自動(dòng)生化分析儀的分析參數(shù)設(shè)置

1、自動(dòng)生化分析儀的分析參數(shù)設(shè)置 核心提示：自動(dòng)生化分析儀是一種把生化分析中的取樣、加試劑、去干擾物、混合、恒溫反應(yīng)、自動(dòng)監(jiān)測(cè)、數(shù)據(jù)處理以及實(shí)驗(yàn)后清洗等步驟進(jìn)行自動(dòng)化操作的儀器， 它完全模仿并代替 了手工操作，目前已經(jīng)成為醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床診斷所必可不少的儀器之一。 它的應(yīng)用大大提 高了生化自動(dòng)生化分析儀是一種把生化分析中的取樣、加試劑、去干擾物、混合、恒溫反應(yīng)、自動(dòng) 監(jiān)測(cè)、數(shù)據(jù)處理以及實(shí)驗(yàn)后清洗等步驟進(jìn)行自動(dòng)化操作的儀器，它完全模仿并代替了手工操作，目前已經(jīng)成為醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床診斷所必可不少的儀器之一。它的應(yīng)用大大提高了生化檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性、精密度和工作效率，適應(yīng)了臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展對(duì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的要求，然而這

2、一切不僅需要生化分析儀的技術(shù)基礎(chǔ)，也需要儀器內(nèi)每個(gè)項(xiàng)目都有一組最優(yōu)化的分析參數(shù)。并且目前大多數(shù)生化分析儀為開放式，封閉式的儀器一般也會(huì)另外留一些檢測(cè)項(xiàng)目的空白通道由用戶自己設(shè)定分析參數(shù)，因此我們有必要了解生化分析儀各個(gè)分析參數(shù)的基本含義以及設(shè)置方 法。1. 試驗(yàn)名稱 常以項(xiàng)目的英文縮寫來設(shè)置，如總蛋白設(shè)置為TP,白蛋白設(shè)置為 ALB 等。2. 方法類型 生化分析儀常用的方法有終點(diǎn)法、連續(xù)監(jiān)測(cè)法、比濁法等，根據(jù)被檢物 質(zhì)的檢測(cè)原理等選擇其中一種分析方法。2.1終點(diǎn)法 又稱為平衡法，是基于反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜特征及其對(duì)光 吸收強(qiáng)度的大小對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析的一類方法，有一點(diǎn)終點(diǎn)法和兩點(diǎn)終

3、點(diǎn)法兩類。一點(diǎn)終點(diǎn)法的特點(diǎn)是使用一種或兩種試劑，當(dāng)待測(cè)物與試劑反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)時(shí)，測(cè)定混合溶液的吸光度來計(jì)算待測(cè)物的濃度，該法常用的有總蛋白雙縮脈法、白蛋白漠甲酚綠法、 葡萄糖氧化酶法等，手工操作的大多數(shù)方法都是一點(diǎn)終點(diǎn)法。兩點(diǎn)終點(diǎn)法也稱固定時(shí)間法，如果是單試劑分析，當(dāng)測(cè)定波長(zhǎng)同干擾物質(zhì)的吸收光譜有重疊時(shí)，通過選用兩點(diǎn)終點(diǎn)法可消除樣品空白引起的干擾，其分析過程是在樣品與試劑混合后經(jīng)過一段延滯期讀取一個(gè)點(diǎn)A1 , 一定時(shí)間后再讀取A2,然后比較標(biāo)準(zhǔn)和測(cè)定的 A （ A=A2-A1 ）值，求得待測(cè)物的濃度。肌酊苦味 酸法就是一個(gè)典型的單試劑兩點(diǎn)法的例子。如果是雙試劑分析，選用二點(diǎn)終點(diǎn)分析法除了可消除樣

4、品空白引起的干擾外，還可消除內(nèi)源性干擾物質(zhì)的干擾，其分析過程是加入試劑1后讀取A1,加入試劑2后讀取A2 , A1相當(dāng)于讀出樣品空白值， A2才是實(shí)際呈色反應(yīng)，然 后比較標(biāo)準(zhǔn)和測(cè)定的 A （ A=A2-A1 ）值，求得待測(cè)物的濃度。為了提高終點(diǎn)法檢測(cè)的準(zhǔn) 確性，選擇該法時(shí)應(yīng)設(shè)置終點(diǎn)法零點(diǎn)讀數(shù)、樣品空白等兩個(gè)分析參數(shù)，前者是在反應(yīng)前即開始讀數(shù)，可以扣除反應(yīng)前試劑和樣品混合液的空白讀數(shù)；后者是樣品加空白試劑所得到的吸光度，反應(yīng)需要占用一個(gè)比色杯。2.2連續(xù)監(jiān)測(cè)法又稱動(dòng)態(tài)分析法、速率法等，基本原理是在酶促反應(yīng)的最適條件下，用物理、化學(xué)或酶促反應(yīng)的分析方法，在反應(yīng)速度恒定期（零級(jí)反應(yīng)期）內(nèi)連續(xù)觀察和記

