實驗植物基因工程簡介ppt課件

1、王歡歡hhwanggucas.a零一二.九.植物基因工程概述20212021全球商業(yè)轉(zhuǎn)基因作物分布圖全球商業(yè)轉(zhuǎn)基因作物分布圖植物基因工程是在分子程度上定向重組遺傳物質(zhì)，改良植物性狀、植物基因工程是在分子程度上定向重組遺傳物質(zhì)，改良植物性狀、培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)作物新種類的分子育種技術(shù)。培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)作物新種類的分子育種技術(shù)。.植物基因表達(dá)載體設(shè)計與構(gòu)建植物基因表達(dá)載體設(shè)計與構(gòu)建堿裂解法小量制備質(zhì)粒堿裂解法小量制備質(zhì)粒農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化煙草及擬南芥農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化煙草及擬南芥GUSGUS染色檢測基因瞬時表達(dá)染色檢測基因瞬時表達(dá)植

2、物組織植物組織DNADNA的提取的提取植物組織植物組織RNARNA的提取的提取DNADNA的的PCRPCR檢測，反轉(zhuǎn)產(chǎn)物檢測，反轉(zhuǎn)產(chǎn)物RT-PCRRT-PCR一一二二三三四四五五六六七七八八.用于攜帶用于攜帶DNA片段進入宿主細(xì)胞進展復(fù)制或保管的載體稱為克隆載體。片段進入宿主細(xì)胞進展復(fù)制或保管的載體稱為克隆載體?？寺】寺≥d體載體復(fù)制復(fù)制基因基因選擇性選擇性標(biāo)志標(biāo)志多克隆多克隆位點位點 TA克隆載體克隆載體.表達(dá)載體是可攜帶外源表達(dá)載體是可攜帶外源DNA片段進入宿主細(xì)胞進展復(fù)制并轉(zhuǎn)錄、翻片段進入宿主細(xì)胞進展復(fù)制并轉(zhuǎn)錄、翻譯的載體。普通在克隆載體的根底上添加了基因表達(dá)的調(diào)控元件。譯的載體。普通在克

3、隆載體的根底上添加了基因表達(dá)的調(diào)控元件。 原核啟動子原核啟動子 終止子終止子 核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點RBS原核表達(dá)原核表達(dá)載體載體 真核啟動子真核啟動子 轉(zhuǎn)錄終止序列轉(zhuǎn)錄終止序列 不同的復(fù)制子不同的復(fù)制子真核表達(dá)真核表達(dá)載體載體u 很多真核基因在原核中表達(dá)時難以獲得有活性的蛋白質(zhì)很多真核基因在原核中表達(dá)時難以獲得有活性的蛋白質(zhì)-真核真核表達(dá)載體表達(dá)載體酵母表達(dá)載體酵母表達(dá)載體噬菌體載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體穿越載體穿越載體pET載體系列載體系列.實驗一實驗一 植物基因表達(dá)載體設(shè)計與構(gòu)建植物基因表達(dá)載體設(shè)計與構(gòu)建植物表達(dá)載體根底元件植物表達(dá)載體根底元件啟動子啟動子終止子終止子目

4、的基因目的基因標(biāo)志基因標(biāo)志基因.植物表達(dá)載體：植物表達(dá)載體：pGreen 系列：系列：pGreen0029，pSouppCAMBIA系列：系列： 1300, 1301, 1302,1303,1304,1305, 2300, 2301,pCAMBIA super1300, pCAMBIA super1300-GFP,pPZP212, pPZP2121, pPZP212-GFPpBI121，pBI121-GFP, pBI101，221pRTL2 , pRTL2-GFP , pRTL2-RFP , pRTL2-YFP等等等等干擾載體：干擾載體：pART27農(nóng)桿菌菌株：農(nóng)桿菌菌株：LBA4404,EH

