細(xì)胞培養(yǎng)(操作)

1、常用設(shè)備 準(zhǔn)備室的設(shè)備： 單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲(chǔ)品柜（放置未消毒物品）、儲(chǔ)品規(guī)（放置消毒過(guò)的物品）、包裝臺(tái)。 配液室的設(shè)備：扭力天平與電子天平（稱(chēng)量藥品）、PH計(jì)（測(cè)量培養(yǎng)用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。培養(yǎng)室的設(shè)備： 液氮罐、儲(chǔ)品柜（存放雜物）、日光燈與紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（-80）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺(tái)（書(shū)寫(xiě)實(shí)驗(yàn)記錄）。必須放在無(wú)菌間的設(shè)備：離心機(jī)（收集細(xì)胞）、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、CO2孵箱（孵育培養(yǎng)物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機(jī)、4冰箱（放置serum與培養(yǎng)用液）。無(wú)菌操作 無(wú)菌室的滅菌： 1.定期打掃無(wú)菌室：每周打掃一次

2、，先用自來(lái)水拖地、擦桌子、超凈工作臺(tái)等，然后用3來(lái)蘇爾或者新潔爾滅或者0.5過(guò)氧乙酸擦拭。 2.CO2孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3新潔爾滅擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5過(guò)氧乙酸，再用紫外燈照射3.實(shí)驗(yàn)前滅菌：打開(kāi)紫外燈、三氧殺菌機(jī)、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘4.實(shí)驗(yàn)后滅菌：用75酒精（3新潔爾滅）擦拭超凈臺(tái)、邊臺(tái)、倒置顯微鏡的載物臺(tái)。 實(shí)驗(yàn)人員的無(wú)菌準(zhǔn)備：1.肥皂洗手。2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋3.用75酒精棉球擦凈雙手。無(wú)菌操作的演示：   1.凡是帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精燈火焰

3、操作。3.器皿使用前必須過(guò)火滅菌4.繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時(shí)仍要過(guò)火。5.各種操作要靠近酒精燈，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。6.吸取兩種以上的使用液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。器械的清洗與消毒 玻璃器械洗消： 一、新的玻璃器皿的洗消： 1.自來(lái)水刷洗，除去灰塵。2.烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5稀鹽酸中12小時(shí)以除去臟物、鉛、砷等物。3.刷洗、烘干：12小時(shí)后立即用自來(lái)水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來(lái)水沖干凈后用烤箱烘干。4.泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水1000ml）浸泡12小時(shí)，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來(lái)

4、水沖洗15次，最后蒸餾水沖洗3-5次與用雙蒸水過(guò)3次。5.烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。6.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)蓋好蓋子，打開(kāi)開(kāi)關(guān)與安全閥，當(dāng)蒸氣成直線(xiàn)上升時(shí)，關(guān)閉安全閥，當(dāng)指針指向15磅時(shí)，維持20-30分鐘。7.高壓消毒后烘干二、舊的玻璃器皿的洗消： 1刷洗、烘干：使用過(guò)的玻璃器皿可直接泡入來(lái)蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過(guò)來(lái)蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。2.泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液），12小時(shí)后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來(lái)水沖洗（避免蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗3次。3.烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取

5、出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲(chǔ)存及防止灰塵與再次被污染。4.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)，蓋好蓋子，打開(kāi)開(kāi)關(guān)與安全閥，隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣，當(dāng)蒸氣成直線(xiàn)冒出3-5分鐘后，關(guān)閉安全閥，氣壓表指數(shù)隨之上升，當(dāng)指針指向15磅時(shí)，調(diào)節(jié)電開(kāi)關(guān)維持20-30分鐘即可。（玻璃培養(yǎng)瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上）5.烘干備用：因?yàn)楦邏合竞笃髅髸?huì)被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內(nèi)烘干備用。金屬器械洗消：    金屬器皿不能泡酸，洗消時(shí)可先用洗滌劑刷洗，后用自來(lái)水沖干凈，然后用75酒精擦拭，再用自來(lái)水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi)15磅高壓（

6、30分鐘）消毒，再烘干備用。橡膠與塑料： 橡膠與制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來(lái)水與蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據(jù)不同品質(zhì)進(jìn)行如下的處理程序： 1 . 針式濾器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小時(shí),或者煮沸20分鐘,在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時(shí)注意光面朝上(凹向上)，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內(nèi)15磅30分鐘消毒，再烘干備用。注意在超凈臺(tái)內(nèi)取出使用時(shí)應(yīng)該立即將螺旋旋緊。 2. 膠塞烘干后用2氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過(guò)的膠塞只要用沸水處理30分鐘），自來(lái)水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來(lái)水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁

