半薄超薄切片技術(shù)

1、半薄半薄/超薄切片技術(shù)超薄切片技術(shù)背景背景：肉眼肉眼光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡透射電鏡透射電鏡分分辨辨率率0.2mm0.2m0.2nm應(yīng)應(yīng)用用范范圍圍可觀察可觀察頭發(fā)絲、頭發(fā)絲、雙面刀雙面刀刀刃的刀刃的厚度厚度可觀察可觀察細(xì)胞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)(最大有效倍數(shù):1000)可觀察可觀察細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)的的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu),分辨分辨DNA、蛋白質(zhì)等生物大蛋白質(zhì)等生物大分子、單個(gè)金屬分子、單個(gè)金屬原子（原子（放大倍數(shù)可達(dá)百萬(wàn)倍）觀察半薄切片觀察半薄切片觀察超薄切片觀察超薄切片半薄切片超薄切片？一、超薄切片技術(shù)介紹一、超薄切片技術(shù)介紹固定地固定地好好滲透包埋地滲透包埋地好好切地切地好好載網(wǎng)膜做地載網(wǎng)膜做地好好染地染地好好

2、超薄切片的基本要求超薄切片的基本要求:超薄切片主要步驟超薄切片主要步驟取材取材固定固定漂洗、脫水漂洗、脫水滲透、包埋滲透、包埋超薄切片超薄切片超薄切片染色超薄切片染色每一步都是關(guān)每一步都是關(guān)鍵鍵,任何任何環(huán)節(jié)的環(huán)節(jié)的疏忽疏忽都會(huì)導(dǎo)致都會(huì)導(dǎo)致制片的制片的失敗失敗1 取材取材 1.1 取材的基本要求取材的基本要求 (1)動(dòng)作迅速動(dòng)作迅速，取材后快速放入固定液中；，取材后快速放入固定液中；(2)體積要小體積要小，一般，一般13，如果來(lái)不及，例如野外取材，如果來(lái)不及，例如野外取材，也可將組織修成（也可將組織修成（112）mm大小長(zhǎng)條形，之大小長(zhǎng)條形，之后再進(jìn)行分割。后再進(jìn)行分割。 (3)減小損傷減小損

3、傷，切割器械鋒利，操作輕，避免牽拉、，切割器械鋒利，操作輕，避免牽拉、挫傷與擠壓組織。挫傷與擠壓組織。(4)低溫操作低溫操作，最好在低溫，最好在低溫(04)下進(jìn)行，降低下進(jìn)行，降低酶的活性。所用器具和固定液都應(yīng)預(yù)冷。酶的活性。所用器具和固定液都應(yīng)預(yù)冷。 (5)取材部位要準(zhǔn)確取材部位要準(zhǔn)確。1.2 取材方法取材方法 材料放在潔凈的韌性較大的紙上材料放在潔凈的韌性較大的紙上 滴上預(yù)冷的固定液滴上預(yù)冷的固定液 用刀片將組織切下并修小用刀片將組織切下并修小 用牙簽或鑷子將組織塊移至盛有預(yù)冷用牙簽或鑷子將組織塊移至盛有預(yù)冷的固定液的小瓶中。的固定液的小瓶中。植物材料的取材可以先切成薄片，經(jīng)適植物材料的取

4、材可以先切成薄片，經(jīng)適當(dāng)固定后再切成小方塊繼續(xù)固定。當(dāng)固定后再切成小方塊繼續(xù)固定。 2 固定固定 (抽氣抽氣)2.1 固定的目的固定的目的 采用物理、化學(xué)等方法迅速殺死細(xì)胞的過(guò)采用物理、化學(xué)等方法迅速殺死細(xì)胞的過(guò)程稱(chēng)之為固定。程稱(chēng)之為固定。 目的是盡可能使細(xì)胞中的各種目的是盡可能使細(xì)胞中的各種細(xì)胞器細(xì)胞器以及以及大分子結(jié)構(gòu)大分子結(jié)構(gòu)保持生活狀態(tài)，牢固地固定在保持生活狀態(tài)，牢固地固定在它們它們?cè)瓉?lái)原來(lái)所在的所在的位置位置上，不發(fā)生位移。上，不發(fā)生位移。 良好的固定是獲得精細(xì)結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)圖象良好的固定是獲得精細(xì)結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)圖象的關(guān)鍵。的關(guān)鍵。2.2 常用固定劑常用固定劑 (1)四氧化鋨四氧化鋨 (