5、錄一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)底物或產(chǎn)物量的變化，以單位時(shí)間酶反應(yīng)初速度計(jì)算出酶活力的大小和代謝物的濃度。具體方法有兩點(diǎn)速率法和多點(diǎn)速率法：兩點(diǎn)速率法是通過觀察在零級(jí)反應(yīng)期內(nèi)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度，用兩個(gè)點(diǎn)的吸光度的差值（A ）除以時(shí)間（分），計(jì)算出每分鐘的吸光度變化值；多點(diǎn)速率法是在零級(jí)反應(yīng)期內(nèi)每隔一定時(shí)間（2-30S）進(jìn)行一次監(jiān)測(cè)，連續(xù)監(jiān)測(cè)多次，求出單位時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)速度，這種方法又可分為最小二乘法、多點(diǎn) a法、回歸法、帶 速率時(shí)間法等。該法具有明顯的優(yōu)點(diǎn)就是大大提高了分析速度和準(zhǔn)確性，主要適用于酶活性及其代謝產(chǎn)物的測(cè)定。 在連續(xù)監(jiān)測(cè)法過程中，即使不加樣品，試劑中的底物也會(huì)自動(dòng)降解得到一個(gè)結(jié)果，因此應(yīng)設(shè)置試劑

6、空白速率，不同批號(hào)試劑的試劑空白速率不一樣，其值為以水 代樣品測(cè)得的項(xiàng)目結(jié)果，樣品測(cè)定結(jié)果應(yīng)扣除試劑空白速率的數(shù)值。2.3比濁法 自動(dòng)生化分析儀一般只能做透射免疫比濁分析，當(dāng)光線通過一定體積的含免疫復(fù)合物的溶液時(shí)，由于溶液中存在的抗原-抗體復(fù)合物粒子對(duì)光線的反射和吸收，引起透射光的減少，測(cè)定的光通量和抗原抗體復(fù)合物的量成反比。它常用于終點(diǎn)法測(cè)定，目前主要用于血清特種蛋白的檢測(cè)，如載脂蛋白、微量蛋白、急性時(shí)相反應(yīng)蛋白、免疫球蛋白以及某些藥物監(jiān)測(cè)等。但是如果樣品中待測(cè)抗原濃度過高，抗原與抗體形成的免疫復(fù)合物分子將會(huì)變小，而且易發(fā)生解離，使?jié)岫确炊陆?，因此免疫比濁分析過程中必須設(shè)置前區(qū)檢查， 比較

7、分析過程中后兩個(gè)讀數(shù)點(diǎn)的差別，如果后一點(diǎn)比前一點(diǎn)的吸光度低， 則表示抗原已過剩，應(yīng)將樣品稀釋后重測(cè)。3. 反應(yīng)溫度自動(dòng)生化分析儀通過溫度控制系統(tǒng)保持溫度恒定，以保證反應(yīng)的正常進(jìn) 行，其保持恒溫的方式有三種：干式恒溫器加熱、水浴式循環(huán)加熱、恒溫器循環(huán)間接加熱。恒溫控制器可以對(duì) 25C、30C、37C三種溫度進(jìn)行恒溫，根據(jù)需要可以任意選擇，半自動(dòng) 生化分析儀恒溫器屬于這種。全自動(dòng)生化分析儀的溫度控制器一般只能控制37 C一種溫度，少數(shù)也可以控制 30C和37 C兩種溫度。4. 反應(yīng)波長(zhǎng) 當(dāng)測(cè)定體系中只有一種組分或混合溶液中待測(cè)組分的吸收峰與其他共存物質(zhì)的吸收波長(zhǎng)無重疊時(shí)，可選用單波長(zhǎng)，如果待測(cè)物質(zhì)

