青霉素生產(chǎn)工藝過程

1、青霉素生產(chǎn)工藝過程一、宵霉素的發(fā)酵工藝過程1、工藝流程（1）絲狀菌三級發(fā)酵工藝流程冷凍管（25C,抱子培養(yǎng)，7天）一一斜面母瓶（25C,抱子培養(yǎng)，7天）一一 大米抱子（26C，種子培養(yǎng)56h,1:1.5vvm ）一級種子培養(yǎng)液（27C,種子 培養(yǎng)，24h,1:1.5vvm ） 二級種子培養(yǎng)液（2726C，發(fā)酵,7天,1:0.95vvm ） 發(fā)酵液。（2）球狀菌二級發(fā)酵工藝流程冷凍管（25C,抱子培養(yǎng)，68天）一一親米（25C,抱子培養(yǎng)，810天）一一 生產(chǎn)米（28C,抱子培養(yǎng)，5660h,1:1.5vvm ） 種子培養(yǎng)液（2625-24C, 發(fā)酵，7天，1: 0.8vvm）發(fā)酵液。2、工藝控制

2、（1）影響發(fā)酵產(chǎn)率的因素基質(zhì)濃度：在分批發(fā)酵中，常常因為前期基質(zhì)量濃度過高，對生物合成酶系產(chǎn)生阻遏（或抑制）或?qū)z生長產(chǎn)生抑制（如葡萄糖和錢的阻遏或抑制，苯乙 酸的生長抑制），而后期基質(zhì)濃度低限制了菌絲生長和產(chǎn)物合成，為了避免這一 現(xiàn)象，在宵霉素發(fā)酵中通常采用補(bǔ)料分批操作法，即對容易產(chǎn)生阻遏、抑制和限 制作用的基質(zhì)進(jìn)行緩慢流加以維持一定的最適濃度。這里必須特別注意的是葡萄 糖的流加，因為即使是超出最適濃度范圍較小的波動，都將引起嚴(yán)重的阻遏或限制，使生物合成速度減慢或停止。目前，糖濃度的檢測尚難在線進(jìn)行，故葡萄糖 的流加不是依據(jù)糖濃度控制，而是間接根據(jù)pH值、溶氧或CQ釋放率予以調(diào)節(jié)。（2）溫

3、度：宵霉素發(fā)酵的最適溫度隨所用菌株的不同可能稍有差別，但一般認(rèn)為應(yīng)在25C左右。溫度過高將明顯降低發(fā)酵產(chǎn)率，同時增加葡萄糖的維持消 耗，降低葡萄糖至宵霉素的轉(zhuǎn)化率。 對菌絲生長和宵霉素合成來說，最適溫度不 是一樣的，一般前者略高于后者,故有的發(fā)酵過程在菌絲生長階段采用較高的 溫度，以縮短生長時間，到達(dá)生產(chǎn)階段后便適當(dāng)降低溫度，以利于宵霉素的合成。（3）pH值：宵霉素發(fā)酵的最適pH值一般認(rèn)為在6.5左右，有時也可以略高或略低一些，但應(yīng)盡量避免pH值超過7.0,因為宵霉素在堿性條件下不穩(wěn)定，容 易加速其水解。在緩沖能力較弱的培養(yǎng)基中，pH值的變化是葡萄糖流加速度高 低的反映。過高的流加速率造成酸性

4、中間產(chǎn)物的積累使pH值降低；過低的加糖速率不足以中和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的氨或其他生理堿性物質(zhì)代謝產(chǎn)生的堿性化合物而引起pH值上升。（4）溶氧：對于好氧的宵霉素發(fā)酵來說，溶氧濃度是影響發(fā)酵過程的一個重 要因素。當(dāng)溶氧濃度降到30泌和度以下時，宵霉素產(chǎn)率急劇下降，低于10%何 和度時，則造成不可逆的損害。溶氧濃度過高，說明菌絲生長不良或加糖率過低， 造成呼吸強(qiáng)度下降，同樣影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。溶氧濃度是氧傳遞和氧消耗的一 個動態(tài)平衡點,而氧消耗與碳能源消耗成正比,故溶氧濃度也可作為葡萄糖流 加控制的一個參考指標(biāo)。(5) 菌絲濃度：發(fā)酵過程中必須控制菌絲濃度不超過臨界菌體濃度，從而使氧 傳遞速率與氧消耗速