5、OsO4)- OSMIUM TETRAOXIDE 強(qiáng)氧化劑，與氮原子有較強(qiáng)的親和力，可較好的固定強(qiáng)氧化劑，與氮原子有較強(qiáng)的親和力，可較好的固定脂肪、脂肪、蛋白質(zhì)、磷酸脂蛋白蛋白質(zhì)、磷酸脂蛋白；固定變性固定變性DNA及核蛋白，及核蛋白，不能不能固定天然固定天然DNA、RNA及糖原；及糖原；具有具有固定固定和和電子染色電子染色雙重作用，樣品圖象反差較好；雙重作用，樣品圖象反差較好；酶的鈍化劑，不適合細(xì)胞化學(xué)的固定；酶的鈍化劑，不適合細(xì)胞化學(xué)的固定；與乙醇與乙醇/醛類(lèi)反應(yīng)生產(chǎn)沉淀漂洗醛類(lèi)反應(yīng)生產(chǎn)沉淀漂洗分子較大分子較大,滲透速度緩慢滲透速度緩慢,但反應(yīng)迅速但反應(yīng)迅速,均勻均勻固定深度固定深度0.25

6、；固定時(shí)間一般為固定時(shí)間一般為1-2小時(shí)小時(shí),時(shí)間太長(zhǎng)易使組織變脆時(shí)間太長(zhǎng)易使組織變脆,切片困難；切片困難；鋨酸固定液常用濃度：鋨酸固定液常用濃度：12; 極易揮發(fā)，對(duì)粘膜、角膜毒性極大極易揮發(fā)，對(duì)粘膜、角膜毒性極大,操作要十分小心操作要十分小心!(2)戊二醛戊二醛 ( C5H8O2)-glutaraldehyde 有效保存組織有效保存組織細(xì)微結(jié)構(gòu)細(xì)微結(jié)構(gòu),對(duì)對(duì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的固定效果好；的固定效果好；滲透力強(qiáng)滲透力強(qiáng),滲透速度快滲透速度快,較好的固定較好的固定糖原糖原、核蛋白核蛋白、微管微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和和細(xì)胞基質(zhì)細(xì)胞基質(zhì)、有絲分裂的紡錘絲有絲分裂的紡錘絲及及胞飲小泡胞飲小泡等；等；保存某些

7、保存某些酶的活力酶的活力,較好保存較好保存抗原抗原,適于細(xì)胞化學(xué)研究；適于細(xì)胞化學(xué)研究；對(duì)組織和細(xì)胞的對(duì)組織和細(xì)胞的穿透力穿透力比四氧化鋨強(qiáng)，均勻固定深比四氧化鋨強(qiáng)，均勻固定深度度:0.51mm ,04可長(zhǎng)時(shí)間固定可長(zhǎng)時(shí)間固定(幾周甚至幾周甚至12個(gè)月個(gè)月)不會(huì)使組織變脆，可用于遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的取材不會(huì)使組織變脆，可用于遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的取材;缺點(diǎn)缺點(diǎn):不能不能保存脂肪，磷脂固定效果差，對(duì)細(xì)胞膜的顯示保存脂肪，磷脂固定效果差，對(duì)細(xì)胞膜的顯示較差，沒(méi)有電子染色作用。較差，沒(méi)有電子染色作用。 (3)甲醛甲醛-Formaldehyde 滲透組織的能力比戊二醛強(qiáng)，對(duì)于致密組織滲透組織的能力比戊二醛強(qiáng)，對(duì)于致密組