8、有幾個(gè)吸收峰，可選用吸光度最大的一個(gè)波長(zhǎng)，或者選擇在吸收峰處吸光度隨波長(zhǎng)變化較小的某個(gè)波長(zhǎng)。當(dāng)被檢溶液混濁或存在較多的干擾物質(zhì)時(shí)，測(cè)定過程中會(huì)出現(xiàn)光散射和非特異性光吸收，從而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，此時(shí)可用雙波長(zhǎng)甚至多波長(zhǎng)測(cè)定，以提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，而在實(shí)際應(yīng)用中選擇輔助波長(zhǎng)主要用于消除脂血、溶血、黃疸的干擾。由于脂質(zhì)、血紅蛋白、膽紅素在較寬的波長(zhǎng)范圍內(nèi)有較強(qiáng)的光吸收， 常常同測(cè)定波長(zhǎng)有重疊，此時(shí)測(cè)得的吸光度包含待測(cè)物質(zhì)的吸光度和干擾物質(zhì)的吸光度， 因此必須選用合適的輔助波長(zhǎng)來消除干擾物質(zhì)的吸光度。輔助波長(zhǎng)的設(shè)置原則是根據(jù)測(cè)定波長(zhǎng)選擇輔助波長(zhǎng)，要求干擾物質(zhì)在測(cè)定波長(zhǎng)同輔助波長(zhǎng)有相同的吸光度。5

9、. 反應(yīng)方向 有正向反應(yīng)和負(fù)向反應(yīng)兩種，反應(yīng)過程中吸光度增加為正向反應(yīng)，吸光 度下降為負(fù)向反應(yīng)。6. 樣品量與試劑量 樣品與試劑量的確定一般按照試劑說明書上的比例，并結(jié)合儀器的特性進(jìn)行設(shè)置，亦可根據(jù)手工法按比例縮減或重新設(shè)計(jì)，但要考慮到檢測(cè)靈敏度、線性范圍，盡可能將樣品稀釋倍數(shù)大些，以降低樣品中其他成分的影響。在樣品與試劑量的設(shè)置過程中主要應(yīng)注意以下幾個(gè)方面：稀釋水量，添加樣品稀釋水的是為了洗出粘附在采樣針內(nèi) 壁上的微量血清，減少加樣誤差，添加試劑稀釋水是為了避免試劑間的交叉污染，兩種稀釋水的量應(yīng)在復(fù)溶試劑時(shí)按比例扣除。如果采用液體試劑盒時(shí)因不再用水，無法扣除稀釋水量，所以兩種稀釋水應(yīng)盡量減少

10、，以免試劑被過量稀釋。最小樣品量，即分析儀進(jìn)樣針能在規(guī)定的誤差范圍內(nèi)吸取的最小樣品量，隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，儀器的最小樣品量逐漸減小，目前有少至1.6 l的。在樣品含高濃度代謝產(chǎn)物或高活性酶濃度的情況下往往需采用分析儀的 最小樣品量作為減量參數(shù)，從而使儀器的檢測(cè)范圍上限得以擴(kuò)大。總反應(yīng)容量，在不同的分析儀有一個(gè)不同的規(guī)定范圍，在設(shè)置的時(shí)候樣品量和試劑量之和不能超過這一范圍。該值受儀器的光路系統(tǒng)所影響，直射式光路由于光束較寬， 難于減少所測(cè)試反應(yīng)液體積，集束式光路則是通過一個(gè)透鏡使光束變窄，可檢測(cè)低至180 l的反應(yīng)液混合體，近年來又出現(xiàn)了點(diǎn)光源技術(shù)，它的光束更小，照射到樣品杯時(shí)僅為一個(gè)點(diǎn)，可使反

11、應(yīng)液的量降至120 1。試劑量/樣品量比值，不要為節(jié)省試劑而過分地減少試劑用量，因?yàn)樵诮K點(diǎn)比色法中，縮小 試劑量/樣品量比值會(huì)降低線性范圍，遇高濃度樣本會(huì)因試劑量不足而使結(jié)果偏低。7. 分析時(shí)間 分析時(shí)間包括孵育時(shí)間、延遲時(shí)間、監(jiān)測(cè)時(shí)間等，選擇不同的分析方法 應(yīng)選擇相應(yīng)的分析時(shí)間。7.1孵育時(shí)間選擇終點(diǎn)法時(shí)設(shè)置，在一點(diǎn)終點(diǎn)法是樣品與試劑混勻開始至反應(yīng)終點(diǎn) 為止的時(shí)間，在兩點(diǎn)終點(diǎn)法是第一個(gè)吸光度選擇點(diǎn)開始至第二個(gè)吸光度選擇點(diǎn)為止的時(shí)間。 在設(shè)置孵育時(shí)間時(shí)， 有些分析方法要特別注意，如選擇漠甲酚綠法測(cè)定血清白蛋白時(shí)，由于血清中a 1-球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等也可與漠甲酚綠呈色，盡管其反應(yīng)速率較白蛋白為慢

