)備硅化液：四氯化碳25

19、0ml ，二氯二甲基硅烷25ml 。6歡迎下載精品文檔 6%變性 PAGE膠的配制：丙烯酰胺 28.5g ，N，N- 亞甲基雙丙烯酰胺 1.5g ，10× TBE50ml，尿素 210g，加 ddH2O至 500ml 攪拌溶解， 0.22 m濾膜過濾， 4貯存于棕色瓶中。使用時(shí)取 50ml 加入催化劑過硫酸銨（ 25%） 50 l ， TEMED 50 l ，輕搖混勻，立即灌膠。3. 質(zhì)粒 DNA堿變性液： NaOH 2M， NaAc 3M（ pH4.8 ），無水乙醇，70%乙醇。4.T7 測(cè)序試劑盒。二、操作步驟1. 測(cè)序板硅化，流水、 ddH2O洗，無水乙醇洗，晾干。2. 灌膠：

20、 裝好測(cè)序板， 玻璃板以 15-30 °角度傾斜放置， 用 50ml 注射器將凝膠灌到兩塊玻璃之間，將鯊魚齒梳子的平端插入膠的上緣，深約0.5-1cm 。夾好，將測(cè)序板放水平。聚合約 3hr 后預(yù)電泳。3.預(yù)電泳：按照說明要求安裝好電泳裝置，在上槽和下槽注入1× TBE。設(shè)置溫度50，功率 100W，時(shí)間約30min。（同時(shí)準(zhǔn)備測(cè)序反應(yīng)）4. 質(zhì)粒 DNA雙鏈堿變性： DNA 3-5 g 溶于 32 l ddH2O中，加 2N NaOH 8l ，混勻，室溫靜置 15min。加 3M NaAc 7l ，無水乙醇 120l ，混勻， -20 放置 30min。離心 12000g

21、× 15min，棄上清， 70%乙醇 500 l 洗一次，離心 12000g ×7min。棄上清，晾干沉淀， 10 l 滅菌 ddH2O溶解。5.模板與引物復(fù)性：加2l 測(cè)序引物、 2 l Annealing buffer，混勻，稍稍離心， 65溫育 5min ，立即放置于3710min ，室溫 5min 以上。6.標(biāo)記反應(yīng)：加 3 llabeling mixture 、 1 l 相應(yīng)放射性同位素（10 Ci ）、 2 lT7測(cè)序酶（使用前以稀釋液15 稀釋），混勻，離心，置 37 5min。7. 預(yù)先準(zhǔn)備四個(gè) 0.5ml 微量離心管，標(biāo)上 A、C、G、 T，分別在其中加入

22、 2.5 l 的 ddATP、ddCTP、 ddGTP、 ddTTP。8.鏈終止反應(yīng)：在A、C、G、T 四個(gè)微量離心管中分別加入反應(yīng)液4.5 l ，37 5min 。加入 stop solution 5 l ，短暫離心。9.上樣：關(guān)上預(yù)電泳電源，沖洗膠平面，將鯊魚齒插入膠平面中約1-2mm形成加樣孔。將四個(gè)反應(yīng)管置80 2min 。立即取1.5-2 l 加到加樣孔上。10電泳 : 50， 100W，電泳 2.5hr后，暫停電泳，在預(yù)留孔二次上樣后，繼續(xù)電泳2.5hr 。11下膠：停止電泳，取下測(cè)序板，倒掉電泳緩沖液。拆開測(cè)序板，凝膠應(yīng)粘在未硅化的的玻璃板上。裁一張比膠稍大一些的濾紙，平鋪在膠上

23、，掀起濾紙，凝膠就被一起掀起。7歡迎下載精品文檔12壓片：將凝膠蓋上保鮮膜，用monitor測(cè)讀放射強(qiáng)度，以估計(jì)曝光時(shí)間。在暗室中覆上 X 光片，置暗夾中，-70 放射自顯影。13洗片、讀片：取出暗夾，回到室溫。經(jīng)D72顯影、酸性定影液定影，水洗,晾干。在X光片燈上讀出序列。三、注意事項(xiàng)1. 測(cè)序板清洗、硅化的好壞直接影響灌膠及下膠。處理不好時(shí)容易導(dǎo)致灌膠時(shí)氣泡的產(chǎn)生，下膠時(shí)則易使電泳膠損壞。2. 灌膠時(shí)要避免膠的滲漏；注射器將凝膠灌到兩塊玻璃之間時(shí)，注意速度的控制，防止氣泡的產(chǎn)生。3. 測(cè)序反應(yīng)及電泳上樣時(shí)要注意小心操作，防止放射性同位素污染，同時(shí)要加強(qiáng)整個(gè)后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中自身的防護(hù)。4. 規(guī)