8、織（種子）固定作用好；（種子）固定作用好；細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)保存質(zhì)量不如戊二醛，但酶活細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)保存質(zhì)量不如戊二醛，但酶活性的保存優(yōu)于戊二醛；性的保存優(yōu)于戊二醛；缺點(diǎn)缺點(diǎn)：不能較好的固定細(xì)胞基質(zhì)，脫水后大：不能較好的固定細(xì)胞基質(zhì)，脫水后大部分細(xì)胞基質(zhì)將丟失；部分細(xì)胞基質(zhì)將丟失；常用常用多聚甲醛戊二醛多聚甲醛戊二醛的混合固定液。的混合固定液。(4)高錳酸鉀高錳酸鉀強(qiáng)氧化劑，較好固定強(qiáng)氧化劑，較好固定脂蛋白脂蛋白;對(duì)對(duì)神經(jīng)髓鞘神經(jīng)髓鞘、葉綠體葉綠體及其他各種及其他各種膜結(jié)膜結(jié)構(gòu)構(gòu)的研究均可作為固定劑；的研究均可作為固定劑；只用于某些常用固定劑難以固定的植只用于某些常用固定劑難以固定的植物和酵母樣品，且

9、一般不需要用鋨酸物和酵母樣品，且一般不需要用鋨酸后固定后固定.3漂洗、脫水漂洗、脫水3.1漂洗漂洗漂洗的目的漂洗的目的:組織固定后脫水前的漂洗組織固定后脫水前的漂洗: 清除殘留固定劑清除殘留固定劑,減小固定劑和脫水劑之間減小固定劑和脫水劑之間的反應(yīng)，避免沉淀物干擾超微結(jié)構(gòu)的觀察的反應(yīng)，避免沉淀物干擾超微結(jié)構(gòu)的觀察.雙重固定中雙重固定中,在鋨酸固定前的漂洗在鋨酸固定前的漂洗: 避免鋨酸與戊二醛反應(yīng)生成細(xì)小而致密的避免鋨酸與戊二醛反應(yīng)生成細(xì)小而致密的餓沉淀，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)餓沉淀，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu).常常 用用 緩沖液緩沖液優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn)缺缺 點(diǎn)點(diǎn) pH磷酸鹽磷酸鹽緩沖液緩沖液對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用,

10、緩沖能力強(qiáng)緩沖能力強(qiáng)固定時(shí)易產(chǎn)生固定時(shí)易產(chǎn)生沉淀沉淀,易長(zhǎng)細(xì)菌易長(zhǎng)細(xì)菌植物材植物材料一般料一般6.87.2二甲砷二甲砷酸鹽緩酸鹽緩沖液沖液不易長(zhǎng)細(xì)菌不易長(zhǎng)細(xì)菌,與低與低濃度鈣質(zhì)濃度鈣質(zhì)1-3mM不發(fā)生沉淀反應(yīng)不發(fā)生沉淀反應(yīng)有毒有毒(通風(fēng)櫥通風(fēng)櫥)醋酸醋酸巴比妥巴比妥緩沖液緩沖液固定時(shí)不產(chǎn)生沉淀固定時(shí)不產(chǎn)生沉淀易長(zhǎng)細(xì)菌易長(zhǎng)細(xì)菌,只適只適于配鋨酸固定于配鋨酸固定液液,不適合配醛不適合配醛類(lèi)類(lèi)(緩沖失效緩沖失效)3.2 脫水脫水 目的目的 將組織內(nèi)的游離水徹底清除將組織內(nèi)的游離水徹底清除,保證保證包埋介質(zhì)包埋介質(zhì)完全完全滲入組織內(nèi)部。滲入組織內(nèi)部。 方法方法 用一種和水及包埋劑均能相混溶用一種和水及

