醫(yī)學(xué)標(biāo)書范文

1、溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)科科研項(xiàng)目申請(qǐng)書項(xiàng)目名稱：申請(qǐng)者：蔣淑麗所在學(xué)校申請(qǐng)日期:2011-6-15溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)科科研項(xiàng)目申請(qǐng)書簡(jiǎn)表研究 項(xiàng) 目項(xiàng)目名稱研究類別研究性質(zhì)基礎(chǔ)研究應(yīng)用研究實(shí)驗(yàn)發(fā)展申請(qǐng)金額50000密級(jí)機(jī)密 秘密內(nèi)部V一般姓名蔣淑麗性別女出生年月1989 .7政治面貌預(yù)黨民族漢職稱學(xué)歷本科學(xué)位學(xué)士部門部門電話申請(qǐng)人起止年月2011-6-15 至 2014-6-1手150885509993968559qq.co家庭電話E-Mail機(jī)92m隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，腫瘤基因治療實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用都有了很大 進(jìn)步，而對(duì)膀胱癌的研究有助于其他部位癌癥研究的發(fā)展。從其理論基礎(chǔ)和 相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展進(jìn)行了分析，

2、并就腫瘤基因治療的新途徑、取得的主要成 就、存在的問(wèn)題及展望進(jìn)行了綜述。關(guān)鍵詞 色素上皮衍生因子 膀胱癌色素上皮衍生因子（ PEDF ）在膀胱癌中的表 達(dá)及其對(duì)膀胱癌治療作用的研究立論依據(jù)一、趨勢(shì)判斷和需求分析國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢(shì)（含知識(shí)產(chǎn)權(quán)狀況和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)狀況） ；經(jīng)濟(jì)建設(shè)和社會(huì)發(fā)展需求；科 學(xué)技術(shù)價(jià)值、特色和創(chuàng)新點(diǎn)。膀胱癌是危及人類健康的重大疾病，全世界范圍內(nèi)統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率占全身腫瘤的第 8 位，在男性其標(biāo) 準(zhǔn)發(fā)病率 9.9/10 萬(wàn)；在女性，其標(biāo)準(zhǔn)發(fā)病率為 2.3/10 萬(wàn)，占第 25 位。死亡率在男性為 4.2/10 萬(wàn)，占全身 腫瘤死亡率的第 9 位，在女性為 1.1/10 萬(wàn)，占

3、第 16 位。在我國(guó) ,膀胱癌也是泌尿外科的最常見(jiàn)惡性腫瘤， 占全身惡性腫瘤的 3.2% ，1995年，北京市城區(qū)膀胱癌發(fā)病率大約為 7/10 萬(wàn)人，上海市城區(qū)發(fā)病率為 8.6/10 萬(wàn)人1 ，且今后發(fā)病率仍有上升趨勢(shì)。作為危害人類健康的常見(jiàn)惡性腫瘤，膀胱癌發(fā)病機(jī)制和治療方面 的研究始終是臨床基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)之一。目前膀胱癌的治療仍以手術(shù)切除為主，輔以膀胱灌注化療和免疫治療、全身化療、放療和生物治 療等措施 , 但這些治療方法效果都不滿意，主要是治療后易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率高達(dá)80%，其中大約 16%-25%復(fù)發(fā)的腫瘤其惡性程度增加，有 10%發(fā)展為浸潤(rùn)性或轉(zhuǎn)移性癌，因此 ,尋找一種新的、更有效的生物治

4、療 方法，是當(dāng)前臨床迫切需要解決的問(wèn)題。在膀胱癌的這些輔助性治療方法中， 無(wú)論是化療還是免疫治療， 主要機(jī)制是通過(guò)直接殺死腫瘤細(xì)胞、 阻斷腫瘤細(xì)胞分裂或誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的方式來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。做為一種實(shí)體性腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞的增殖 固然重要，而新生血管的形成在腫瘤的生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中也發(fā)揮非常重要作用。在正常狀態(tài)下， 人體內(nèi)的脈管系統(tǒng)在血管生長(zhǎng)因子和抑制因子網(wǎng)絡(luò)式的相互作用下處于平衡狀態(tài)；病理狀態(tài)下，尤其是 發(fā)生惡性腫瘤時(shí)，這種平衡向血管生成的方向發(fā)展。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)達(dá)到腫瘤組織超過(guò) 2mm 時(shí)就會(huì)有新生血 管形成，如果沒(méi)有新生血管生成，腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，甚至停止 2，3?？寡苌莎煼ㄊ遣煌?/p>

