單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)

1、單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序技術(shù)自2009年問(wèn)世，2013年被Nature Methods 評(píng)為年度技術(shù)以來(lái)”越來(lái)越多地被應(yīng)用在科研領(lǐng)域。2015 年以來(lái) z 10X Genomics. Dropseq、Micro-well, Split-seq等技術(shù)的出現(xiàn)，徹底降低了單細(xì)胞測(cè)序的成本門檻。自此，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科硏和臨床研究。單細(xì) 胞在許多領(lǐng)域都占有一席之地，對(duì)于癌癥早期的診斷、追蹤以及個(gè)體 化治療具有重要意義。1為什么要做單細(xì)胞測(cè)序？初次聽(tīng)說(shuō)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，單細(xì)胞測(cè)序又是什么噱頭？如果單細(xì) 胞測(cè)序就能測(cè)一個(gè)細(xì)胞或幾個(gè)細(xì)胞的話，這有什么意義？特別是對(duì)異 質(zhì)性高的腫瘤組織來(lái)講，測(cè)一

2、個(gè)細(xì)胞能代表什么?無(wú)論是蠕蟲(chóng),藍(lán)鯨，還是人類，自然界所有的多細(xì)胞生命都是從 單個(gè)細(xì)胞發(fā)育而來(lái)開(kāi)始。這樣一個(gè)單細(xì)胞，鬼斧神工地構(gòu)建出有機(jī)生命體所需的各種組 織、器官、系統(tǒng)。每個(gè)新細(xì)胞在正確的時(shí)間，在正確的地方分裂、分 化,并與相鄰細(xì)胞協(xié)調(diào)精準(zhǔn)發(fā)揮功能。多細(xì)胞生命的發(fā)育過(guò)程，是自然界中最引人注目的壯舉之一。盡 管經(jīng)過(guò)數(shù)十年的研究，生物學(xué)家仍然無(wú)法完全理解這一過(guò)程。2018年4月26日，Science雜志發(fā)表三篇超重磅研究，來(lái)自 哈佛醫(yī)學(xué)院和哈佛大學(xué)的研究人員使用多種技術(shù)組合，包括對(duì)發(fā)育中斑馬魚(yú)和青蚌胚數(shù)千個(gè)單細(xì)胞的基因測(cè)序，以精確的方式跟蹤和描 繪了組織和整個(gè)機(jī)體從單細(xì)胞發(fā)育的完整歷程。哈佛大學(xué)分

3、子和細(xì)胞生物學(xué)教授Alexander Schier表示，"這 幾乎就像通過(guò)幾顆星星看到了整個(gè)宇宙?！笆褂脝渭?xì)胞測(cè)序技術(shù)，硏究團(tuán)隊(duì)在胚月臺(tái)發(fā)育的最初24小時(shí)內(nèi)追 蹤單個(gè)細(xì)胞的命運(yùn)，揭示出單個(gè)細(xì)胞基因開(kāi)啟或關(guān)閉的綜合景觀，以 及胚細(xì)胞何時(shí)何地轉(zhuǎn)變?yōu)樾碌募?xì)胞狀態(tài)和類型。這些發(fā)現(xiàn)就好比是勾勒出胚發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生不同細(xì)胞類型的 遺傳"配方目錄，為發(fā)育生物學(xué)的深入研究和疾病的認(rèn)識(shí)，提供了 前所未有的資源。圖|斑馬魚(yú)受精卵在4、6、8、10小時(shí)（hpf ）時(shí)的發(fā)育過(guò)程 中不同器官細(xì)胞形成,最中心的深藍(lán)色為受精卵，以時(shí)間為單位向外 輻射。通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序哉們可以在一天的時(shí)間里概括數(shù)十年來(lái)對(duì)細(xì)

4、胞在生命早期階段分化的艱苦研究。”哈佛醫(yī)學(xué)院系統(tǒng)生物學(xué)助理教 授Allon Klein表示，"通過(guò)我們開(kāi)發(fā)的方法，我們正在繪制我們認(rèn) 為發(fā)育生物學(xué)的未來(lái),發(fā)育生物學(xué)將會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槎康摹⒋髷?shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的 科學(xué)?！盇lexander Schier表示,除了對(duì)生命早期階段有所了解之外, 這項(xiàng)工作還可以為大量疾病的新認(rèn)識(shí)打開(kāi)大門?！蔽覀冾A(yù)見(jiàn)，任何復(fù) 雜的生物學(xué)過(guò)程，只要是細(xì)胞隨時(shí)間改變了基因表達(dá)，都可以使用這 種方法重建，不僅僅是發(fā)育中的胚月臺(tái),還有癌癥發(fā)生或大腦退化?！被驹韱渭?xì)胞測(cè)序首先不是僅僅對(duì)一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，而是說(shuō)該項(xiàng)技術(shù) 能對(duì)單一細(xì)胞的基因組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，可以理解為單細(xì)胞水平上