5、A103,105,GV3101.設(shè)計引物設(shè)計引物PCRPCR擴增目擴增目的基因的基因DNADNA測序驗測序驗證證酶切酶切銜接表達(dá)銜接表達(dá)載體載體轉(zhuǎn)化植物轉(zhuǎn)化植物抗生素挑抗生素挑選選轉(zhuǎn)基因植轉(zhuǎn)基因植物物.根據(jù)表達(dá)載體的多克隆位點來設(shè)計引物，酶切位點外加維護堿基根據(jù)表達(dá)載體的多克隆位點來設(shè)計引物，酶切位點外加維護堿基引物長度大于引物長度大于16bp,普通為普通為20-24個核苷酸個核苷酸 引物與靶序列間的引物與靶序列間的Tm值不應(yīng)過低值不應(yīng)過低 引物不應(yīng)有發(fā)夾構(gòu)造。即不能有引物不應(yīng)有發(fā)夾構(gòu)造。即不能有4bp以上的回文序列以上的回文序列 兩引物間不應(yīng)有大于兩引物間不應(yīng)有大于4pb以上的互補序列或同源

6、序列，在以上的互補序列或同源序列，在3端不應(yīng)有任何端不應(yīng)有任何互補堿基互補堿基 引物中堿基的分布盡能夠均勻，引物中堿基的分布盡能夠均勻，G+C含量接近含量接近50%Primer L：ACGCCATGGCGCAATCTGTTCCTTAT Nco IPrimer R: CGGTCGACTTATTGTGCAGCTGCTTG Sal IMinimum free energy of the structure= -1.35 kcal/molA GTTGATAAAGCGGTTTCCAGCGGMinimum free energy of the structure= 0.00 kcal/molC GCAAT

7、CTGTTCCTTATGG.核酸內(nèi)切限制酶，可以識別雙鏈核酸內(nèi)切限制酶，可以識別雙鏈DNADNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割切割DNADNA雙鏈構(gòu)造的核酸內(nèi)切酶。不同酶的識別位點不同雙鏈構(gòu)造的核酸內(nèi)切酶。不同酶的識別位點不同酶切位點：酶切位點：DNADNA上一段堿基的特定序列，限制性內(nèi)切酶可以識別出這個序列上一段堿基的特定序列，限制性內(nèi)切酶可以識別出這個序列并在此將并在此將DNADNA序列切成兩段。序列切成兩段。限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀DNADNA銜接酶銜接酶 分子縫合針分子縫合針基因的載體基因的載體 分子運輸車分子運輸車基因工

8、程基因工程=DNA=DNA重組重組BamHIBamHI同尾酶同尾酶: :產(chǎn)生一樣的粘性末端產(chǎn)生一樣的粘性末端常用限制性內(nèi)切酶：常用限制性內(nèi)切酶：TakaraTakara，NEBNEB等等HindIIIHindIIIBglIIBglII.u 瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的的DNA片段，片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分別范圍廣。其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分別范圍廣。u 對于較大片段的對于較大片段的DNA，那么要用低濃度的瓊脂糖凝膠。，那么要用低濃度的瓊脂糖凝膠。u DNA分子在高

9、于等電點的分子在高于等電點的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極挪動。溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極挪動。u 在一定的電場強度下，在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同相對分子質(zhì)量的子本身的大小和構(gòu)型。具有不同相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣：片段泳動速度不一樣：分子越小，遷移越快；分子越大，遷移越慢，遷移速率與相對分子質(zhì)量的分子越小，遷移越快；分子越大，遷移越慢，遷移速率與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。對數(shù)值成反比關(guān)系。Marker 2000.Enzyme1：1 LEnzyme2：1 LBuf

10、fer：2 LTemplate：X LddH2O: 補齊至補齊至20 L37水浴水浴2 h活性單位活性單位U U：在：在50 l50 l反響液中，反響液中，3030溫度下反響溫度下反響1 1小時，將小時，將1 g1 g的的DNADNA完全分解的酶量定義為完全分解的酶量定義為1 1個活性單位個活性單位(U)(U)單酶切單酶切雙酶切雙酶切.1. DNA的純度，蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、的純度，蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS、鹽離子、鹽離子等都會影響活性等都會影響活性2. DNA的甲基化程度，核酸內(nèi)切限制酶不可以切割甲基化的核苷酸的甲基化程度，核酸內(nèi)切限制酶不可以切割甲基化的核苷酸序列序列3. 酶切反響溫度，不同內(nèi)切酶具有不同的最適反響溫度，酶切反響溫度，不同內(nèi)切酶具有不同的最適反響溫度，4. DNA的分子構(gòu)造，超螺旋和線性的分子構(gòu)造，超螺旋和線性5. 緩沖液的影響，緩沖液的影響，Mg2+的濃度，甘油濃度的濃度，甘油濃度本卷須知：本卷須知：1.盡量運用同品牌的酶盡量運用同品牌的酶