病毒載體概述PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1病毒載體概述病毒載體概述病毒載體概述（病毒載體概述（1）要求：要求：1 1、攜帶外源基因并能包裝成感染性病毒顆粒、攜帶外源基因并能包裝成感染性病毒顆粒 2 2、介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)、介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移和表達(dá) 3 3、對(duì)機(jī)體不致病、對(duì)機(jī)體不致病容量：容量：自身基因組大小的自身基因組大小的105%110105%110% 類(lèi)型：類(lèi)型：1 1、重組型病毒載體、重組型病毒載體 2 2、無(wú)病毒基因的病毒載體、無(wú)病毒基因的病毒載體 復(fù)制缺陷型復(fù)制缺陷型 可復(fù)制型可復(fù)制型 復(fù)制缺陷型復(fù)制缺陷型組成：組成：1 1、病毒復(fù)制和包裝元件、病毒復(fù)制和包裝元件 2 2、病毒基因、病毒基因 3 3、插入的外源基因

2、或元件、插入的外源基因或元件 4 4、病毒外殼、病毒外殼/ /外膜外膜 用途：基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)用途：基因轉(zhuǎn)移和表達(dá) 1、基因治療、基因治療 2、疫苗、疫苗 3、器官移植、器官移植 4、組織工程、組織工程 5、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 6、基因功能研究、基因功能研究 第1頁(yè)/共15頁(yè)病毒載體概述（病毒載體概述（2）優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1 1、利用病毒天然的感染性進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高；、利用病毒天然的感染性進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高； 2 2、復(fù)雜的裝配過(guò)程由細(xì)胞完成；、復(fù)雜的裝配過(guò)程由細(xì)胞完成； 3 3、不同的病毒載體具有不同的表達(dá)特點(diǎn)、不同的病毒載體具有不同的表達(dá)特點(diǎn)。存在的問(wèn)題：存在的問(wèn)題：1 1、安全性、安

3、全性2 2、靶向性、靶向性3 3、有效性、有效性細(xì)胞毒性細(xì)胞毒性染色體毒性染色體毒性免疫毒性免疫毒性轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性轉(zhuǎn)錄靶向性轉(zhuǎn)錄靶向性轉(zhuǎn)導(dǎo)效率轉(zhuǎn)導(dǎo)效率靶向性靶向性基因表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間基因表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間表達(dá)的可調(diào)控性表達(dá)的可調(diào)控性第2頁(yè)/共15頁(yè)病毒載體病毒載體生物學(xué)特性生物學(xué)特性適用范圍適用范圍反轉(zhuǎn)錄病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒載體 單鏈單鏈 RNA 病毒病毒 810kb可感染分裂細(xì)胞；可感染分裂細(xì)胞；整合到染色體中；整合到染色體中；表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)；表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)；有致癌的危險(xiǎn)；有致癌的危險(xiǎn)；Ex vivo 基因治療；基因治療；腫瘤基因治療。腫瘤基因治療。腺病毒載體腺病毒載體 雙鏈雙鏈 DNA

4、病毒病毒 36kb可感染分裂和非分裂細(xì)胞；可感染分裂和非分裂細(xì)胞；不整合到染色體中；不整合到染色體中；外源基因表達(dá)水平高；外源基因表達(dá)水平高；表達(dá)時(shí)間較短；表達(dá)時(shí)間較短；免疫原性強(qiáng)；免疫原性強(qiáng)；In vivo 基因治療；基因治療；腫瘤基因治療；腫瘤基因治療；疫苗。疫苗。AAV 病毒載體病毒載體 單鏈單鏈 DNA 病毒病毒 5kb可感染分裂和非分裂細(xì)胞；可感染分裂和非分裂細(xì)胞；整合到染色體中；整合到染色體中；無(wú)致病性；免疫原性弱；無(wú)致病性；免疫原性弱；可長(zhǎng)期表達(dá)外源基因；可長(zhǎng)期表達(dá)外源基因；在骨骼肌、心肌、肝臟、視在骨骼肌、心肌、肝臟、視網(wǎng)膜等組織中表達(dá)較高；網(wǎng)膜等組織中表達(dá)較高；In vivo

