微生物的保藏技術(shù)

1、CompanyLOGO微生物的保藏方法微生物的保藏方法 主要內(nèi)容主要內(nèi)容常用的保藏方法常用的保藏方法1保藏原理保藏原理2注意事項注意事項3菌種保藏的原因菌種保藏的原因 通過分離純化得到的微生物純培養(yǎng)物，還必須通過各種保藏技術(shù)使其在一定時間內(nèi)不死亡，不會被其他微生物污染，不會因發(fā)生變異而丟失重要的生物學(xué)性狀，否則就無法真正保證微生物研究和應(yīng)用工作的順利進(jìn)行。 菌種保藏就是根據(jù)菌種特性及保藏目的的不同，給微生物菌株以特定的條件，使其存活而得以延續(xù)。菌種保藏原理菌種保藏原理 根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性，根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生

2、物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，使細(xì)胞基本處于休細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，使細(xì)胞基本處于休眠狀態(tài)，生長繁殖受到抑制但又不至眠狀態(tài)，生長繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。有抑制微生物的代謝作用。 低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。重要手段。美國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心美國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心 ATCC是美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心 。ATCC的成立可追溯到1925年，一個科學(xué)委員會認(rèn)識到科學(xué)研究對于微生物的大量需求而萌發(fā)了創(chuàng)建一個微生物相關(guān)制品供應(yīng)中心的想法

3、。ATCC以生命科學(xué)領(lǐng)域全方位知識的獲取，分類，匯總，完善進(jìn)而廣泛傳播為己任，以期為推動生物原料，生物信息，生物技術(shù)，知識產(chǎn)權(quán)，規(guī)范等相關(guān)領(lǐng)域的前沿性、合法化、實(shí)用性發(fā)揮一定的作用。 ATCC擁有目前世界上最大的、品種最豐富的微生物、細(xì)胞系以及重組DNA原料，同時它也是科研工作者公認(rèn)的提供世界級的可靠的研究材料的供應(yīng)商。 美國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心美國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心 美國典型微生物菌種保藏中心, American Type Culture Collection(ATCC) ATCC 主要從事農(nóng)業(yè)、遺傳學(xué)、應(yīng)用微生物、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、工業(yè)微生物學(xué)、菌種保藏方法、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、分子生物學(xué)、植物病理

4、學(xué)、普通微生物學(xué)、分類學(xué)、食品科學(xué)等的研究。 該中心保藏有藻類111株，細(xì)菌和抗生素16865株，細(xì)胞和雜合細(xì)胞4300株，絲狀真菌和酵母46000株，植物組織79株，種子600株，原生動物1800株，動物病毒、衣原體和病原體2189株，植物病毒1563種。另外，該中心還提供菌種的分離、鑒定及保藏服務(wù)。該中心保藏的菌種可出售。 中國菌種保藏管理中心中國菌種保藏管理中心 中國菌保會是國際認(rèn)可的菌種保藏機(jī)構(gòu)，下設(shè)中國菌保會是國際認(rèn)可的菌種保藏機(jī)構(gòu)，下設(shè)7個全國性菌種保藏管理中心：個全國性菌種保藏管理中心： （1）普通普通微生物菌種保藏管理中心；微生物菌種保藏管理中心； （2）農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏

5、管理中心；微生物菌種保藏管理中心； （3）工業(yè)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；微生物菌種保藏管理中心； （4）醫(yī)學(xué)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心；微生物菌種保藏管理中心； （5）抗生素抗生素菌種保藏管理中心；菌種保藏管理中心； （6）獸醫(yī)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；微生物菌種保藏管理中心； （7）林業(yè)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心。微生物菌種保藏管理中心。（1984 年年增加）增加） 中國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心中國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心 我國唯一的國家級工業(yè)微生物菌種資源保藏管理中心，中國微生物菌種保藏管理委員會和國際菌種保藏聯(lián)合會成員之一，隸屬于中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，專業(yè)從事工業(yè)微生物菌種資源保藏管理的公益基礎(chǔ)性