5、的測(cè)序。在介紹基本原理之前先讓我們嘗試著回答一下:為什么要進(jìn)行單 細(xì)胞測(cè)序？換個(gè)姿勢(shì)來(lái)問(wèn)就是，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能解決什么傳統(tǒng)方法 解決不了的問(wèn)題？世界上沒(méi)有兩片相同的葉子，對(duì)于多細(xì)胞生物來(lái)說(shuō)細(xì)胞與細(xì)胞之 間是存在差異的,很多時(shí)候是基因組、轉(zhuǎn)錄組上的失之毫厘，功能上 的差之千里。比如在腫瘤組織中，腫塊中心的細(xì)胞與腫塊周圍的細(xì)胞，原發(fā)灶 與轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞，其基因組與轉(zhuǎn)錄組等遺傳信息是存在差異的,這也 就導(dǎo)致不同腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出免疫持性、生長(zhǎng)速度、侵襲能力等表型方 面的差異，最終導(dǎo)致對(duì)不同抗月中瘤藥物的敏感性不同或放療敏感性的 差異。那么我們?cè)鯓觼?lái)研究這種遺傳信息的異質(zhì)性呢？傳統(tǒng)的測(cè)序方 法是在多細(xì)胞水平

6、上進(jìn)行的,這種大家一起"吃大鍋飯的形式，使 其丟失了異質(zhì)性的信息，而單細(xì)胞測(cè)序可以完美的解決這個(gè)問(wèn)題。給 大家更形象的舉個(gè)例子:Western blot 檢測(cè)這三種樣本雖然存在這么大的差異，但是通過(guò)western blot檢 測(cè)的時(shí)候我們得出的結(jié)論是：該基因在不同組織中的表達(dá)基本一致。 上圖所展示的異質(zhì)性信息就被完全的忽略掉了。和western blot相似的是，傳統(tǒng)測(cè)序方法所展示的信息也是在 多細(xì)胞水平上的平均信息，而單細(xì)胞水平上的測(cè)序則完全可以反應(yīng)同 個(gè)細(xì)胞群里不同細(xì)胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組狀況。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，使得從混雜的樣品中篩選出異質(zhì)性信息 的難題得以解決，該技術(shù)的成熟使用

7、也必將引領(lǐng)生命科學(xué)硏究向前邁 進(jìn)一大步。那么單細(xì)胞測(cè)序又是如何實(shí)現(xiàn)的呢？我們以單細(xì)胞RNA-seq作 為例子，簡(jiǎn)單的來(lái)介紹一下該技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)的原理：,將單細(xì)胞分離出來(lái)，單獨(dú)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，并進(jìn)行測(cè)序。這種 思路通量極低而且成本極高，如前文所說(shuō)燒掉很多錢就測(cè)數(shù)十個(gè)細(xì) 胞,而往往這數(shù)十個(gè)細(xì)胞還不足以反應(yīng)真實(shí)的科學(xué)問(wèn)題。所以我們著 重介紹第二種方案。二，基于標(biāo)簽（barcode ）的單細(xì)胞識(shí)別。它的核心思想是:在 對(duì)每個(gè)細(xì)胞的mRNA測(cè)序前做逆轉(zhuǎn)錄時(shí)，為其加上獨(dú)一無(wú)二的標(biāo)簽 序列。這樣即便是混合起來(lái)測(cè)序，我們也可以把攜帶相同標(biāo)簽序列（barcode ）的RNA片段視為來(lái)自同一個(gè)細(xì)胞。通過(guò)這種策略，我