7、盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。 3. 膠帽，離心管帽烘干后只能在2氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時(shí)（切記時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)），自來(lái)水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來(lái)水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。 4. 膠頭可用75酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。 5.塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，凍存管： 6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用70酒精浸泡消毒。塑料培養(yǎng)皿打開(kāi)蓋子，放在超凈臺(tái)臺(tái)面上，直接暴露在紫外線(xiàn)下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用23周時(shí)間洗除殘留的氧化乙烯。用20000100000rad的r射線(xiàn)消毒塑料制品效果最好。 為

8、了防止清洗器材已消毒與末消毒發(fā)生混淆，可在紙包裝后，用密寫(xiě)墨水作好標(biāo)記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫(xiě)墨水，在包裝紙上作一記號(hào)，平時(shí)這種墨水不帶痕跡，一經(jīng)高溫，即出現(xiàn)字跡，從而可以判定它們是否消毒。密寫(xiě)墨水的配制：氯化鉆(CoC12·6H2o)2g，30鹽酸10m1，蒸餾水88m1。 注意事項(xiàng)： 1.嚴(yán)格執(zhí)行高壓鍋的操作規(guī)程：高壓消毒時(shí)，先檢查鍋內(nèi)是否有蒸餾水，以防高壓時(shí)燒干，水不能過(guò)多因?yàn)槠鋵⑹箍諝饬鲿呈茏?，?huì)降低高壓消毒效果。檢查安全閥是否通暢，以防高壓時(shí)爆炸。 2.安裝濾膜時(shí)注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過(guò)濾的作用。 3.注意人體的防護(hù)與器皿的完全浸泡：

9、A.泡酸時(shí)要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。B.從酸缸內(nèi)撈取器皿時(shí)防止酸液濺到地面，會(huì)腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制與消毒 器材與試劑： 干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計(jì)、磁力攪拌器。具體步驟： 一.  水的制備： 細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子與其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水二.PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)： 1.溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1

10、.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS(磷酸鹽緩沖液)溶液。 2.移入溶液瓶?jī)?nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。 三. 胰蛋白酶溶液的配制與消毒：    胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度與作用時(shí)間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37時(shí)，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶

11、時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度與時(shí)間，以免消化過(guò)度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+、Mg2+與血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。 1.稱(chēng)取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25，用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4內(nèi)過(guò)夜。 2.用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20保存以備使用。 四.青、鏈霉素溶液的配制于消毒

12、1.     所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。 2.具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是80萬(wàn)單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬(wàn)單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬(wàn)單位。 3.使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。1單位1微克？五.RPMI1640的制備與消毒： 1.溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙?并按照包裝說(shuō)明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各

13、0.5ml, 使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml。然后用一個(gè)當(dāng)量的鹽酸與NaOH調(diào)PH到7.2左右。最后定容至1000ml，搖勻。 2.安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器與支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。 3.抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過(guò)濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過(guò)濾。 4.分裝：將過(guò)濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶?jī)?nèi)置于4冰箱內(nèi)待用。 5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4時(shí)兩周有效）。 六血清的滅火： 細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買(mǎi)來(lái)的血清要在56水浴中滅火30分鐘后，再經(jīng)過(guò)抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。 七.HEPE

14、S溶液： HEPES的化學(xué)全稱(chēng)位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N-a-hydroxythylpiperazine-N- ethanesulfanic acid ）。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。 1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下： 準(zhǔn)確稱(chēng)取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過(guò)濾除菌，分裝后4保存。 注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱(chēng)取

15、4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過(guò)濾除菌后可完全（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。 八.谷氨酰胺： 合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸與蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4下放置1周可分解50，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來(lái)的谷氨酰胺。 一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為14mmol/L?？梢耘渲?00mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時(shí)加入培養(yǎng)

16、液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過(guò)濾除菌，分裝小瓶，-20保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 九.肝素溶液的配制： 含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時(shí)，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過(guò)夜，然后過(guò)濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為   。使用時(shí)，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可。 十. 型膠原酶： 0.1型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制與消毒滅菌。