6、資源保藏機(jī)構(gòu)，負(fù)責(zé)全國工業(yè)生產(chǎn)與研究應(yīng)用微生物菌種資源的收集、整理、鑒定、保藏、供應(yīng)與國際交流。 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）保藏各種工業(yè)微生物菌種資源包括：細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌和大型真菌，共67個屬251種，近3000株，庫藏備份80000余支 。中國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心中國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心Agricultural Culture Collection of Chin（ACCC） ACCC是中國國家級農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理專門機(jī)構(gòu),負(fù)責(zé)全國農(nóng)業(yè)微生物菌種的收集、鑒定、評價、保藏、供應(yīng)及國際交流任務(wù). 庫藏菌種2490株,其中細(xì)菌1004株,放

7、線菌69株,絲狀真菌355株,酵母菌124株,食用菌582.中國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心中國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心成立（英文縮寫：CGMCC，設(shè)立在中國科學(xué)院微生物研究所） 1985年，開始用于專利程序的微生物保存 1995年，獲得布達(dá)佩斯條約國際保藏中心（IDA）的資格 1995年，加入中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會 宗旨和任務(wù) 。 作為一個非贏利性、公益性、服務(wù)性技術(shù)支撐機(jī)構(gòu)，CGMCC的宗旨是廣泛收集國內(nèi)外的微生物資源，妥善保存，以公開的保藏機(jī)構(gòu)的名義為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、衛(wèi)生健康、環(huán)境保護(hù)、科研教育提供標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)材料,在保證生物安全和保護(hù)知識產(chǎn)權(quán)的前提下，為第三

8、者能夠自由地利用各種微生物材料提供服務(wù)，最大限度的實(shí)現(xiàn)微生物資源的保護(hù)、共享和持續(xù)利用。 德國與韓國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心德國與韓國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心 德國微生物菌物保藏中心(DSMZ)，保藏有9400種細(xì)菌、2400種真菌、500種酵母菌、300種質(zhì)粒、500種動物細(xì)胞、500種植物細(xì)胞、170種動物雜腫瘤、600種植物病毒、90種細(xì)菌病毒等（德文，英文）。 韓國國家農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏（KACC），保藏有細(xì)菌890種、真菌1581種、酵母菌62種、cDNA 600種（英文）。 法國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心法國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心 法國國家歷史自然博物館Algotheque du實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中

9、心Algotheque du Laboratoire de Cryptogamie, Museum National dHistoire Naturelle（ALCP） ALCP隸屬于法國國家歷史自然博物館，主要從事于工業(yè)微生物學(xué)，應(yīng)用微生物學(xué)，微生物系統(tǒng)分類學(xué)，培養(yǎng)和保藏方法等方面的研究，以及藻類等微生物的分離，鑒定，保藏工作。保藏有藻類600種、細(xì)菌200種。該中心保藏的菌種可出售。 各國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心各國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心法國巴斯德研究所LInstitut Pasteur菌物保藏中心Collection de LInstitut Pasteur Of Institut Pasteur(C

10、IP) 加拿大國家微生物健康實(shí)驗(yàn)室微生物菌種保藏中心National Microbiology Laboratory Health Canada Culture Collections（NML-HCCC）日本生物技術(shù)研究所微生物菌種保藏中心Marine Biotechnology Institute Culture Collection, Marine Biotechnology Instituten(MBIC) 傳代培養(yǎng)保藏傳代培養(yǎng)保藏一、傳代培養(yǎng)保藏一、傳代培養(yǎng)保藏原理原理1優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)2注意事項注意事項3傳代培養(yǎng)的原理傳代培養(yǎng)的原理 有些微生物當(dāng)遇到冷凍或干燥等處理時，有些微生物當(dāng)遇到冷

11、凍或干燥等處理時，會很快死亡，因此在這種情況下，只能求會很快死亡，因此在這種情況下，只能求助于傳代培養(yǎng)保存法。傳代培養(yǎng)就是要定助于傳代培養(yǎng)保存法。傳代培養(yǎng)就是要定期地進(jìn)行菌種轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)后再保存，它是期地進(jìn)行菌種轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產(chǎn)菌種的保存。生產(chǎn)菌種的保存。傳代培養(yǎng)優(yōu)缺點(diǎn)傳代培養(yǎng)優(yōu)缺點(diǎn) 傳代培養(yǎng)保存法雖然簡便，但其傳代培養(yǎng)保存法雖然簡便，但其缺點(diǎn)也很明顯，如：菌種管棉塞經(jīng)缺點(diǎn)也很明顯，如：菌種管棉塞經(jīng)常容易發(fā)霉；菌株的遺傳性狀容易常容易發(fā)霉；菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異；反復(fù)傳代時，菌株的病發(fā)生變異；反復(fù)傳代時，菌株