5、目 前常規(guī)療法的新的腫瘤治療策略，具有高效低毒和不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)4 。有關(guān)血管生長(zhǎng)因子和血管生長(zhǎng)抑制因子在腫瘤中所起作用，以及通過(guò)抗血管生成治療腫瘤已經(jīng)成為當(dāng)前腫瘤研究的一個(gè)熱點(diǎn)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，色素上皮衍生因子（ pigment epithelium derived factor, PEDF ）是一種對(duì)腫瘤有抑制 作用的細(xì)胞因子。這種細(xì)胞因子是 Tombran-Tink 等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的，由人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)，分子量為50 KD5，屬于serpin卵白蛋白/PAT-2亞群，其基因全長(zhǎng)16 kb，位于染色體17p13.1-pter 6 。多項(xiàng)研究表明， PEDF 是一種天然

6、的高效的新生血管抑制劑 7 ，并通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化起到 抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。 Tombran-Tink 等將 PEDF 基因定位于染色體 1 7p 1 3 . 1 ,腫瘤發(fā)生與該區(qū)域關(guān)系密切， 提示該基因可能是抑癌基因或腫瘤相關(guān)基因 5 。對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行編碼 PEDF 的腺病毒轉(zhuǎn)染，在血管內(nèi)皮 生長(zhǎng)因子( Vascular endothelial growth factor ， VEGF )存在的情況下， PEDF 明顯阻止了血管內(nèi)皮細(xì)胞管 腔形成和遷移。對(duì)患有 CNV/AMD 患者的體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)， PEDF 大量減少的情況下，內(nèi)皮細(xì)胞有明顯 遷移；而對(duì)照組含有正常水平 PEDF,則抑制了

7、內(nèi)皮細(xì)胞的遷移 6。Crawford等發(fā)現(xiàn)PEDF在神經(jīng)母細(xì)胞瘤 中是腫瘤細(xì)胞分化調(diào)控的主要的抗血管生成的抑制劑 7 。肝癌患者血管增生和腫瘤發(fā)展中， PEDF 作為 VEGF 的拮抗因子， 起到了抑制作用。 對(duì)裸小鼠的在體實(shí)驗(yàn)以及鼠的肺癌模型也同樣證明了 PEDF 對(duì)腫瘤 的抑制作用。其機(jī)制乃因 PEDF 減少腫瘤微血管的密度，因而可被用于抑制腫瘤新生血管形成，從而抑 制腫瘤的生長(zhǎng)，在腫瘤的治療前景上非常樂(lè)觀 8。我們最近對(duì) PEDF 在膀胱癌中表達(dá)情況的初步研究發(fā)現(xiàn)， PEDF 在膀胱癌組織中表達(dá)明顯低于正常 膀胱組織，而且 PEDF 表達(dá)情況與膀胱癌的惡性程度以及癌組織中微血管密度呈負(fù)相

8、關(guān)，提示PEDF 在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定的作用， PEDF 的正常表達(dá)可能抑制膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖， PEDF 有 可能成為膀胱癌生物學(xué)治療的一種有效的新方法。目前國(guó)內(nèi)、外尚未見(jiàn)此項(xiàng)研究的相關(guān)報(bào)道。因此我們 設(shè)想，擴(kuò)大樣本量，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)膀胱癌組織及非癌膀胱組織中PEDF 的表達(dá)水平，進(jìn)一步研究 PEDF 在膀胱癌中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床資料分析 PEDF 表達(dá)與膀胱癌分期、分級(jí)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后 的關(guān)系；通過(guò)研究膀胱癌組織中 PEDF 與 VEGF 表達(dá)的相關(guān)性， PEDF 與血小板反應(yīng)素 -1 表達(dá)的相關(guān)性， 探討膀癌組織中 PEDF 表達(dá)與腫瘤血管形成的相關(guān)性及可能的作用機(jī)