12、，但是 實(shí)際上當(dāng)血清與白蛋白混合時(shí)，“慢反應(yīng)”已經(jīng)發(fā)生，因此為減少非特異性結(jié)合反應(yīng)，應(yīng)在漠甲酚綠與血清混合后 30s讀取吸光度。當(dāng)選擇酶法的Trinder反應(yīng)測(cè)定葡萄糖、總膽固醇、 甘油三酯時(shí)，由于37 C酶反應(yīng)較慢，因此必須測(cè)定這些酶試劑反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)的時(shí)間，自動(dòng)分析儀用試劑盒一般可以在全部加樣后5分鐘內(nèi)反應(yīng)完全，所以應(yīng)選擇分析儀的最大反應(yīng)時(shí)間。7.2延遲時(shí)間選擇連續(xù)監(jiān)測(cè)法或兩點(diǎn)終點(diǎn)法時(shí)設(shè)置，即在樣品與反應(yīng)試劑（第二試 劑）混勻開始至第一個(gè)吸光度選擇點(diǎn)之間的時(shí)間。在連續(xù)監(jiān)測(cè)法過程中，當(dāng)酶與底物混合后需要一定的時(shí)間讓酶激活，直至線性反應(yīng)期才能開始監(jiān)測(cè)，有的項(xiàng)目需要用工具酶將內(nèi)源性代謝產(chǎn)物耗盡，消

13、除干擾。一般單試劑法只需要30s,常用項(xiàng)目中谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶需要特別注意，但是對(duì)于雙底物反應(yīng)或需要輔酶參與者，通常為1-3min。7.3監(jiān)測(cè)時(shí)間 酶促反應(yīng)延滯期后， 在過量底物的存在下，反應(yīng)速率加快并達(dá)到穩(wěn)定的階段，即酶促反應(yīng)以恒定的速率進(jìn)行，不受底物濃度的影響，這段時(shí)間稱為線性反應(yīng)期或零級(jí)反應(yīng)期，自動(dòng)生化分析儀的監(jiān)測(cè)時(shí)間即為此期。連續(xù)監(jiān)測(cè)法在零級(jí)反應(yīng)期至少應(yīng)監(jiān)測(cè) 90-120S或至少4點(diǎn)（3個(gè) A）,少于3個(gè) A不能稱為連續(xù)監(jiān)測(cè)法，因?yàn)椴荒苡?jì)算線性度；監(jiān)測(cè)時(shí)間過長(zhǎng)則容易發(fā)生底物耗盡，可測(cè)范圍變窄。8. 計(jì)算因子（F值）和實(shí)測(cè) F值用連續(xù)監(jiān)測(cè)法進(jìn)行酶活性測(cè)定時(shí)，不需作標(biāo)準(zhǔn)管

14、或 標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)摩爾吸光系數(shù)很容易進(jìn)行酶活性濃度的計(jì)算。先測(cè)定在線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的變化（ A/min ），以U/L代表酶活性濃度時(shí)，則可按下式進(jìn)行計(jì)算：U/L, tC = A/min x F= A/min x V x 106/（ £ x V x L）式中V :反應(yīng)體系總體積（ml）; 106:將mol換算成mol ;& :摩爾吸光系數(shù)（cm2/mol）;v：樣品體積（ml）; L ：比色杯光徑（cm）。當(dāng)條件固定時(shí)，從理論上講V、v和L均為固定值，£值為常數(shù)，所以F值是恒定的。F值對(duì)酶的測(cè)定十分重要，過高雖然測(cè)定的 線性較寬，但重復(fù)性差，反之精密度雖好，但檢

15、測(cè)線性窄，因此應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行合理的 設(shè)置和應(yīng)用。但是在臨床實(shí)際工作中，儀器諸多因素如波長(zhǎng)的準(zhǔn)確性、半波寬的大小、比色杯光徑及磨損與清潔度、溫控的準(zhǔn)確性、加樣系統(tǒng)狀況等若不符合要求或發(fā)生變化都會(huì)影響 指示物的£值或上述公式中的相關(guān)項(xiàng)，因此應(yīng)在具體儀器條件下，定期檢查和實(shí)際測(cè)定指示物的實(shí)測(cè)£值和F值。因?yàn)榧僋AD （P） H溶液不穩(wěn)定，所以 NAD （P） H的£值需用葡萄 糖己糖激酶法實(shí)測(cè)，實(shí)際操作為將某一濃度的葡萄糖溶液重復(fù)5-10次測(cè)定，得到相應(yīng)的一組吸光度A值，求出A - ± s,注意s必須低于規(guī)定的批內(nèi)允許值，再根據(jù)下面兩個(gè)公式分 別計(jì)算出NA