8、們可以通過(guò)一次建庫(kù)，測(cè)得上萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞的信息（如下圖所示）O3單細(xì)胞測(cè)序帶給大家哪些福利？就拿大家比較關(guān)注的single cell RNA-seq來(lái)說(shuō)吧：、在傳統(tǒng)的硏究方法中，我們往往根據(jù)標(biāo)記基因和細(xì)胞形態(tài)來(lái) 區(qū)分不同細(xì)胞類型，而這種方法無(wú)可厚非的存在很多爭(zhēng)議。而單細(xì)胞 測(cè)序技術(shù)可以更精準(zhǔn)無(wú)偏倚的來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群。尤其是對(duì)免疫學(xué)， 腫瘤學(xué)，遺傳學(xué)的硏究將會(huì)帶來(lái)巨大影響。二、分析稀有的細(xì)胞，特別是特定時(shí)空環(huán)境下的細(xì)胞。比如從環(huán) 境中取樣的微生物等。三、臨床上，對(duì)體外受精胚胎進(jìn)行植入前的篩查。四、基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells )進(jìn)行癌癥診 斷,大力推進(jìn)新型的循環(huán)腫

9、瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)。特別是惡性腫瘤患者治 療前后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞類型和數(shù)量的變化具有重要的預(yù)后提示價(jià)值。五、已經(jīng)通過(guò)傳統(tǒng)的測(cè)序方法進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序，希望以此挖掘數(shù) 據(jù)沖擊重量級(jí)期刊的小伙伴彳門請(qǐng)注意，單細(xì)胞測(cè)序在高分期刊的發(fā)表 已成井噴之勢(shì)，幾年之后技術(shù)必將更加成熟。4單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)助力腫瘤研究l.Cell :以色列研究團(tuán)隊(duì)使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示黑色素瘤腫 瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性和分化途徑。以色列Ido Amit實(shí)驗(yàn)室李漢杰博士等發(fā)現(xiàn)，癌癥中免疫細(xì)胞的 異質(zhì)性對(duì)免疫治療的效果有重要影響，功能失調(diào)的CD8T細(xì)胞在月中 瘤微環(huán)境中處于動(dòng)態(tài)分化和高度活躍的狀態(tài)，而且很可能驅(qū)動(dòng)著腫瘤

10、 特異性免疫應(yīng)答。該團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)25名黑色素瘤患者腫瘤中免疫細(xì)胞,進(jìn)行單細(xì)胞 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和單細(xì)胞TCR測(cè)序分析，繪制黑色素瘤詳盡的免疫細(xì)胞 圖譜。該研究發(fā)現(xiàn)盡管不同免疫細(xì)胞亞型存在于大多數(shù)患者中，但是它 們的相對(duì)豐度在不同患者中存在很大差異。此夕卜/盡管豐度不同，所 觀察到的CD8T細(xì)胞的分化途徑卻是高度保守的。該研究為癌癥中免 疫細(xì)胞的異質(zhì)性對(duì)免疫治療的效果進(jìn)一步提供了理論支撐。2 : Nature , Nature Medicine兩連發(fā)：北京大學(xué)張澤民教授課 題組重磅解析結(jié)直腸癌和肺癌免疫微環(huán)境張澤民教授課題組分別在Nature Medicine和Nature發(fā)布重大研究成果,在單細(xì)胞水平

11、繪制肺癌和結(jié)直腸癌T細(xì)胞免疫圖 譜，揭示了肺癌和結(jié)直腸癌T細(xì)胞的亞群分類、組織分布特征、腫瘤 內(nèi)群體異質(zhì)性及藥物靶基因表達(dá)情況,鑒定了跨組織分布的T細(xì)胞類 群及亞群間潛在的狀態(tài)轉(zhuǎn)換關(guān)系，這對(duì)于肺癌和結(jié)直腸癌的診斷和治 療具有重大意義。該團(tuán)隊(duì)將繼續(xù)用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)和生物信息方法結(jié)合，來(lái)闡明 腫瘤微環(huán)境特別尉中瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的精確組成和功能狀態(tài)，探究腫 瘤內(nèi)部各類細(xì)胞的特異屬性、相互關(guān)系、及動(dòng)態(tài)變化，從而找到新靶 點(diǎn),開(kāi)拓克服腫瘤的新穎方法。3 : Cell :美國(guó)硏究團(tuán)隊(duì)繪制目前規(guī)模最大免疫細(xì)胞圖譜，探索 乳腺癌免疫微環(huán)境美國(guó)Sloan Kettering癌癥中心團(tuán)隊(duì)，使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技 術(shù)