9、制；通過(guò)研究PEDF 表達(dá)與金屬蛋白酶-9( MMP-9 )的相關(guān)性，探討 PEDF表達(dá)與膀胱癌浸潤(rùn)的相關(guān)性；通過(guò)研究 PEDF表達(dá)與已知的對(duì) 腫瘤生長(zhǎng)有明確調(diào)節(jié)作用的腫瘤壞死因子a( TNF- a)、白細(xì)胞介素 1 a ( IL-1 a)、血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin )和白介素8 (IL-8 )等細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性，探討PEDF表達(dá)對(duì)膀癌細(xì)胞調(diào)節(jié)的可能機(jī)制，從而探討 PEDF 在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的可能作用機(jī)制；在此基礎(chǔ)上，以連接有PEDF 編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株、以 PEDF 蛋白治療裸鼠膀胱癌模型，進(jìn)一步探討 PEDF 表達(dá)對(duì) 膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

10、以及對(duì)膀胱癌的治療效果 ,為膀胱癌的生物學(xué)治療探索一種有效的新方法。參考文獻(xiàn)吳階平， 吳階平泌尿外科學(xué)，山東科學(xué)技術(shù)出版社，2004.5：898-917二、研究?jī)?nèi)容和技術(shù)關(guān)鍵研究的總體目標(biāo) ：(1) 研究 PEDF 表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級(jí)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，探討 PEDF 表達(dá)在膀胱癌 發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能的作用機(jī)制。(2) 研究 PEDF 對(duì)膀胱癌細(xì)胞的治療效果，為臨床治療膀胱癌的生物治療探索一種新的有效方法 研究的創(chuàng)新點(diǎn)：本課題研究的內(nèi)容和思路不同于以往的其他研究，應(yīng)用分子生物學(xué)方法從研究 PEDF 表達(dá)與膀胱癌的發(fā) 生、分期、分級(jí)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系入手，探討 PEDF 表達(dá)

11、在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中可能的作用機(jī) 制。在此基礎(chǔ)上，以連接有 PEDF 編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株、以 PEDF 蛋白治療裸鼠膀 胱癌模型，探討 PEDF 對(duì)膀胱癌的治療作用。目前，本項(xiàng)研究國(guó)內(nèi)、外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究的順利完成， 將為膀胱癌的生物學(xué)行為的研究開辟了新的途徑，也將為膀胱癌的生物學(xué)治療探索一種新的有效方法。研究的主要內(nèi)容：(1) 膀胱癌組織和非癌膀胱組織中 PEDF 和相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的檢測(cè)及相關(guān)性研究： 應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)研究膀胱癌組織和非癌膀胱組織中 PEDF 表達(dá)狀況，并檢測(cè) VEGF 、TSP-1、MMP-9、TNF-a、IL-1 a、血栓調(diào)節(jié)蛋白(throm

12、bomodulin )和IL-8的表達(dá)狀況；采用免疫組化技術(shù)檢 測(cè)膀胱癌組織和非癌膀胱組織中的微血管密度( microvascular density ，MVD )，分析 PEDF 與 VEGF、TSP-1、MMP-9 、 TNF-a 、 IL-1 a 、血栓調(diào)節(jié)蛋白和 IL-8 表達(dá)的相關(guān)性， PEDF 與 MVD 的相關(guān)性；并結(jié)合臨床 資料分析研究 PEDF 表達(dá)與膀胱癌患者 5 年生存率之間的關(guān)系；闡明 PEDF 表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生、分期、 分級(jí)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，探討 PEDF 表達(dá)在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的可能機(jī)制。以連接有 PEDF 編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株,以空載轉(zhuǎn)染膀胱