11、包埋劑均能相混溶的液體來(lái)取代水的液體來(lái)取代水,常用的脫水劑是常用的脫水劑是乙醇乙醇和和丙酮丙酮。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 脫水梯度逐級(jí)進(jìn)行脫水梯度逐級(jí)進(jìn)行, 急劇脫水會(huì)引起細(xì)胞收急劇脫水會(huì)引起細(xì)胞收縮縮。（。（ 30% 50%70%80%95%100%100%）; 更換溶液動(dòng)作要快更換溶液動(dòng)作要快。長(zhǎng)時(shí)間暴露空氣中會(huì)。長(zhǎng)時(shí)間暴露空氣中會(huì)在組織內(nèi)外產(chǎn)生微小氣泡，影響滲透；在組織內(nèi)外產(chǎn)生微小氣泡，影響滲透； 脫水過(guò)程中應(yīng)在脫水過(guò)程中應(yīng)在70%脫水劑中脫水劑中4停留或過(guò)停留或過(guò)夜夜,過(guò)度脫水不僅引起更多物質(zhì)的抽提，而過(guò)度脫水不僅引起更多物質(zhì)的抽提，而且會(huì)使樣品發(fā)脆，造成切片困難且會(huì)使樣品發(fā)脆，造成切片困難;

12、 置換置換用脫水劑：環(huán)氧丙烷（用脫水劑：環(huán)氧丙烷（Epon812）、）、二甲苯（石蠟）。二甲苯（石蠟）。4 滲透和包埋、聚合滲透和包埋、聚合4.1滲透滲透滲透就是利用滲透就是利用包埋劑包埋劑滲入到組織內(nèi)部滲入到組織內(nèi)部取代取代脫水劑脫水劑的過(guò)程。的過(guò)程。 包埋劑在單體狀態(tài)時(shí)包埋劑在單體狀態(tài)時(shí)(聚合前聚合前)為液體，為液體，能夠滲入組織內(nèi)，當(dāng)加入某些催化劑，能夠滲入組織內(nèi)，當(dāng)加入某些催化劑，經(jīng)加溫或其他條件，能聚合成固體，經(jīng)加溫或其他條件，能聚合成固體，以便進(jìn)行超薄切片。以便進(jìn)行超薄切片。4.2 包埋、聚合包埋、聚合 包埋操作：包埋操作： 將組織塊包埋在多孔橡膠包埋模板中將組織塊包埋在多孔橡膠包

13、埋模板中或膠囊中，一定條件下可聚合硬化，或膠囊中，一定條件下可聚合硬化，形成包埋塊。形成包埋塊。包埋板包埋板1包埋管包埋管膠囊膠囊常用的包埋劑常用的包埋劑Epon812滲透效果好，切片的圖像對(duì)比度強(qiáng)，滲透效果好，切片的圖像對(duì)比度強(qiáng)，電子束照射下穩(wěn)定電子束照射下穩(wěn)定吸潮性很強(qiáng)，吸潮性很強(qiáng)，潮濕和炎熱的潮濕和炎熱的環(huán)境下，樹(shù)脂環(huán)境下，樹(shù)脂會(huì)變軟會(huì)變軟Spurr黏度低，可較好地滲透具有黏度低，可較好地滲透具有硬的木硬的木質(zhì)化細(xì)胞壁的植物細(xì)胞質(zhì)化細(xì)胞壁的植物細(xì)胞、脂肪含量、脂肪含量很高的很高的內(nèi)胚乳內(nèi)胚乳、高度液泡化的、高度液泡化的成熟成熟果實(shí)果實(shí),電子束照射下穩(wěn)定電子束照射下穩(wěn)定圖像對(duì)比度較圖像對(duì)比