17、注意：因?yàn)樾湍z原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過(guò)濾，因此可以用蔡式濾器過(guò)濾除菌。分裝入10ml小瓶-20保存。 十一.明膠溶液： 因?yàn)槊髂z難于過(guò)濾，所以配制0.1明膠溶液必須用無(wú)菌的PBS配制。所以制備過(guò)程中必須要注意無(wú)菌操作。首要的問(wèn)題是如何無(wú)菌準(zhǔn)確稱(chēng)量0.1克（配成100ml溶液）即解決無(wú)菌分裝藥品的問(wèn)題。其次要注意即使是01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過(guò)夜放置，然后無(wú)菌分裝入50ml小瓶中，4保存。 其他培養(yǎng)用液的配制： 20ug/ml內(nèi)皮生長(zhǎng)因子， 注意事項(xiàng)： 1.配制溶液時(shí)必須用新鮮的蒸餾水。 2.安裝蔡式濾器時(shí)通常使用孔徑0.45微米 與0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.

18、45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。 3.配制RPMI1640培養(yǎng)基時(shí)因?yàn)檫€要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液PH值最終為7.2，可在配制時(shí)調(diào)PH至7.4。 細(xì)胞傳代培養(yǎng)（消化法） 具體操作： 一.  傳代前準(zhǔn)備： 1.預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液與胰蛋白酶的瓶子放入37水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。2.用75酒精擦拭經(jīng)過(guò)紫外線(xiàn)照射的超凈工作臺(tái)與雙手。 3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。 4.點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。    5.準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入

19、微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。 6.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。   7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞。   8.打開(kāi)瓶口：將各瓶口一一打開(kāi)，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。二.胰蛋白酶消化；    1.加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫度是37。   2. 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞

20、之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。    3.吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。 三.吹打分散細(xì)胞： 1.吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。 2.吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。 3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。     4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。四.分裝稀釋細(xì)胞：     1.分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個(gè)

21、培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。    2.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。注意密度過(guò)小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml。最后要做好標(biāo)記。 五.繼續(xù)培養(yǎng)：     用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時(shí)后開(kāi)始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長(zhǎng)細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25時(shí)為一個(gè)，占50為，占75時(shí)為。 傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)：    1.嚴(yán)格的無(wú)菌操作     2.適

22、度消化：消化的時(shí)間受消化液的種類(lèi)、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過(guò)程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。 附：EDTA（0.02乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方： EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5酚紅4ml，加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時(shí)調(diào)節(jié)PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中與，使用后培養(yǎng)瓶要徹底清洗，否則再培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞容易脫壁細(xì)胞的復(fù)蘇 細(xì)胞復(fù)蘇的原則快速融化：必須將凍存在-196液氮中的細(xì)胞快速融

23、化至37，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。具體操作 一.  實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備： 1.將水浴鍋預(yù)熱至37 2.用75酒精擦拭紫外線(xiàn)照射30min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。    3.在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。 二取出凍存管：    1.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)。    2.從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。三迅速解凍：    1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖

24、動(dòng)，使管中的液體迅速融化。   2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。四.平衡離心：    用架盤(pán)天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min 離心3min五.制備細(xì)胞懸液：     1.吸棄上清液。    2.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。六.細(xì)胞計(jì)數(shù)：    細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。七.培養(yǎng)細(xì)胞    將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸

25、液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37與5CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(shí)（或者24-48小時(shí)）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。初學(xué)者易犯錯(cuò)誤： 1水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37。 2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長(zhǎng)。3.離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞與細(xì)胞丟失。4.一次復(fù)蘇細(xì)胞過(guò)多，忘記更換吸頭與吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。細(xì)胞計(jì)數(shù) 實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過(guò)測(cè)定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。具體操作： 一.準(zhǔn)備工作：         取

26、一瓶傳代的細(xì)胞，按照傳代細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層后以被使用。 二.細(xì)胞懸液制備： 細(xì)胞懸液的制備方法是用0.25的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測(cè)細(xì)胞懸液。三.細(xì)胞計(jì)數(shù)： 1.蓋好蓋玻片：取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。    2.制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中，加入5滴臺(tái)盼藍(lán)染液（0.4）或苯胺黑，活細(xì)胞不會(huì)被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞與死細(xì)胞。   3.將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測(cè)細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少

27、量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿(mǎn)懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑小?#160;  4.統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個(gè)大鉻（每個(gè)大格含有16個(gè)中鉻）中沒(méi)有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。   5.計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml          （  四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)         ×2×104 說(shuō)明：公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大