24、范、妥善處理放射性同位素接觸物品及廢棄物。手工測(cè)序需要使用同位素，這給操作帶來許多不便，對(duì)操作者也有一定的損害。DNA測(cè)序儀的出現(xiàn)解決了這一問題，它不使用同位素標(biāo)記，自動(dòng)化程度高，測(cè)序效果好。雖然DNA測(cè)序儀的價(jià)格目前仍比較高，但每次測(cè)序的花費(fèi)并不算高，而且商品化服務(wù)也令人滿意。聚合酶鏈反應(yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)聚合酶鏈反應(yīng)- 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Single Strand Conformation PolymorphismAnalysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP）是近年來發(fā)展起來的一種基因分析方法。PC

25、R-SSCP分析的基本程序?yàn)椋菏紫萈CR擴(kuò)增特定靶序列，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈，進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，DNA單鏈的遷移率除與DNA鏈的長短有關(guān)外， 更主要的是取決于DNA單鏈所形成的構(gòu)象。在非變性條件下， DNA單鏈可自身折疊形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。這種構(gòu)象由DNA單鏈堿基決定，其穩(wěn)定性靠分子內(nèi)局部順序的相互作用（主要為氫鍵） 來維持。 相同長度的DNA單鏈其順序不同，甚至單個(gè)堿基不同，所形成的構(gòu)象不同，電泳遷移率也不同。PCR產(chǎn)物變性后，單鏈產(chǎn)物經(jīng)中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，靶 DNA中含單堿基置換， 或數(shù)個(gè)堿基插入或缺失等改變時(shí)，因遷移率

26、變化會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)變位，從而可將變異DNA與正常 DNA區(qū)分開。 由此可見， PCR-SSCP。8歡迎下載精品文檔分析技術(shù)是一種DNA單鏈凝膠電泳技術(shù)， 它根據(jù)形成不同構(gòu)象的等長DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測(cè)基因變異。該技術(shù)已被廣泛用于癌基因和抗癌基因變異的檢測(cè)、遺傳病的致病基因分析以及基因診斷、基因制圖等領(lǐng)域。為了高靈敏特異性地顯示SSCP分析結(jié)果， 現(xiàn)已發(fā)展多種PCR-SSCP技術(shù)，各有其優(yōu)勢(shì)及適用領(lǐng)域。 例如，可以在PCR擴(kuò)增中用同位素或熒光素等標(biāo)記引物或核苷，也可以在電泳后用銀染或溴化乙錠染色以顯示結(jié)果。這里將重點(diǎn)介紹最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。在進(jìn)行

27、PCR擴(kuò)增特定靶基因序列時(shí)， 利用 - 32 P-ATP 標(biāo)記引物或直接在 PCR反應(yīng)體系中加入 - 32 P-dCTP 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，使擴(kuò)增產(chǎn)物帶有同位素標(biāo)記物，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影顯示結(jié)果。利用引物標(biāo)記或堿基摻入法使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物帶有同位素標(biāo)記物，均可使產(chǎn)物信號(hào)增強(qiáng)幾個(gè)數(shù)量級(jí)。二者相比較，前者經(jīng)濟(jì)、擴(kuò)增特異性強(qiáng)，多用于大樣本的檢測(cè)和篩選；后者操作簡便，適于一般實(shí)驗(yàn)室開展，可用于小樣本或大樣本的檢測(cè)和篩查。本節(jié)僅介紹同位素標(biāo)記堿基摻入法。一、試劑準(zhǔn)備 PCR相關(guān)試劑 - 32P-dCTP30聚丙烯酰胺（29： 1）：丙烯酰胺29g、甲叉雙丙烯酰