5、 基 因 治基 因 治療；療；Ex vivo 基因治療；基因治療；遺傳病基因治療；遺傳病基因治療；獲得性慢性疾病的獲得性慢性疾病的基因治療。基因治療。HSV 病毒載體病毒載體 雙鏈雙鏈 DNA 病毒病毒 152kb具有嗜神經(jīng)性；可逆軸突傳具有嗜神經(jīng)性；可逆軸突傳遞；遞；可潛伏感染；可潛伏感染；容量大；容量大；可感染分裂和非分裂細(xì)胞；可感染分裂和非分裂細(xì)胞；神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療；因治療；腫瘤的基因治療。腫瘤的基因治療。常用的病毒載體的特點(diǎn)：常用的病毒載體的特點(diǎn)：第3頁(yè)/共15頁(yè)病毒載體研究方向病毒載體研究方向1、病毒包裝系統(tǒng)、病毒包裝系統(tǒng) 2、無(wú)病毒基因的病毒載體、無(wú)病毒基因的

6、病毒載體6、自我擴(kuò)增型病毒載體、自我擴(kuò)增型病毒載體7、條件增殖型病毒載體、條件增殖型病毒載體5、嵌合型病毒載體、嵌合型病毒載體3、靶向性病毒載體、靶向性病毒載體4、可調(diào)控表達(dá)的病毒載體、可調(diào)控表達(dá)的病毒載體8、新病毒載體、新病毒載體第4頁(yè)/共15頁(yè)病毒載體包裝系統(tǒng)病毒載體包裝系統(tǒng)組成：組成：1、宿主細(xì)胞、宿主細(xì)胞 2、輔助元件（輔助質(zhì)粒、輔助病毒）、輔助元件（輔助質(zhì)粒、輔助病毒） 3、被包裝的、被包裝的DNA/RNA 包含順式作用元件包含順式作用元件 單因素生產(chǎn)系統(tǒng)（單因素生產(chǎn)系統(tǒng)（one-component system)雙因素生產(chǎn)系統(tǒng)雙因素生產(chǎn)系統(tǒng) (two-component syste

7、m) gag pol envLTRLTR 圖圖1 反轉(zhuǎn)錄病毒包裝系統(tǒng)示意圖反轉(zhuǎn)錄病毒包裝系統(tǒng)示意圖圖圖2 腺病毒包裝系統(tǒng)示意圖腺病毒包裝系統(tǒng)示意圖 293 cellE1a,bJM17Ad Shuttle 293 cellE1a,b第5頁(yè)/共15頁(yè)多因素生產(chǎn)系統(tǒng)多因素生產(chǎn)系統(tǒng) (multi-component system)多因素系統(tǒng)多因素系統(tǒng) 雙因素系統(tǒng)雙因素系統(tǒng)圖圖3 腺病毒伴隨病毒包裝系統(tǒng)示意圖腺病毒伴隨病毒包裝系統(tǒng)示意圖host cellHelper virusHelper plasmidrep cap Vector plasmidHost cell +vector DNAHelper

8、virus +helper plasmid圖圖4 雙因素系統(tǒng)生產(chǎn)重組雙因素系統(tǒng)生產(chǎn)重組AAV病毒示意圖病毒示意圖proviral cellRecombinant helper virus(rHSV-repcap)rep cap 第6頁(yè)/共15頁(yè)無(wú)病毒基因的病毒載體無(wú)病毒基因的病毒載體被包裝的被包裝的DNA/RNA中不含任何病毒編碼基因，只保留其復(fù)制和中不含任何病毒編碼基因，只保留其復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件。獲得的重組病毒顆粒具有野生型病包裝所必需的順式作用元件。獲得的重組病毒顆粒具有野生型病毒的外殼毒的外殼/外膜和感染性，但不表達(dá)病毒蛋白。外膜和感染性，但不表達(dá)病毒蛋白。腺伴隨病毒載體：

9、腺伴隨病毒載體：反轉(zhuǎn)錄病毒載體：反轉(zhuǎn)錄病毒載體：腺病毒載體：腺病毒載體：?jiǎn)渭儼捳畈《据d體：?jiǎn)渭儼捳畈《据d體：LTRLTR genegeneITRITRpAgeneITRITRpAgenepacorigenegenegenegene第7頁(yè)/共15頁(yè)無(wú)輔助病毒包裝系統(tǒng)無(wú)輔助病毒包裝系統(tǒng)圖圖5 重組重組AAV無(wú)輔毒包裝系統(tǒng)無(wú)輔毒包裝系統(tǒng)adenovirusgeneITRITRaav vector plasmidE2a E4orf6 VA Helper plasmid:293細(xì)胞細(xì)胞E1a,bcre293-cregeneITRITRAdenovirus with packaging signal fl