5、率在某一溶氧水平上達(dá)到平衡。宵霉素發(fā)酵的臨界菌體濃度 隨菌株的呼吸強(qiáng)度(取決于維持因數(shù)的大小,維持因數(shù)越大，呼吸強(qiáng)度越高)，發(fā) 酵通氣與攪拌能力及發(fā)酵的流變學(xué)性質(zhì)而異。呼吸強(qiáng)度低的菌株降低發(fā)酵中氧的 消耗速率，而通氣與攪拌能力強(qiáng)的發(fā)酵罐及黏度低的發(fā)酵液使發(fā)酵中的傳氧速率 上升,從而提高臨界菌體濃度。(6) 菌絲生長速度：用恒化器進(jìn)行的發(fā)酵試驗證明，在葡萄糖限制生長的條件下，宵霉素比生產(chǎn)速率與產(chǎn)生菌菌絲的比生長速率之間呈一定關(guān)系。當(dāng)比生長速率低于0.015h-1時，比生產(chǎn)速率與比生長速率成正比,當(dāng)比生長速率高于 O.015h-1時,比生產(chǎn)速率與比生長速率無關(guān)。因此，要在發(fā)酵過程中達(dá)到并維 持最大

6、比生產(chǎn)速率,必須使比生長速率不低0.015h-1。這一比生長速率稱為臨 界比生長速率。對于分批補(bǔ)料發(fā)酵的生產(chǎn)階段來說，維持0.015h-1的臨界比生 長速率意味著每46h就要使菌絲濃度或發(fā)酵液體積加倍，這在實際工業(yè)生產(chǎn)中 是很難實現(xiàn)的。事實上，宵霉素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)階段控制的比生長速率要比這一理 論臨界值低得多，卻仍然能達(dá)到很高的比生產(chǎn)速率。這是由于工業(yè)上采用的補(bǔ)料 分批發(fā)酵過程不斷有部分菌絲自溶，抵消了一部分生長，故雖然表觀比生長速 率低，但真比生長速率卻要高一些。(7) 菌絲形態(tài)：在長期的菌株改良中，宵霉素產(chǎn)生菌在沉沒培養(yǎng)中分化為主要 呈絲狀生長和結(jié)球生長兩種形態(tài)。前者由于所有菌絲體都能充分和

7、發(fā)酵液中的基 質(zhì)及氧接觸，故一般比生產(chǎn)速率較高； 后者則由于發(fā)酵液黏度顯著降低，使氣- 液兩相問氧的傳遞速率大大提高，從而允許更多的菌絲生長(即臨界菌體濃度 較高)，發(fā)酵罐體積產(chǎn)率甚至高于前者。在絲狀菌發(fā)酵中，控制菌絲形態(tài)使其保持適當(dāng)?shù)姆种Ш烷L度，并避免結(jié)球，是 獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵要素之一。而在球狀菌發(fā)酵中，使菌絲球保持適當(dāng)大小和松緊， 并盡量減少游離菌絲的含量，也是充分發(fā)揮其生產(chǎn)能力的關(guān)鍵素之一。這種形態(tài) 的控制與糖和氮源的流加狀況及速率、攪拌的剪切強(qiáng)度及比生長速率密切相關(guān)。3、工藝控制要點(1)種子質(zhì)量的控制 絲狀菌的生產(chǎn)種子是由保藏在低溫的冷凍安St管經(jīng)甘油、 葡萄糖、蛋白月東斜面移植到小米

8、固體上，25 C培養(yǎng)7天，真空十燥并以這種 形式保存?zhèn)溆?。生產(chǎn)時它按一定的接種量移種到含有葡萄糖、玉米漿、尿素為主 的種子罐內(nèi),26 C培養(yǎng)56h左右，菌絲濃度達(dá)6%-8%，菌絲形態(tài)正常，按10%-15%勺接種量移人含有花生餅粉、葡萄糖為主的二級種子罐內(nèi) ,27 C培養(yǎng) 24h,菌絲體積10%-12%,形態(tài)正常，效價在700D/ml左右便可作為發(fā)酵種子。球狀菌的生產(chǎn)種子是由冷凍管子抱子經(jīng)混有 O. 5% -1.0 %玉米漿的三角瓶培 養(yǎng)原始親米抱子，然后再移人羅氏瓶培養(yǎng)生產(chǎn)大米抱子 （乂稱生產(chǎn)米），親米和 生產(chǎn)米均為25 C靜置培養(yǎng)，需經(jīng)常觀察生長發(fā)育情況在培養(yǎng)到 3-4天，大米 表面長出明顯