28、胺1g ，溶于100ml ddH2O中，4OC 保存。10過硫酸胺配制方法：1g過硫酸胺，溶于10ml ddH 2O中， 4 OC 保存（可用數(shù)周）。 TEMED（ N， N， N， N， N - 四甲基乙二胺） 5 × TBE緩沖液：Tris 堿 54g、硼酸 27.5g 、0.5M EDTA(pH8.0) 20ml，加 ddH2O至 1000ml。7變性上樣液：95% 甲酰胺、 0.03%二甲苯青、 0.05%溴酚藍(lán)、20mM EDTA(pH 8.0)二、 操作步驟 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)總體積為10 l ，在 0.5ml微量離心管中加入下列反應(yīng)成分：10 × buffer1

29、 ldNTPmix70 MDNA模板100ng引物及 Taq DNA 酶依實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求按比例加入 -32P-dCTP0.1 l加 ddH2O至10 l。9歡迎下載精品文檔按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，獲取擴(kuò)增產(chǎn)物。 聚丙烯酰胺凝膠電泳 電泳槽玻璃板的處理：用洗滌劑清洗玻璃板，自來水反復(fù)沖凈洗滌劑，雙蒸水沖洗3 次，晾干， 95乙醇擦拭，自然干燥。用棉簽沾取SigmaCote 涂于玻璃的貼膠面上，5 10min后再用軟紙擦拭除去多余的SigmaCote 溶液。在兩塊玻璃內(nèi)的兩側(cè)放好襯條對(duì)齊，用固定夾夾緊兩塊玻璃，并用玻璃膠帶封邊。 制膠：按照被分離 DNA片段的大小、 含量及玻璃板、 襯條的大小決

30、定凝膠的濃度與體積，一般來講使用 5 8的凝膠較為合適。輕輕搖勻配制的膠液于真空抽氣（開始時(shí)要緩慢）除氣泡，加 35 l TEMED 至聚丙烯酰胺混合液中，混勻。用10ml 玻璃吸管或 50ml 注射器吸取膠液，將玻璃模具傾斜成60O角，緩慢注入兩玻璃板間的空隙中，直至灌滿模具頂部。立即插入相應(yīng)的點(diǎn)樣梳，（小心勿使梳齒下帶進(jìn)氣泡，并且不要將梳齒全部插入膠內(nèi)，留約2mm梳齒于玻璃板上端，以免拔梳時(shí)把膠孔拔斷）。由于凝膠在聚合過程中有回縮，所以應(yīng)小心添加些膠液于梳子處，水平放置，室溫聚合1hr 。將封口玻璃膠帶掀去，放入電泳槽，凹型玻璃貼緊電泳緩沖液槽，用大號(hào)固定夾固定住兩側(cè)。在上下電泳槽內(nèi)灌入1

31、 × TBE電泳緩沖液。 小心取出點(diǎn)樣梳， 用槽內(nèi)的緩沖液反復(fù)沖洗點(diǎn)樣孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和氣泡。 擴(kuò)增產(chǎn)物的處理： 將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與變性上樣液按1：5 的比例加入0.5ml 微量離心管中，混勻。樣品上膠前應(yīng)98 o C 變性 10min ，立即冰浴驟冷。取約3 5 l 變性樣品（根據(jù)點(diǎn)樣孔的大小決定上樣量），以微量加樣器上樣，（上樣時(shí)要注意不要有氣泡沖散樣品，而且速度要快，時(shí)間長了樣品易于擴(kuò)散）。 電泳：電泳槽接上電極（上槽接負(fù)極，下槽接正極）開啟電源，根據(jù)擴(kuò)增片段的大小及電泳槽和凝膠的大小，決定電泳的電壓及電泳時(shí)間。通常室溫下以l 5V cm電泳。 剝膠：

32、電泳結(jié)束后，倒棄電泳緩沖液，取下電泳膠玻璃，用塑料楔子從玻璃板底部一角小心分開玻璃， 凝膠應(yīng)附著在一塊玻璃上，切去凝膠左上角，作為點(diǎn)樣順序標(biāo)記。剪一張與玻璃同樣大小的濾紙， 嚴(yán)密覆蓋于凝膠上， 順一個(gè)方向?qū)⒛z緩慢取下，用保鮮膜蓋于膠面并包好，避免膜和膠之間產(chǎn)生氣泡或皺折，將凝膠固定在X 線片夾中。放射自顯影：在暗室中將X 線片貼于膠面，蓋嚴(yán)片夾，用黑布將X 線片夾包裹，置 -70 OC放射自顯影。曝光時(shí)間根據(jù)同位素的強(qiáng)度而定，約24h 10d。 沖洗膠片從 -70oX 線片，立即顯影， 以免使 X 線片上C 取出 X 線片夾， 在暗室內(nèi)迅速取出出現(xiàn)過多的冷凝水。（如果想再得到一張放射自顯影影