14、度較弱弱Araldite聚合均勻，收縮量很小，超薄切片聚合均勻，收縮量很小，超薄切片可直接沾在沒(méi)有支持膜的載網(wǎng)上，可直接沾在沒(méi)有支持膜的載網(wǎng)上，電子束照射下十分穩(wěn)定，用重金屬電子束照射下十分穩(wěn)定，用重金屬染色時(shí)易著色。染色時(shí)易著色。環(huán)氧樹(shù)脂環(huán)氧樹(shù)脂(epoxy resin)水溶性樹(shù)脂丙烯酸類(lèi)樹(shù)脂水溶性樹(shù)脂丙烯酸類(lèi)樹(shù)脂 LR White、 Lowicryls、GMA、PEG 等，等，適于進(jìn)行組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)研究的樣品適于進(jìn)行組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)研究的樣品制備。制備。 適于低溫包埋，通常用于免疫電鏡樣品的適于低溫包埋，通常用于免疫電鏡樣品的制備。制備。 包埋操作中的注意事項(xiàng)包埋操作中的注意事項(xiàng)所有

15、所有試劑試劑要要防潮防潮，最好存放在干燥器中；，最好存放在干燥器中；所用所用器皿器皿應(yīng)烘干；應(yīng)烘干；配包埋劑時(shí)，每加入一種試劑要攪拌均勻；配包埋劑時(shí)，每加入一種試劑要攪拌均勻；包埋時(shí)動(dòng)作要輕巧，防止產(chǎn)生氣泡；包埋時(shí)動(dòng)作要輕巧，防止產(chǎn)生氣泡；盛放過(guò)包埋劑的容器要及時(shí)用丙酮清洗干凈盛放過(guò)包埋劑的容器要及時(shí)用丙酮清洗干凈.皮膚盡量不要接觸包埋劑，以免引起皮炎；皮膚盡量不要接觸包埋劑，以免引起皮炎；5 超薄切片超薄切片5.1修塊修塊削去表面的包埋劑，露出組織，然后在組削去表面的包埋劑，露出組織，然后在組織的四周以和水平面成織的四周以和水平面成45度的角度削去包度的角度削去包埋劑，修成金字塔形，頂面修成

16、梯形或長(zhǎng)埋劑，修成金字塔形，頂面修成梯形或長(zhǎng)方形，每邊的長(zhǎng)度為方形，每邊的長(zhǎng)度為0.2mm0.3mm。5.2 超薄切片超薄切片 超薄切片機(jī)：超薄切片機(jī)：LEICA ULTRACUT R超薄切片厚度超薄切片厚度: 100nm,一般一般 50-70nm5.3 載網(wǎng)和支持膜載網(wǎng)和支持膜(1)載網(wǎng)載網(wǎng)(超薄超薄) 載網(wǎng)載網(wǎng)銅網(wǎng)銅網(wǎng)(常用常用)不銹鋼網(wǎng)不銹鋼網(wǎng)鎳網(wǎng)鎳網(wǎng)(免疫電鏡免疫電鏡)直徑：2-3mm，厚度：0.03-0.02mm 5.3 載網(wǎng)和支持膜載網(wǎng)和支持膜 (2) 載網(wǎng)支持膜載網(wǎng)支持膜膜的要求膜的要求:透明無(wú)結(jié)構(gòu)透明無(wú)結(jié)構(gòu),并能承受電子束的轟擊并能承受電子束的轟擊.支持膜的種類(lèi)支持膜的種類(lèi):

17、火棉膠膜火棉膠膜 聚乙烯醇縮甲醛膜聚乙烯醇縮甲醛膜(formvar膜膜) 碳膜碳膜膜的厚度膜的厚度:10nm20nm6 超薄切片的染色超薄切片的染色目的目的: 增強(qiáng)樣品的反差增強(qiáng)樣品的反差,提高圖象的清晰度提高圖象的清晰度.常用染色劑常用染色劑: 重金屬鹽重金屬鹽 各種染料各種染料常用的染色劑常用的染色劑: 醋酸鈾和檸檬酸鉛。醋酸鈾和檸檬酸鉛。染色方法：染色方法：(1) 組織塊染色組織塊染色 在脫水至在脫水至70%乙醇時(shí)，將組織塊放在用乙醇時(shí)，將組織塊放在用70%乙醇配制的飽和醋酸鈾溶液中，染色乙醇配制的飽和醋酸鈾溶液中，染色時(shí)間時(shí)間2小時(shí)以上，或在冰箱中過(guò)夜。小時(shí)以上，或在冰箱中過(guò)夜。 超薄