12、的病原性、形成生理活性物質(zhì)的能力以及原性、形成生理活性物質(zhì)的能力以及形成孢子的能力等均有降低；需要形成孢子的能力等均有降低；需要定期轉(zhuǎn)種，工作量大；雜菌的污染定期轉(zhuǎn)種，工作量大；雜菌的污染機(jī)會較多。機(jī)會較多。傳代培養(yǎng)的注意事項傳代培養(yǎng)的注意事項 傳代保存時，培養(yǎng)基的濃度不宜過高，營養(yǎng)傳代保存時，培養(yǎng)基的濃度不宜過高，營養(yǎng)成分不宜過于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應(yīng)成分不宜過于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應(yīng)在可能的范圍內(nèi)盡量降低。培養(yǎng)溫度通常以稍低在可能的范圍內(nèi)盡量降低。培養(yǎng)溫度通常以稍低于最適生長溫度為好。若為產(chǎn)酸菌種，則應(yīng)在培于最適生長溫度為好。若為產(chǎn)酸菌種，則應(yīng)在培養(yǎng)基中添加少量碳酸鈣。養(yǎng)基

13、中添加少量碳酸鈣。 一般地，大多數(shù)菌種的保藏溫度以一般地，大多數(shù)菌種的保藏溫度以5為好，為好，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用種則可以使用37進(jìn)行保存，而蕈類等大型食用進(jìn)行保存，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。菌的菌種則可以室溫直接保存。 二、冷凍保藏原理二、冷凍保藏原理 適用于抗凍力強(qiáng)的微生物。這些微生物可在其菌體細(xì)胞外遭受凍結(jié)的情況下而不受損傷，而對其它大多數(shù)微生物而言，無論在細(xì)胞外凍結(jié)還是在細(xì)胞內(nèi)凍結(jié)，都會對菌體造成損傷，使其代謝作用停止，可達(dá)到保藏的目的。常用的冷凍保藏法常用的冷凍保藏法液氮保藏法液氮保藏法1低

14、溫冰箱保存法低溫冰箱保存法2干冰保存法干冰保存法3液氮保存法液氮保存法 一、適用范圍 液氮溫度在-196以下,用于快速制冷,速凍,機(jī)械安裝等,一般不用于日常生活,此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細(xì)胞均可長期保藏，而且性狀不變異。缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備。 二、保藏方法 a、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當(dāng)防凍劑（保存霉菌不用防凍劑）的滅菌溶液中，將0.21ml的這種溶液分裝于安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或?qū)⒕z體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。 b、熔封安瓶管：若直接貯存于氣相液氮中（150

15、170）時，則不需熔封。 c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4下，將熔封安瓶管在適當(dāng)?shù)纳厝芤褐薪?30分鐘后，觀察有無色素進(jìn)入安瓶。d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮?dú)庖约s1/min的速度冷卻至25左右，也可在2025的冰箱內(nèi)緩慢冷卻3060min。e、速冷：最后浸入液氮中快速冷卻至196。 這種方法適用范圍廣，而且是目前常用的較理想的，繁而高效。保藏期23年，甚至長達(dá)9年。低溫冰箱保存法低溫冰箱保存法 一、適用范圍 20、50或85 二、保藏方法 低溫冷凍保存時使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時菌液加量不宜過多，有些可添加保護(hù)劑。此外，也可用5mm的

16、玻璃珠來吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內(nèi)，再放入低溫冰箱內(nèi)進(jìn)行保存的。干冰保存法干冰保存法 一、適用范圍 70左右 二、保藏方法 將菌種管插入干冰內(nèi)，再置于冰箱內(nèi)進(jìn)行冷凍保存。菌種保藏的共同注意點(diǎn)：菌種保藏的共同注意點(diǎn)： 1、嚴(yán)格的無菌操作；、嚴(yán)格的無菌操作； 2、用于保存的微生物在生長前必須處于它生長、用于保存的微生物在生長前必須處于它生長良好的狀態(tài)；良好的狀態(tài)； 3、保藏過程中要防止退化的發(fā)生（不同的保藏、保藏過程中要防止退化的發(fā)生（不同的保藏方法，分別有不同的保存時間。）方法，分別有不同的保存時間。） 注意事項注意事項 要選擇適于冷凍干燥的菌齡細(xì)胞； 要選擇適宜的培養(yǎng)基，因?yàn)槟承┪⑸?/p>