16、D （P） H的實(shí)測(cè)£值和F值：式中C為標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mol/L ）。其他一些色素源指示物在不同的介質(zhì)環(huán)境中，其 £ 值會(huì)發(fā)生程度不等的變化，對(duì)5-硫代-2-硝基苯甲酸、對(duì)硝基苯酚、對(duì)硝基苯胺等這些可得到高純而穩(wěn)定的指示物， 可將其配制在一定的介質(zhì)中，按臨床標(biāo)本用的現(xiàn)場(chǎng)試劑和儀器測(cè)定吸光度求實(shí)測(cè)£值及F值。9. 線性度 是非線性比率的界線，常用 表示，其計(jì)算公式為，式中：k1為連續(xù)監(jiān)測(cè)時(shí)間2/3內(nèi)前讀數(shù)時(shí)間的斜率，k2為后2/3讀數(shù)時(shí)間的斜率，k3為總的斜率，一般設(shè)置 為15%。對(duì)一些酶活性項(xiàng)目，可以適當(dāng)放寬，當(dāng)不需要設(shè)置檢查界限時(shí)，設(shè)置其為0。線性百分?jǐn)?shù)大，說明

17、k之間已不成線性；超過極限值說明底物不足，檢測(cè)結(jié)果會(huì)變低，應(yīng)稀釋 后重測(cè)。10. 底物耗盡限額選擇連續(xù)監(jiān)測(cè)法或兩點(diǎn)終點(diǎn)法時(shí)設(shè)置，不同型號(hào)分析儀的設(shè)計(jì)不一樣，有的為零點(diǎn)與監(jiān)測(cè)第一點(diǎn)吸光度的差額，有的為吸光度上升或下降至指定吸光度(MAX-OD/MIN-OD )的數(shù)值。超過限額說明樣品的酶活性非常高，底物消耗太快，在儀 器程序規(guī)定的線性反應(yīng)期內(nèi)吸光度的變化往往不代表真正的酶活力，導(dǎo)致結(jié)果偏低，該樣品應(yīng)稀釋一定的倍數(shù)重新測(cè)定。此參數(shù)對(duì)于采用負(fù)反應(yīng)分析酶活性的方法甚為重要，下面以丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶為例簡(jiǎn)述設(shè)置MIN-OD的步驟，選擇一份高活性酶的混合血清，用生理鹽水稀釋，得到一組從低濃度至高濃度的丙氨酸

18、氨基轉(zhuǎn)移酶溶液；把這一組溶液按儀器設(shè)定的程序進(jìn)行測(cè)定，并打印出反應(yīng)曲線；從曲線中可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶活力達(dá)到一定臨界濃度時(shí)，該臨界濃度的反應(yīng)曲線在連續(xù)監(jiān)測(cè)時(shí)間內(nèi)成線性，但是在監(jiān)測(cè)時(shí)間后成非線性，即連續(xù)監(jiān)測(cè)時(shí)間的最后一個(gè)讀數(shù)點(diǎn)正好是線性與非線性的臨界點(diǎn)，所以該點(diǎn)的吸光度是在連續(xù)監(jiān)測(cè)時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)沒有發(fā)生底物耗盡時(shí)所能達(dá)到的最小吸光度值，這個(gè)最小吸光度值也就是MIN-OD。當(dāng)酶活力高于上述臨界濃度時(shí)，反應(yīng)曲線在連續(xù)監(jiān)測(cè)期內(nèi)已不呈線性反應(yīng)，有些儀器自動(dòng)選擇彈性速率功能，能自動(dòng)選擇反應(yīng)曲線上連續(xù)監(jiān)測(cè)期內(nèi)仍呈線性的吸光度數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果，使酶活性測(cè)定的線性范圍得以擴(kuò)大，可以減少稀釋及重測(cè)次數(shù)、降低成本。11. 試劑吸光度上限、下限試劑吸光度上限為正向反應(yīng)用，可參考試劑盒說明書數(shù)值折算成所用比色杯的光徑。如試劑盒要求上限為0.4,比色杯光徑 0.6cm,則試劑吸光度上限設(shè)置為0.24。試劑吸光度下限為負(fù)向反應(yīng)用， 設(shè)置法同試劑吸光度上限。每種試劑都有 一定的空白吸光度范圍， 試劑空白吸光度的改變往往提示著該試劑的變質(zhì)，此時(shí)應(yīng)更換