33、像，可立即在片夾中裝一張新X線片10。歡迎下載精品文檔并盡快放回到一 70oC 繼續(xù)顯影。如果來不及再加入新片即已出現(xiàn)冷凝水則應(yīng)使樣品凝膠和X線片夾都恢復(fù)到室溫， 并擦去冷凝水后再裝入新的X 線片）。依次按以下程序操作進(jìn)行顯影：X 線片顯影液顯影1-5min水洗lmin定影液定影5min流動(dòng)水沖洗15min所有使用液的溫度應(yīng)為18 20OC 為宜。三、注意事項(xiàng) 核酸片段的大小 :用于 SSCP分析的核酸片段越小，檢測(cè)的敏感性越高。對(duì)于<200bp 的片段， SSCP可發(fā)現(xiàn)其中70的變異；對(duì)于300bP 左右的片段則只能發(fā)現(xiàn)其中50的變異；而 500bp 的片段， 則僅能檢出10 3O的變

34、異， 因此， <300bP，尤其是 150bP 左右的核酸片段更適于 SSCP分析。對(duì)于大于 400bp 的 PCR產(chǎn)物就需要設(shè)法進(jìn)一步處理，可以用限制性酶消化 PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生小于400bP 的 DNA片段，再進(jìn)行 SSCP分析。 游離引物 : 游離引物可能同PCR 產(chǎn)物結(jié)合而改變其泳動(dòng)率， 即使游離引物量為 6nM都有明顯影響。 因此，應(yīng)盡可能除去游離引物?？梢圆捎貌粚?duì)稱引物擴(kuò)增方法，盡可能消耗多余的引物。 也可以運(yùn)用過柱或磁性球方法純化PCR產(chǎn)物?；蛘呤窍♂?PCR產(chǎn)物， 減少游離引物的干擾。 低濃度變性劑 : 凝膠中加入低濃度的變性劑，如 5 -10 甘油、 5尿素或甲酸胺、10

35、二甲亞砜（ DMSO）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因?yàn)檩p微改變單鏈DNA的構(gòu)象， 增加分子的表面積， 降低單鏈 DNA的泳動(dòng)率。但有些變異序列卻只能在沒有甘油的凝膠中被檢出。因此，對(duì)同一序列使用2 3 種條件做 SSCP，可能提高敏感性。 電泳溫度 : 一般認(rèn)為保持凝膠內(nèi)溫度恒定是SSCP分析最關(guān)鍵的因素， 溫度有可能直接影響 DNA分子內(nèi)部穩(wěn)定力的形成及其所決定的單鏈構(gòu)象，從而影響突變的檢出。室溫下電泳適于大多數(shù)情況，但由于在電泳時(shí)溫度會(huì)升高，為確保電泳溫度相對(duì)恒定，應(yīng)采取以下措施：減少凝膠厚度，降低電壓，有效的空氣冷卻或循環(huán)水冷卻等。 凝膠的長度 : 可用測(cè)序板進(jìn)行SSCP分析，凝膠板

36、長度在 40cm 以上。 凝膠濃度及厚度 :凝膠濃度很重要，一般使用5 8的凝膠，凝膠濃度不同，突變帶的相對(duì)位置也不相同，如果在進(jìn)行未知突變種類的SSCP分析時(shí)，最好采用兩種以上凝膠濃度，這樣可以提高突變種類的檢出率。凝膠的厚度對(duì)SSCP分析也很重要，凝膠越厚，背景越深，在上樣量較多的前提下，盡量使凝膠越薄越好。11歡迎下載精品文檔 假陰性 :一般認(rèn)為，如沒有污染，PCRSSCP 分析不存在假陽性結(jié)果，但可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果， 后者是由于點(diǎn)突變引起的空間構(gòu)象變化甚微，遷移率相差無幾所致，尤其是點(diǎn)突變發(fā)生在擴(kuò)增片段的兩端時(shí)。如果有陽性和陰性對(duì)照，結(jié)果可以重復(fù)確定的突變帶是可信的，如果沒有陽性對(duì)照，