18、切片染色超薄切片染色(2)超薄切片后染色超薄切片后染色醋酸雙氧鈾醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染檸檬酸鉛雙染鈾染鈾染:細(xì)胞核及結(jié)締組織染色細(xì)胞核及結(jié)締組織染色鉛染鉛染:提高細(xì)胞質(zhì)成分的反差提高細(xì)胞質(zhì)成分的反差1）前固定）前固定（固定液體積是固定材料的十倍以上，材料不堆積固定液體積是固定材料的十倍以上，材料不堆積）3%戊二醛戊二醛 in 0.1M PBS ,ph7.2，室溫，室溫5-6h，后，后4C保存保存2）漂洗：）漂洗： 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗充分漂洗3-4次，次，20-30Min/次次3）后固定）后固定1%鋨酸固定鋨酸固定 in 0.1M PBS，4C overnight4）漂洗：

19、）漂洗： 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗充分漂洗3-4次，次，20-30Min/次次5）系列脫水）系列脫水：30%-50%-70%（4C, overnight,可以停下）可以停下）-80%-95%-100%-100%）用丙酮置換乙醇：用丙酮置換乙醇：乙醇乙醇:丙酮丙酮=1:1，純丙酮，純丙酮2次，次， 每級(jí)每級(jí)20-30分鐘分鐘6）滲透）滲透丙酮丙酮:樹(shù)脂樹(shù)脂=2:1， 1:1（可以停下了，（可以停下了，overnight） ，1:2 2-3h/級(jí)級(jí)純樹(shù)脂純樹(shù)脂12h，換純樹(shù)脂換純樹(shù)脂12h （從進(jìn)入樹(shù)脂開(kāi)始更要嚴(yán)格防潮?。◤倪M(jìn)入樹(shù)脂開(kāi)始更要嚴(yán)格防潮?。?）包埋聚合）包埋聚合 60C

20、 24hr注意：免疫電鏡時(shí)不用鋨酸固定，樹(shù)脂換成注意：免疫電鏡時(shí)不用鋨酸固定，樹(shù)脂換成LRWhite等水溶性樹(shù)脂，固等水溶性樹(shù)脂，固定液可以是定液可以是1.25%戊二醛戊二醛+1.25%多聚甲醛多聚甲醛 in 0.1M PBS Ph 7.2超薄切片圖片超薄切片圖片二、半薄切片技術(shù)介紹二、半薄切片技術(shù)介紹半薄切片主要步驟半薄切片主要步驟取材取材固定固定漂洗、脫水漂洗、脫水滲透、包埋滲透、包埋半薄切片半薄切片半薄切片染色半薄切片染色每一步都是關(guān)每一步都是關(guān)鍵鍵,任何任何環(huán)節(jié)的環(huán)節(jié)的疏忽疏忽都會(huì)導(dǎo)致都會(huì)導(dǎo)致制片的制片的失敗失敗FAA固定液固定液（福爾馬林（福爾馬林5-冰醋酸冰醋酸5-70%酒精酒精90）半?。┌氡?石蠟切片石蠟切片一般固定根、莖、葉、花藥、子房組一般固定根、莖、葉、花藥、子房組織切片。織切片。幼嫩材料用幼嫩材料用50%酒精代替酒精代替70%酒精，酒精，防止材料收縮；防止材料收縮；加入加入5%甘油可防固定液蒸發(fā)和材料變甘油可防固定液蒸發(fā)和材料變硬。硬。卡諾固定液卡諾固定液 12純酒精15ml30ml氯仿5ml 冰醋酸5ml1ml滲透迅速