17、物對冷凍的抵抗力，常隨培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異； 要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長； 最好在菌液內(nèi)不添加電解質(zhì)（如食鹽等）； 可在菌液內(nèi)添加甘油（甘油管冷凍保藏法）等保護(hù)劑，以防止在冷凍過程中出現(xiàn)菌體大量死亡的現(xiàn)象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護(hù)效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護(hù)劑時更有效。 原則上應(yīng)盡快進(jìn)行冷凍處理，但當(dāng)加入保護(hù)劑時，可靜置一段時間后再進(jìn)行處理。 就動物細(xì)胞而言，應(yīng)在20范圍內(nèi)以1/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對絕大多 數(shù)微生物而言，則不必如此，如結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的原蟲則可在35范

18、圍內(nèi)進(jìn)行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進(jìn)行冷凍； 若進(jìn)行長期保存，則貯藏溫度越低越好； 取用冷凍保存的菌種時，應(yīng)采取速融措施，即在3540溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應(yīng)選擇靜置融化的措施。當(dāng)冷凍菌融化后，應(yīng)盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降。 總之，首先保持原菌優(yōu)良性狀長期穩(wěn)定，同時考慮方法的通用性、操作的簡便性和設(shè)備的普及性。三、干燥保藏法三、干燥保藏法1、沙土管保存2、冷凍真空保藏沙土管保存沙土管保存1、主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種、主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏，如：芽孢桿菌、放線菌等。的保藏，如：芽孢桿菌、放線菌等。2、方法：

19、將菌種接種斜面，培養(yǎng)至長出大量、方法：將菌種接種斜面，培養(yǎng)至長出大量的孢子后，洗下孢子制備孢子懸液，加入的孢子后，洗下孢子制備孢子懸液，加入無菌的沙土管中，減壓干燥，直至將水分無菌的沙土管中，減壓干燥，直至將水分抽干，最后用石蠟、膠塞等封閉管口，置抽干，最后用石蠟、膠塞等封閉管口，置冰箱保存。冰箱保存。 沙土管保藏：用棉塞塞住安瓿管，放在能夠抽真空的干燥器中，然抽干后將真空干燥器的旋塞關(guān)閉即可。不用火焰封口，用時將真空干燥器放氣打開取出，剩余的繼續(xù)抽真空，抽至真空后關(guān)閉旋塞保藏即可。 此法簡單易行，并可以將微生物保藏較長時間，適合一般實(shí)驗(yàn)室及以放線菌等為菌種的發(fā)酵工廠采用。冰凍真空保藏冰凍真空

20、保藏 原理是首先將加有保護(hù)劑的細(xì)胞樣品原理是首先將加有保護(hù)劑的細(xì)胞樣品先預(yù)冷，使其凍結(jié)，然后在減壓下利用升先預(yù)冷，使其凍結(jié)，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分。事實(shí)上，從菌體中除去華現(xiàn)象除去水分。事實(shí)上，從菌體中除去大部分水分后，細(xì)胞的生理活動就會停止，大部分水分后，細(xì)胞的生理活動就會停止，因此可以達(dá)到長期維持生命狀態(tài)的目的。因此可以達(dá)到長期維持生命狀態(tài)的目的。該方法適用于絕大多數(shù)微生物菌種（包括該方法適用于絕大多數(shù)微生物菌種（包括噬菌體和立克次氏體等）的保存。噬菌體和立克次氏體等）的保存。 達(dá)到干燥的樣品可在真空或惰性氣體的密閉環(huán)境中置低溫保存，從而使微生物處于干燥、缺氧及低溫的狀態(tài)，生命活動處于休眠，可以達(dá)到長期保藏的目的。 用冰升華的方式除去水分，手段比較溫和，細(xì)胞受損傷的程度相對較小，存活率及保藏效果均不錯，而且經(jīng)抽真空封閉的菌種安瓿瓶的保存、郵寄、使用均很方便。因此冷凍真空干燥保藏是目前使用最普遍、最重要的微生物保藏方法。注意事項注意事項 a、冷凍干燥前的培養(yǎng)條件：首先檢驗(yàn)菌種純度。一、冷凍干燥前的培養(yǎng)條件：首先檢驗(yàn)菌