37、應(yīng)經(jīng)測(cè)序來確定其是否為突變帶。由于 PCR SSCP的不足之處主要是可能檢出假陰性結(jié)果。應(yīng)通過設(shè)置陽性對(duì)照，摸索電泳條件， 假陰性結(jié)果在很大程度上是可以避免的。但對(duì)未知基因變異的檢測(cè)，假陰性結(jié)果就難以百分之百地消除。8.結(jié)果分析 :單鏈凝膠電泳時(shí)，互補(bǔ)單鏈遷移率不同，一般形成兩條單鏈帶。PCR產(chǎn)物進(jìn)行單鏈凝膠電泳之前，通過加熱變性產(chǎn)生單鏈。如變性不徹底， 殘留雙鏈亦可形成一條帶因此， PCR SSCP分析結(jié)果至少顯示三條帶。但是，由于一種DNA單鏈有時(shí)可形成兩種或多種構(gòu)象，檢出三條或四條單鏈帶就不足為奇。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reactio

38、n ， PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。典型的PCR由（ 1）高溫變性模板；（ 2）引物與模板退火；（ 3）引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是：將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下（通常為93-94 ）使其變性解成單鏈；人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合，兩個(gè)引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的長短；耐熱的DNA聚合酶（Taq 酶）在 72將單核苷酸從引物的3端開始摻入，以目的基因?yàn)槟０鍙? 3方向延伸，合成DNA的新互補(bǔ)鏈。PCR 能快速特異擴(kuò)增任

39、何已知目的基因或DNA片段，并能輕易在皮克 （ pg）水平起始DNA混合物中的目的基因擴(kuò)增達(dá)到納克、微克、毫克級(jí)的特異性DNA片段。因此， PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析， 還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá)調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機(jī)制的探索，法醫(yī)鑒定等諸多方面。通常，PCR在分子克隆和 DNA分析中有著以下多種用途：(1) 生成雙鏈 DNA中的特異序列作為探針；(2) 由少量 mRNA生成 cDNA 文庫；。12歡迎下載精品文檔(3) 從 cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量

40、 DNA以進(jìn)行序列測(cè)定；(5) 突變的分析；(6) 染色體步移；(7) RAPD 、AFLP、 RFLP等 DNA多態(tài)性分析等。一、試劑準(zhǔn)備1. DNA 模版2對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物3 10× PCR Buffer4 2mM dNTPmix：含 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP各 2mM5 Taq 酶二、操作步驟1在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml 離心管中。10× PCR buffer5ldNTP mix（ 2mM）4 l引物 1（ 10pM）2l引物 2（ 10pM）2lTaq酶 （ 2U/ l ）1lDNA模板（ 50ng-1 g/ l ）1

41、l加 ddH2O至50 l視 PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。2 調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置 PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在 93預(yù)變性 3-5min ，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93 40s 58 30s 72 60s ，循環(huán) 30-35 次，最后在 72 保溫 7min。3 結(jié)束反應(yīng)， PCR產(chǎn)物放置于4待電泳檢測(cè)或-20 長期保存。4 PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100 l 氯仿進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10 l 電泳檢測(cè)。三、 PCR反應(yīng)體系的組成與反應(yīng)條件的優(yōu)化PCR 反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液（ 10× PCR Buffe

42、r ）、脫氧核苷三磷酸底物（ dNTPmix）、耐熱 DNA聚合酶（ Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（ Primer1 ， Primer2 ）、靶序列（ DNA模板）。13歡迎下載精品文檔五部分組成。各個(gè)組份都能影響PCR結(jié)果的好壞。1 反應(yīng)緩沖液：一般隨Taq DNA 聚合酶供應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl2+（pH8.3 室溫）， 1.5mM MgCl2。Mg 的濃度對(duì)反應(yīng)的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響。濃度過高，使反應(yīng)特異性降低； 濃度過低， 使產(chǎn)物減少。 在各種單核苷酸濃度為2+200 M時(shí)，Mg 為 1.5mM較合適。若樣品中含 EDTA或其它螯合物，可適當(dāng)

43、增加Mg2+的濃度。在高濃度 DNA及 dNTP條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，也必須相應(yīng)調(diào)節(jié)2+1.5-2mM（終濃度）較好。Mg 的濃度。據(jù)經(jīng)驗(yàn)，一般以2 dNTP ：高濃度 dNTP易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，過高則可能不擴(kuò)增；但濃度過低，將降低反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。 PCR中常用終濃度為50-400 M的 dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應(yīng)相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低） ，就會(huì)誘發(fā)聚合酶的錯(cuò)誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應(yīng)。此外，2+2+dNTP能與 Mg 結(jié)合，使游離的Mg 濃度降低。因此， dNTP的濃度直接影響到反應(yīng)中起重要作用的2+Mg 濃度。3 Taq DNA聚