13、癌細(xì)胞株作為對(duì)照，觀察檢測(cè) VEGF 、 TNF-a 的表達(dá)情況及膀胱癌細(xì)胞的凋亡、增殖情況。(3) PEDF 對(duì)裸鼠膀胱癌模型的治療：PEDF蛋白(購(gòu)自吉泰生物科技有限以人膀胱癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。以公司)直接注射于裸鼠皮下腫瘤組織內(nèi)作為治療組，以未注射PEDF組為陰性對(duì)照組。觀察各組的MVD、VEGF及腫瘤增殖情況，探討 PEDF表達(dá)在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，評(píng)估PEDF對(duì)膀胱癌的治療效果，為進(jìn)一步過(guò)度到臨床應(yīng)用提供依據(jù)。需要解決的技術(shù)關(guān)鍵：(1) 連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染成功率。(2) PEDF定量檢測(cè)：我們已有對(duì)前列腺癌、腎癌、

14、膀胱癌等組織標(biāo)本的PEDF定量分析的基礎(chǔ)，已形成較成熟技術(shù)條件、設(shè)備和研究經(jīng)驗(yàn)。(3) 膀胱癌裸鼠模型的構(gòu)建。我們已有成功構(gòu)建裸鼠膀胱癌和前列腺癌模型的經(jīng)驗(yàn)。研究方法:方法(1)膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF和相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的檢測(cè)及相關(guān)性研究:實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組膀胱癌組織非癌膀胱組織標(biāo)本A期B期C期D期癌旁膀胱組織正常膀胱組織炎性膀胱組織例數(shù)30303030120120120 .應(yīng)用SYBRGreen I實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR技術(shù),對(duì)膀胱癌、非癌膀胱組織中PEDF進(jìn)行定量測(cè)定。 .Western blot 法檢測(cè) VEGF TSP-1、MMP-9 .ELISA法檢測(cè)T

15、NF- a、IL-1 a、血栓調(diào)節(jié)蛋白、IL-8濃度。 .免疫組化方法檢測(cè)標(biāo)本MVD .整理臨床資料:膀胱癌患者性別、年齡、組織病理、分期、分級(jí)、是否轉(zhuǎn)移、 5 年生存率。 .數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析（使用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件）：PEDF與VEGF表達(dá)的相關(guān)性。PEDF與TSP-1表達(dá)的相關(guān)性PEDF與 MMP-9表達(dá)的相關(guān)性PEDF與 TNF- a、IL-1 a、血栓調(diào)節(jié)蛋白、IL-8濃度的相關(guān)性。PEDF與組織MVD相關(guān)性。PEDF與膀胱癌分期的相關(guān)性。PEDF與膀胱癌惡性程度（分級(jí)）的相關(guān)性。PEDF與膀胱癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。PEDF與膀胱癌5年生存率的相關(guān)性。方法（2）PEDFX寸膀胱癌細(xì)胞株的治療：

16、以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞，以空載轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞作為對(duì)照，檢測(cè)VEGFTNF-a 濃度，觀察細(xì)胞的增殖、凋亡情況，分析相關(guān)性。 . 以RT- PCR法擴(kuò)增PEDF基因。 .將擴(kuò)增后的PEDF基因連接入腺病毒載體，轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞。并以空載轉(zhuǎn)染為對(duì)照。 . Western blot 法檢測(cè) VEGF、TSP-1、MMP-9表達(dá)。 觀察膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡情況。 統(tǒng)計(jì)分析。方法（3） PEDF對(duì)裸鼠膀胱癌模型的治療：以人膀胱癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。以PEDF蛋白直接注射于裸鼠皮下腫瘤內(nèi)作為治療組，以未注射 PEDF為陰性對(duì)照組。觀察兩組膀胱癌組織MVD

17、 VEGF表達(dá)情況、腫瘤增殖情況，評(píng)價(jià)PEDF對(duì)膀胱癌的治療效果。 . 以人膀胱癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下構(gòu)建膀胱癌裸鼠模型。 .將PEDF蛋白注射于裸鼠瘤體內(nèi)。 .應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)MVD應(yīng)用 Western blot 法檢測(cè)VEGF TSP-1、MMP-9觀察腫瘤增殖、凋亡情況。分析PEDF與 VEGF的相互作用關(guān)系及其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)制。技術(shù)路線：(1)膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的檢測(cè)及相關(guān)性研究:RT-PCR 檢測(cè) PEDFmRNA表達(dá)Western blot法檢測(cè)VEGFELISA法檢測(cè)TNF-a、IL-1 a、血栓調(diào)免疫組化方法檢測(cè)標(biāo)本微血管密度結(jié)合臨床資料

