《高效液相色譜HL》ppt課件

1、高效液相色譜 high performance liquid chromatography,HPLC中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系 徐克前一根本原理一定義 HPLC 是利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同，進(jìn)展延續(xù)的、無數(shù)次的交換和分配而到達(dá)分別的過程。 組成： 固定相柱內(nèi)填料 流動相洗脫劑二固定相stationary phase)和 流動相mobile phase(1)化學(xué)鍵合相硅膠化學(xué)官能團(tuán)鍵合到硅膠外表 OH OH | |硅膠SiO2 nH2O Si O Si | |鍵合相反響 R1 | | | | Si OH + XSiR Si OSiR + HX | | | | R2 硅

2、膠 有機(jī)硅烷 鍵合相X: Cl、CH3O、C2H5O等R: 烷C8(C8H17) 、C10(C10H21) 、C18(C18H37)等R1 R2: Z、CH3等(2)十八烷基硅烷鍵合硅膠填充料octadecylsilyl, ODS萬能柱 即C18柱或ODS柱 主要用于反相HPLC中，適用于各種類型的生物分子 (3) 短鏈烷基鍵合物 短鏈烷基c3、 c4等大孔硅膠 鍵合物 適用于氨基酸、小肽等生物小分子(4)鍵合到基質(zhì)上的官能團(tuán)性質(zhì) 反相柱：填料是非極性的，官能團(tuán)為烷烴，如 C18 、C8 、C4等 正相柱：填料是極性的，官能團(tuán)為CN、NH2等 離子交換鍵合相：陽離子官能團(tuán)：SO3H、2、流動相

3、 mobilephase 流動相選擇原那么： 1.樣品易污，且溶解度盡能夠大2.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱3.不妨礙檢測器檢測分析4.粘度低，流動性好5.易于從中回收樣品6.無毒或低毒，易于操作7.易于制成高純度，即色譜純8.廢液易處置，不污染環(huán)境二、分別方式 正相HPLC 反相HPLC 離子交換HPLC 凝膠HPLC 親和HPLC一正相HPLCnormal phase HPLC ,NP- HPLC 固定相：極性吸附劑或極性鍵合相，如硅膠、Al3O2 流動相：非極性或弱極性溶劑，如己烷、庚烷等 洗脫順序：非極性、弱極性、極性 運(yùn)用：石油化工產(chǎn)品、染料、農(nóng)藥、醫(yī)藥、有機(jī)酸、有機(jī)堿等二反相HPLCre

4、verse phase HPLC ,RP- HPLC 固定相：非極性物質(zhì)，如C18(ODS)、 C10、C8 、C6 、C4 、C2 流動相：極性溶劑，如甲醇/H2O、乙腈/H2O等 洗脫順序：極性、弱極性、非極性 運(yùn)用：蛋白質(zhì)、多肽等三離子交換HPLCion-exchange HPLC ,IE- HPLC 原理：用離子交換劑作固定相，根據(jù)不同組分在一定pH下，組分電荷性質(zhì)和數(shù)量不同而分別的技術(shù) 分類：陽離子交換樹脂：含酸性基團(tuán)： 四凝膠HPLCgel HPLC ,G- HPLC 原理：基于分子大小和外形的差別進(jìn)展分析的技術(shù) 固定相：交聯(lián)葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠 流動相：水、乙醇、丙酮等 運(yùn)用：

5、核酸、蛋白質(zhì)、酶、多糖等五親和HPLCaffinity HPLC ,AF- HPLC 原理：利用生物大分子間專注的親和力進(jìn)展分別的技術(shù) 固定相：基質(zhì)瓊脂糖凝膠等交聯(lián)配基親和性 運(yùn)用：酶、抗體、抗原、受體等三、 HPLC儀器 HPLC儀 普通由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱、檢測器、記錄和數(shù)據(jù)處置系統(tǒng)及計(jì)算機(jī)等幾部分組成一輸液系統(tǒng)：貯液及脫氣安裝梯度洗脫安裝高壓輸液泵梯度洗脫安裝高壓輸液泵二進(jìn)樣系統(tǒng)：三柱系統(tǒng)：四檢測器：與泵、柱組成HPLC的三大關(guān)鍵部件1.紫外吸收檢測器2.熒光檢測器4.示差折光檢測器 表.HLPC常用檢測器 檢測器 原理 檢測下限g/ml 檢測范圍 紫外檢測器 具有紫外吸收性質(zhì)

6、10-7 熒光檢測器 具有熒光物質(zhì) 10-14 電化學(xué)檢測器 具有電解活性物質(zhì) 10-12 示差折光檢測器 與流動相折光率不同 10-7 糖類等五不同HPLC產(chǎn)品引見：高效液相色譜儀器高效液相色譜儀器高效液相色譜儀器2 2高效液相色譜儀器高效液相色譜儀器3 3高效液相色譜儀器高效液相色譜儀器4 4四、定性和定量定性分析保管值定性：比較未知峰與規(guī)范物的保管值搜集未知峰洗脫液定性：物理分析，化學(xué)分析，生物學(xué)分析聯(lián)機(jī)定性：液質(zhì)聯(lián)用液紅聯(lián)用定量分析 分析檢測物質(zhì)的量或濃度與檢測器的呼應(yīng)值峰面積或峰高呈正比 1.規(guī)范曲線法：也稱外標(biāo)法或直接比較法。用規(guī)范品等體積直接進(jìn)樣，得規(guī)范曲線，再用待測樣品的峰面積或峰高與其對照 2.內(nèi)標(biāo)