44、合酶酶：在 100 l 反應(yīng)體系中，一般加入2-4U 的酶量，足以達(dá)到每min 延伸 1000-4000 個(gè)核苷酸的摻入速度。 酶量過多將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。 但是，不同的公司或不同批次的產(chǎn)品常有很大的差異， 由于酶的濃度對(duì) PCR反應(yīng)影響極大， 因此應(yīng)當(dāng)作預(yù)試驗(yàn)或使用廠家推薦的濃度。當(dāng)降低反應(yīng)體積時(shí)（如20 l 或 50l ），一般酶的用量仍不小于2U，否則反應(yīng)效率將降低。4 引物： 引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵， 引物設(shè)計(jì)在PCR反應(yīng)中極為重要。要保證 PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通常引物設(shè)計(jì)要遵循以下幾條原則：引 物的 長 度以15-30bp為 宜， 一般 （ G

45、+C）的 含 量在45-55%， Tm 值 高 于55 Tm=4(G+C)+2(A+T)。應(yīng)盡量避免數(shù)個(gè)嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列， 堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出是隨機(jī)的。引物的 3端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補(bǔ)，避免引物內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物在3端不應(yīng)出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3端末位堿基在很大程度上影響著Taq 酶的延伸效率。兩條引物間配對(duì)堿基數(shù)少于5 個(gè)，引物自身配對(duì)若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對(duì)數(shù)不能超過3個(gè)由于影響引物設(shè)計(jì)的因素比較多，現(xiàn)常常利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)。人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng)PAGE或離子交換 HPLC進(jìn)行純化。引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個(gè)弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-

46、dimer），二是當(dāng)擴(kuò)增微量靶序列并且起始材料又比較粗時(shí)，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說來， 用低濃度引物不僅經(jīng)濟(jì)，而且反應(yīng)特異性也較好。一般用0.25-0.5pM/ l較好。引物一般用 TE 配制成較高濃度的母液（約100 M），保存于 -20 。使用前取出其中。14歡迎下載精品文檔一部分用ddH2O配制成 10 M或 20 M的工作液。5 模板： PCR對(duì)模板的要求不高，單、雙鏈DNA均可作為PCR的樣品。雖然PCR可以用極微量的樣品（甚至是來自單一細(xì)胞的DNA）作為摸板，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般還宜用 g 水平的基因組DNA或 104 拷貝的待擴(kuò)增片段作為起始材料。原材料可以是粗制品，

47、某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴(kuò)增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白，將可能干擾PCR反應(yīng)。6 PCR 循環(huán)加快，即相對(duì)減少變性、復(fù)性、延伸的時(shí)間，可增加產(chǎn)物的特異性。四、注意事項(xiàng)PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。最好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。 PCR試劑配制應(yīng)使用最高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22 m濾膜過濾除菌或高壓滅菌。試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿

48、意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。 PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。帶有相同末端 ( 平端或粘端 ) 的外源 DNA片段必須克隆到具有匹配末端的線性質(zhì)粒載體中, 但是在連接反應(yīng)時(shí) , 外源 DNA和質(zhì)粒都可能發(fā)生環(huán)化 , 也有可能形成串聯(lián)寡聚物。 因此，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩個(gè)DNA 的濃度，以便使“正確”連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最佳水平，此外還常常使用堿性磷酸酶去除5磷酸基團(tuán)以抑制載體DNA的自身環(huán)化。利用 T4 DNA 連接酶進(jìn)行目的 DNA片段和載體的體外連接反應(yīng)，也就是在雙鏈DNA 5磷酸和相鄰的 3羥基之間形成新的共價(jià)鍵。如載體的兩條鏈都帶有5磷酸（未脫磷），可形成4 個(gè)新的磷酸二酯鍵；如載體 DNA已脫磷， 則只能形成2 個(gè)新的磷酸二酯鍵， 此時(shí)產(chǎn)生的重組DNA帶有兩個(gè)單鏈缺口，在導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞后可被修復(fù)。（二） T4 DNA連接酶對(duì)目的DNA