9、小集落時要振搖均勻，使菌絲在大米表面能均勻生長，待10天 左右形成綠色抱子即可收獲。親米成熟接人生產(chǎn)米后也要經(jīng)過激烈振蕩才可放置 恒溫培養(yǎng)，生產(chǎn)米的抱子量要求每粒米300萬只以上。親米、生產(chǎn)米子抱子都需 保存在5 C冰箱內(nèi)。工藝要求將新鮮的生產(chǎn)米（指收獲后的抱瓶在10天以內(nèi)使用）接人含有花生餅 粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、飴糖為主的種子罐內(nèi)，28 C培養(yǎng)50-60h當(dāng)pH值由 6. 0-6. 5 下降至5.5-5. 0，菌絲呈菊花團(tuán)狀，平均直徑在100- 130 m，每毫升的球數(shù)為6萬-8萬只，沉降率在85%以上，即可根據(jù)發(fā)酵罐球數(shù)控制在 8000-11000只/ml范圍的要求，計算移種體積，然后

10、接入發(fā)酵罐，多余的種子 液棄去。球狀菌以新鮮抱子為佳，其生產(chǎn)水平優(yōu)于真空十燥的抱子，能使宵霉素 發(fā)酵單位的罐批差異減少。（2）培養(yǎng)基成分的控制a. 碳源 產(chǎn)黃宵霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。目前生產(chǎn)上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液（DE值50%以上）進(jìn)行流加。b. 氮源氮源常選用玉米漿、精制棉籽餅粉、款皮，并補(bǔ)加無機(jī)氮源（硫酸氨、 氨水或尿素）。c. 前體 生物合成含有節(jié)基基團(tuán)的宵霉素 G，需在發(fā)酵液中加人前體。前體可用 苯乙酸、苯乙酰胺，一次加入量不大于0.1%，并采用多次加入，以防止前體對 宵霉素的蠹害。d. 無機(jī)鹽加人的無機(jī)鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等 ，且用量要適度。另外，由

11、于鐵離子對背霉菌有蠹害作用，必須嚴(yán)格控制鐵離子的濃度，一般控制在30g/ml o（3）發(fā)酵培養(yǎng)的控制a. 加糖控制加糖量的控制是根據(jù)殘?zhí)橇考鞍l(fā)酵過程中的 pH值確定，最好是 根據(jù)排氣中CO2量及O2量來控制，一般在殘?zhí)墙抵?.6%左右，pH值上升時 開始加糖。b. 補(bǔ)氮及加前體補(bǔ)氮是指加硫酸鉉、氨水或尿素，使發(fā)酵液氨氮控制在O. 01%-0.05%，補(bǔ)前體以使發(fā)酵液中殘存苯乙酰胺濃度為 0.05%-0.08%。-c. pH值控制 對pH值的要求視不同菌種而異，一般為pH 6.4-6.8， 可以補(bǔ)加葡萄糖來控制。目前一般采用加酸或加堿控制 pH值。d.溫度控制 前期2 5- 2 6 C ,后期2

12、3 C ,以減少后期發(fā)酵液中宵霉素的降解破壞。e.溶解氧的 控制 一般要求發(fā)酵中溶解氧量不低于飽和溶解氧的 30%。通風(fēng)比一般為1 : 0. 8L/(L ? min), 攪拌轉(zhuǎn)速在發(fā)酵各階段應(yīng)根據(jù)需要而調(diào)整。f. 泡沫的控制 在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量泡沫，可以用天然油脂，如豆油、玉米油 等或用化學(xué)合成消泡劑"泡敵"來消泡，應(yīng)當(dāng)控制其用量并要少量多次加入， 尤其在發(fā)酵前期不宜多用，否則會影響菌體的呼吸代謝g. 發(fā)酵液質(zhì)量控制 生產(chǎn)上按規(guī)定時間從發(fā)酵罐中取樣，用顯微鏡觀察菌絲形 態(tài)變化來控制發(fā)酵。生產(chǎn)上慣稱"鏡檢",根據(jù)"鏡檢"中菌絲形變化和代謝變 化的其他指標(biāo)調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度，通過追加糖或補(bǔ)加前體等各種措施來延長發(fā)酵時間,以獲得最多宵霉素。當(dāng)菌絲