18、，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析(2) PEDF對(duì)膀胱癌細(xì)胞株的治療:將PEDF轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株，檢測(cè) VEGF TSP-1、MMP-9 TNF- a濃度，觀察腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡RT PCR法擴(kuò)增PEDF基因0空載休a連接入腺病毒載體a轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株a情況。結(jié)果分析（3）PEDF對(duì)裸鼠膀胱癌模型的治療：觀察PEDF與 VEGF MVD相關(guān)性及其對(duì)膀胱癌細(xì)胞的抑制作用構(gòu)建膀胱癌裸鼠模型未注射（對(duì)照）注射 PEDF蛋白觀察微血VEGF TSP-1、MMP C定 量測(cè)腫瘤凋亡、增殖、侵襲情況結(jié)果分析先后開展了膀胱癌、前列腺癌等的一系列基礎(chǔ)研究（包括分子生物學(xué)研究）和臨床研究，如：裸癌的關(guān)系等，熟練掌握了泌尿生殖系

19、統(tǒng)腫瘤分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究的技術(shù)方法，如RT-PCR、southern、northern雜交、DNA測(cè)序、擁有獨(dú)立的泌尿外科免疫、病理、分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室設(shè)備 完善，技術(shù)方法先進(jìn)，擁有PCR-擴(kuò)增儀、酶標(biāo)儀、各種電泳槽、凝膠成像設(shè)備、細(xì)胞房及各種基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)設(shè)備等,為本課題的順利進(jìn)行提供了有力的技術(shù)和儀器設(shè)備保證。細(xì)胞培養(yǎng)、腺病毒載體構(gòu)建等技術(shù)，積 累了較豐富的研究經(jīng)驗(yàn)。最近我們開展了對(duì)膀胱癌、前列腺癌組織中PDEF表達(dá)的初步研究，掌握了對(duì)腫瘤組織包括膀胱癌組織中PDEF表達(dá)的檢測(cè)方法，對(duì)本課題的順利進(jìn)行提供了便利條件。例如：已完成對(duì)膀胱腫瘤與正常膀胱組織PEDF表達(dá)情況的對(duì)照性研

20、究，初步結(jié)果顯示如下：(1)定量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見(jiàn)：PEDF在正常膀胱組織中高表達(dá)，而在膀胱癌組織中5002301DO5002301ODM N1 N2 N3 T1 T2 T3GAPDH表達(dá)明顯降低(見(jiàn)圖 1)。注：N1，N2，N3 :正常膀胱組織T1，T2，T3 :膀胱癌組織GAPDH :內(nèi)參照M:為標(biāo)記分子量圖1 :正常膀胱組織與膀胱癌組織 PEDF定量PCR(3)在膀胱癌組織中PEDF低表達(dá)與微血管增殖相關(guān)(見(jiàn)圖 2)。 進(jìn)度安排；2011- 6-至 2012-3完成膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF和相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的檢測(cè)及相關(guān)性研究2012- 3 至 2 013-3PEDF對(duì)膀胱癌細(xì)胞株的治療2013- 3 至 2014-6PEDF對(duì)裸鼠膀胱癌模型的治療預(yù)期成果：（1）明確測(cè)定出 PEDF 在膀胱癌中的表達(dá)情況以及其與相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)之間的關(guān)系。（ 2）PEDF 在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。（3）PEDF 對(duì)膀胱癌的治療有效，為最終過(guò)渡到臨床應(yīng)用提供強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。成果以論文的形式表達(dá)，并申請(qǐng)“ PEDF 治療裸鼠膀胱癌模型技術(shù)”的專利；擬發(fā)表論著57 篇，其中國(guó)內(nèi)權(quán)威雜志 45篇， SCI 收錄雜志 2篇。申請(qǐng)成果鑒定。本課題實(shí)施過(guò)程中， 形成一整套的細(xì)胞因子檢測(cè)方法、 膀胱癌細(xì)胞株培養(yǎng)及腺病毒轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞 技術(shù)、裸鼠膀胱