12、，分析了人乳卿中瘤以及配對(duì)的正常乳腺組織，外周血和淋巴結(jié)4 個(gè)組織來(lái)源的共47016個(gè)免疫細(xì)胞的基因表達(dá)特征。揭示腫瘤內(nèi)淋 巴細(xì)胞和髓系細(xì)胞的異質(zhì)性，與正常乳腺組織相比顯著的表型擴(kuò)增。 這種異質(zhì)性通過(guò)各種環(huán)境刺激反應(yīng)引起的組合基因的表達(dá)，且TCR 的特異性參與了 T細(xì)胞組合基因表達(dá)的形成。所觀察到的T細(xì)胞狀態(tài) 的連續(xù)性變化顛覆了之前較少分化或激活離散狀態(tài)形成的腫瘤微環(huán) 境經(jīng)典概念。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析與心臟病Cell Stem Cell :從單細(xì)胞水平描繪了人心肌細(xì)胞重編程過(guò)程中 轉(zhuǎn)錄組隨著細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)化而發(fā)生的改變。該論文由來(lái)自北卡羅來(lái)納大學(xué)(UNC)的心肌細(xì)胞重編程領(lǐng)域 開(kāi)創(chuàng)者之一錢莉教授帶領(lǐng)的

13、硏究團(tuán)隊(duì)發(fā)表。研究人員首先報(bào)道了優(yōu)化 的人心肌細(xì)胞重編程的方法，利用最精簡(jiǎn)的重編程因子達(dá)到了高效的 重編程效果( 50%的轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)心肌細(xì)胞的標(biāo)記分子cTnT )。硏究人員利用單細(xì)胞測(cè)序詳細(xì)描繪了人心肌細(xì)胞重編程過(guò)程中 轉(zhuǎn)錄組的動(dòng)態(tài)變化W細(xì)胞命運(yùn)的二項(xiàng)選擇，即在成纖維細(xì)胞向心肌轉(zhuǎn) 化的早期誘導(dǎo)階段存在一個(gè)”決策點(diǎn)”，決定了細(xì)胞的命運(yùn)能否成功 地被轉(zhuǎn)化。除了描繪整體的重編程圖譜外”通過(guò)深度挖掘單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù) 據(jù)，該研究還為進(jìn)一步了解人心肌細(xì)胞重編程的分子機(jī)制提供了大量 的線索和研究方向。基于重編程響應(yīng)和非響應(yīng)途徑的差異基因比對(duì)， 研究人員還找到了正向和反向的分子標(biāo)記物，將來(lái)可用于篩選和富集 轉(zhuǎn)

14、化的心肌細(xì)胞。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析阿爾茨海默病Nature :單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析阿爾茲海默病來(lái)自美國(guó)麻省理工學(xué)院的研究人員首次對(duì)阿爾茨海默病患者的 單個(gè)腦細(xì)胞中表達(dá)的基因進(jìn)行了綜合分析。所獲得的分析結(jié)果允許他 們鑒定出在神經(jīng)元其他類型的腦細(xì)胞中受到影響的獨(dú)特細(xì)胞通路。 這一分析可能為阿爾茨海默病提供許多潛在的新型藥物靶點(diǎn)。研究人員分析了 24名表現(xiàn)出高水平阿爾茨海默病病理學(xué)特征的 人和24名具有相似年齡的沒(méi)有這些疾病跡象的人的尸檢大腦樣本， 對(duì)來(lái)自這些受試者約8萬(wàn)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序。通過(guò)該測(cè)序 技術(shù)，研究者不僅能夠分析最豐富的細(xì)胞類型，包括興奮性和抑制性 神經(jīng)元，而且還能分析稀有的非神經(jīng)元腦

15、細(xì)胞,如少突膠質(zhì)細(xì)胞、星 形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。硏究發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞類型中的每一種在阿爾茨海默病患者中都表 現(xiàn)出明顯的基因表達(dá)差異。在患有阿爾茨海默病的個(gè)體中，與髓鞘形 成相關(guān)的基因在神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞（產(chǎn)生髓鞘的細(xì)胞）中都受到 影響。單細(xì)胞測(cè)序與糖尿病Nature : Chartingcellular identity during human in vitroP-cell differentiation哈佛大學(xué)干細(xì)胞研究所的Douglas A.Melton團(tuán)隊(duì)，使用單細(xì)胞 測(cè)序的方法，詳細(xì)地分析了誘導(dǎo)方案中細(xì)胞組成和基因表達(dá)動(dòng)態(tài)變 化；并發(fā)現(xiàn)CD49a (ITGA1)是p細(xì)胞的表面標(biāo)記物，可用來(lái)富集p 細(xì)胞伺時(shí)，也為研究體內(nèi)胰腺祖細(xì)胞分化為胰島細(xì)胞過(guò)程提供指導(dǎo)。單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)新的腸道干細(xì)胞Nature : Singlecell tranomes of the regenerating in