PCR原理及其操作學習教案

1、會計學1PCR原理原理(yunl)及其操作及其操作第一頁，共40頁。第1頁/共39頁第二頁，共40頁。nDNA聚合酶使引物沿著單聚合酶使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈鏈模板延伸為雙鏈DNA。第2頁/共39頁第三頁，共40頁。第3頁/共39頁第四頁，共40頁。第4頁/共39頁第五頁，共40頁。第5頁/共39頁第六頁，共40頁。1234522557294時間（min）溫度（）低溫退火2高溫變性1適溫延伸3重復(chngf)13步2530輪目的DNA片段(pin dun)擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA變性形成2條單鏈DNA單鏈與引物復性子鏈延伸DNA加倍第6頁/共39頁第七頁，共40頁。第7頁/共

2、39頁第八頁，共40頁。第8頁/共39頁第九頁，共40頁。第9頁/共39頁第十頁，共40頁。第10頁/共39頁第十一頁，共40頁。第11頁/共39頁第十二頁，共40頁。第12頁/共39頁第十三頁，共40頁。第13頁/共39頁第十四頁，共40頁。第14頁/共39頁第十五頁，共40頁。第15頁/共39頁第十六頁，共40頁。第16頁/共39頁第十七頁，共40頁。第17頁/共39頁第十八頁，共40頁。第18頁/共39頁第十九頁，共40頁。第19頁/共39頁第二十頁，共40頁。第20頁/共39頁第二十一頁，共40頁。第21頁/共39頁第二十二頁，共40頁。u以上以上“變性、退火、延伸變性、退火、延伸”三

3、三部曲為部曲為PCR一輪循環(huán)。一輪循環(huán)。第22頁/共39頁第二十三頁，共40頁。第23頁/共39頁第二十四頁，共40頁。第24頁/共39頁第二十五頁，共40頁。R 產(chǎn)產(chǎn)物物的的特特異異性性取取決決于于引引物物與與模模板板DNA互互補補的的程程度度(chngd)。理理論論上，上，只只要要知知道道任任何何一一段段模模板板DNA序序列，列，就就能能按按其其設(shè)設(shè)計計互互補補的的寡寡核核苷苷酸酸鏈鏈做做引引物，物，用用PCR就就可可將將模模板板DNA在在體體外外大大量量擴擴增。增。第25頁/共39頁第二十六頁，共40頁。第26頁/共39頁第二十七頁，共40頁。第27頁/共39頁第二十八頁，共40頁。棲棲

4、熱熱水水生生桿桿菌菌中中提提純純基基因因工工程程酶：酶：大大腸腸菌菌合合成成一一個個(y )典典型型的的PCR反反應應約約需需酶酶量量（指指總總反反應應體體積積為為100l時）時）；濃濃度度過過高高可可引引起起非非特特異異性性擴擴增，增，濃濃度度過過低低則則合合成成產(chǎn)產(chǎn)物物量量減減少。少。第28頁/共39頁第二十九頁，共40頁。第29頁/共39頁第三十頁，共40頁。第30頁/共39頁第三十一頁，共40頁。濃度過低會降低濃度過低會降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少。減少。第31頁/共39頁第三十二頁，共40頁。第32頁/共39頁第三十三頁，共40頁。準反應中

5、采用三溫度點法，雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至4060退火，然后快速升溫至7075延伸，n對于(duy)較短靶基因（長度100300bp）可采用二溫度點法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94變性，65左右退火與延伸。第33頁/共39頁第三十四頁，共40頁。第34頁/共39頁第三十五頁，共40頁。重重要要因因素素n退退火火溫溫度度與與時時間間(shjin)，取取決決于于引引物物的的長長度、度、堿堿基基組組成成及及其其濃濃度，度，還還有有靶靶基基因因序序列列的的長長度度n對對于于20個個核核苷苷酸，酸，G+C含含量量約約50%的的引引物，物，55作作為為選選擇擇最最適適退退火火溫溫度度

6、的的起起點點較較為為理理想想第35頁/共39頁第三十六頁，共40頁。+2(A+T)n復復性性溫溫度度=Tm值值（510）n在在Tm值值允允許許范范圍圍內(nèi)，內(nèi)，選選擇擇(xunz)較較高高的的復復性性溫溫度度可可大大大大減減少少引引物物和和模模板板間間的的非非特特異異性性結(jié)結(jié)合，合，提提高高PCR反反應應的的特特異異性性n復復性性時時間間一一般般為為3060s，足足以以使使引引物物與與模模板板之之間間完完全全結(jié)結(jié)合合引物的復性溫度通過以下(yxi)公式幫助選擇合適的溫度：第36頁/共39頁第三十七頁，共40頁。第37頁/共39頁第三十八頁，共40頁。度度(chngd)n循循環(huán)環(huán)次次數(shù)數(shù)n主主要要取取決決于于模模板板DNA的的濃濃度度n循循環(huán)環(huán)次次數(shù)：數(shù)：選選在在3040次次之之間間n循循環(huán)環(huán)次次數(shù)數(shù)越越多，多，非非特特異異性性產(chǎn)產(chǎn)物物的的量量亦亦隨隨之之增增多多第38頁/共39頁第三十九頁，共40頁。NoImage內(nèi)容(nirng)總結(jié)會計學。第3頁/共39頁。以上“變性(binxng)、退火、延伸”三部曲為PCR一輪循環(huán)。引物3端的堿基應嚴格要求配對：特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。SDS：是溶解細