10、anked by loxP 圖圖6 mini-adnovirus無(wú)輔毒包裝系統(tǒng)無(wú)輔毒包裝系統(tǒng)第8頁(yè)/共15頁(yè)靶向性病毒載體靶向性病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性轉(zhuǎn)錄靶向性（特異性）轉(zhuǎn)錄靶向性（特異性）改造病毒外殼改造病毒外殼/外膜外膜連接靶向性結(jié)合分子連接靶向性結(jié)合分子Modified adenoviruscell組織特異性啟動(dòng)子組織特異性啟動(dòng)子腫瘤選擇性啟動(dòng)子腫瘤選擇性啟動(dòng)子細(xì)胞周期調(diào)控啟動(dòng)子細(xì)胞周期調(diào)控啟動(dòng)子腫瘤血管內(nèi)皮導(dǎo)向啟動(dòng)子腫瘤血管內(nèi)皮導(dǎo)向啟動(dòng)子雙特異性啟動(dòng)子雙特異性啟動(dòng)子病毒增殖的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控病毒增殖的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控第9頁(yè)/共15頁(yè)可調(diào)控表達(dá)的病毒載體可調(diào)控表達(dá)的病毒載體細(xì)胞的調(diào)控元

11、件細(xì)胞的調(diào)控元件病毒的調(diào)控元件病毒的調(diào)控元件人工合成的調(diào)控元件人工合成的調(diào)控元件細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄細(xì)胞啟動(dòng)子細(xì)胞啟動(dòng)子 病毒啟動(dòng)病毒啟動(dòng)子子albumin MVM P4Tyrosinase or TRP-1 B19 promoterPSA HBVMBP JCV MCK EBVGFAP NSE KDR/flt-1AFPCEAerbB2HREMDR1P1tTAtetOpgeneP1tTAtetOpgenetTAtetOpgenetetOp四環(huán)素調(diào)控四環(huán)素調(diào)控合成的轉(zhuǎn)錄因子合成的轉(zhuǎn)錄因子GAL4PRVP16RXREcRVP16FKB12ZFHD-1FRAPP65rapamycinRU486

12、GAL4ERVP16ESTRADIOLGAL4ERp65Diphenol indenemuristerone第10頁(yè)/共15頁(yè) 自我擴(kuò)增型載體自我擴(kuò)增型載體（self-amplifying vector） ：） ：這類(lèi)載體是以正鏈 RNA 病毒 Sindbis 病毒和 Semliki Forest 病毒為基礎(chǔ)的。用目的基因代替病毒的外殼蛋白編碼序列，導(dǎo)入靶細(xì)胞中，病毒的復(fù)制蛋白大量復(fù)制重組的基因組，mRNA 水平的大量增加導(dǎo)致高水平的轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)。自我擴(kuò)增型載體的表現(xiàn)形式可以是RNA，DNA 和重組病毒。 條件增殖型病毒載體條件增殖型病毒載體（conditionally replicating

13、 vector） ：） ： 指可在某種特性的組織中產(chǎn)毒性復(fù)制，而在其它組織中不增殖的病毒載體。這類(lèi)病毒載體主要用于特異性裂解腫瘤細(xì)胞。如天然的腺病毒突變株 Onyx-015 是 55Kdal E1B 基因功能缺失的腺病毒突變株，可以選擇性地在 p53 基因突變的腫瘤細(xì)胞中增殖，而在正常組織細(xì)胞中不增殖。用這種突變株聯(lián)合化療治療惡性腫瘤 II 期臨床結(jié)果令人鼓舞（Kirn D et al. 1998） ，已進(jìn)入 III 期臨床試驗(yàn)，從此，許多人工改造的腺病毒突變體被用于腫瘤治療研究中。 嵌合型病毒載體嵌合型病毒載體（hybrid viral vector） ：） ： 指將不同病毒的基因元件進(jìn)行組

14、合，形成的重組雜合病毒。如腺病毒與 AAV 病毒的雜合體病毒，既具有腺病毒的感染性和基因組特性（雙鏈線(xiàn)狀 DNA） ，又具有 AAV 病毒的染色體整合性（Lieber A et al.1999） 。各種病毒基因元件組合形成新的雜合載體的報(bào)道層出不窮，如單純皰疹病毒擴(kuò)增子與 AAV 病毒雜合載體（Johnston KM et al. 1997） 、腺病毒與 EB 病毒復(fù)制子雜合載體（Tan BT et al. 1999）腺病毒與反轉(zhuǎn)錄病毒雜合載體（Caplen NJ et al. 1999）等，不一而足。這些雜合載體使重組病毒的特性多樣化，以適應(yīng)不同基因轉(zhuǎn)移目的的需要。第11頁(yè)/共15頁(yè)重組病毒

15、的生產(chǎn)和純化重組病毒的生產(chǎn)和純化小量制備和純化小量制備和純化大量制備和純化大量制備和純化場(chǎng)所場(chǎng)所細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解病毒分離病毒分離病毒純化病毒純化制劑制劑保存保存培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶 轉(zhuǎn)瓶、細(xì)胞工廠(chǎng)、發(fā)酵罐轉(zhuǎn)瓶、細(xì)胞工廠(chǎng)、發(fā)酵罐反復(fù)凍融反復(fù)凍融 機(jī)械法或化學(xué)法裂解機(jī)械法或化學(xué)法裂解 實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室 中試車(chē)間中試車(chē)間 離心離心 離心、超濾、萃取離心、超濾、萃取密度梯度超速離心密度梯度超速離心 濃縮、柱層析濃縮、柱層析配方配方緩沖液緩沖液低溫低溫第12頁(yè)/共15頁(yè)病毒載體與基因治療產(chǎn)業(yè)化病毒載體與基因治療產(chǎn)業(yè)化基因治療產(chǎn)品的知識(shí)產(chǎn)權(quán)構(gòu)成基因治療產(chǎn)品的知識(shí)產(chǎn)權(quán)構(gòu)成 1、治療基因2、調(diào)控元件3、改

16、造的外殼/外膜4、靶向分子5、包裝系統(tǒng)6、生產(chǎn)和純化技術(shù)7、制劑和保存技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的組織和實(shí)施：產(chǎn)業(yè)化的組織和實(shí)施： 1、合作開(kāi)發(fā)2、專(zhuān)業(yè)分工3、政府支持和企業(yè)投資4、利益分配基因治療的三個(gè)核心部分基因治療的三個(gè)核心部分 1、基因載體系統(tǒng)2、基因表達(dá)系統(tǒng)3、治療基因第13頁(yè)/共15頁(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)和基礎(chǔ)研究知識(shí)產(chǎn)權(quán)和基礎(chǔ)研究專(zhuān)利對(duì)學(xué)術(shù)研究的影響專(zhuān)利對(duì)學(xué)術(shù)研究的影響1、無(wú)影響（對(duì)非常早期研究）、無(wú)影響（對(duì)非常早期研究）2、有影響（對(duì)臨床試驗(yàn)和可能的商業(yè)開(kāi)發(fā)）、有影響（對(duì)臨床試驗(yàn)和可能的商業(yè)開(kāi)發(fā)）基因治療領(lǐng)域的知識(shí)產(chǎn)權(quán)主要通過(guò)專(zhuān)利系統(tǒng)來(lái)保護(hù)基因治療領(lǐng)域的知識(shí)產(chǎn)權(quán)主要通過(guò)專(zhuān)利系統(tǒng)來(lái)保護(hù)對(duì)于基因治療公司最重要的專(zhuān)利是對(duì)于基因治療公司最重要的專(zhuān)利是：1、載體系統(tǒng)；、載體系統(tǒng)； 2、生產(chǎn)過(guò)程；、生產(chǎn)過(guò)程；3、整體治療方案、整體治療方案 治療基因和表達(dá)系統(tǒng)可以從其它方購(gòu)買(mǎi)使用權(quán)。治療基因和表達(dá)系統(tǒng)可以從其它方購(gòu)買(mǎi)使用權(quán)。 政府支持對(duì)基因治療產(chǎn)業(yè)化的重要作用政府支