NorthernBlot試驗(yàn)方法步驟

1、Northern Blot 實(shí)驗(yàn)方法步驟實(shí)驗(yàn)原理在變性條件下將待檢的RNA羊品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測。用途：檢測樣品中是否含有基因 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA及其含量。實(shí)驗(yàn)試劑1. NorthernMax Kit(Cat.# 1940,Ambion, Inc.)2. 瓊脂糖3. DEPC4. X光底片5. 底片暗盒6. Random Primer7. dNTP Mixture8. 111 TBq/mmola-32PdCTP9. Exo-free Klenow Fragment 和 10 X Buffer10. Sephadex

2、G-5011. SDS12. 雙氧水，滅菌水等實(shí)驗(yàn)設(shè)備1 .恒溫水浴箱2 .電泳儀3 .凝膠成像系統(tǒng)4 .真空轉(zhuǎn)移儀5 .真空泵6 . UV交聯(lián)儀7 .雜交爐8 .恒溫?fù)u床9 .脫色搖床10 .漩渦振蕩器11 .分光光度計(jì)12 .微量移液器13 .電爐(或微波爐)14 .離心管，燒杯，量筒，三角瓶等實(shí)驗(yàn)材料總RNA羊品或mRN將品，探針模板DNA(25 ng),尼龍膜實(shí)驗(yàn)步驟1 .用具的準(zhǔn)備：180度烤器皿：三角錐瓶、量筒、銀子、刀片等 4小時(shí)。電泳槽：清洗梳子和電泳槽,并用雙氧水浸泡過夜,用DEPOK沖洗,干燥備用。處理DEPOK （2 L）備用。2 .用RNAZa去除用具表面的 RNas麗

3、污染用RNAZapg洗梳子，電泳槽，刀片等，然后用DEPOK沖洗二次，去除RNAZap3 .制膠1）稱取0.36mg瓊脂糖加入三角錐瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波爐加熱 至瓊脂糖完全熔解。60c空氣浴平衡溶液（需加DEPCK補(bǔ)充蒸發(fā)的水分）。2）在通風(fēng)廚中加入 3.6ml的10*Denaturing Gel buffer,輕輕振蕩混勻。注意盡量避免產(chǎn)生氣泡。3）將熔膠倒入制膠板中，插上梳子。如果膠溶液上存在氣泡，可以用熱的玻璃棒或其它方法去除，或?qū)馀萃频侥z 的邊緣。注：膠的厚度不能超過0.5cm。4）膠在室溫下完全凝固后，將膠轉(zhuǎn)移到電泳槽中，力口入1x MOPS Gel Runni

4、ng buffer 蓋過膠面約 1cm,小心拔出梳子。（配制 250ml1*MOPS Gel Running buffer, 在電泳過程中補(bǔ)充蒸發(fā)的buffer o ）5）檢查點(diǎn)樣孔。4 . RNA樣品的制備在RNA羊品中加入3倍體積的formaldehyde load dye 和適當(dāng)?shù)腅B（終濃度 為10ug/ml）?；靹蚝?65 C空氣浴15min。短暫低速離心后，立即放置于冰上 5min。5 .電泳：1）將RNA羊品小心力口至U點(diǎn)樣孑L中。2）在5V/cm下跑膠（5x14cm）。在電泳過程中，每隔30min短暫停止電泳，取出 膠，混勻兩極的電泳液后繼續(xù)電泳。當(dāng)膠中的澳紛藍(lán) （500bp）

5、接近膠的邊緣時(shí)終止電 泳。3）紫外燈下，檢驗(yàn)電泳情況，并用尺子測量18S、28S、澳紛藍(lán)到點(diǎn)樣孔的距 離。注意不要讓膠在紫外燈下曝光太長時(shí)間。6 .轉(zhuǎn)膜1）用3%（氧水浸泡真空轉(zhuǎn)移儀后，用DEPO沖洗。2）用RNAZapS洗多孔滲水屏和塑膠屏，用DEPOK沖洗二次。3）連接真空泵和真空轉(zhuǎn)移儀，剪取一塊適當(dāng)大小的膜（膜的四邊緣應(yīng)大于塑膠 屏孔口的5mm）膜在Transfer buffer 浸濕5分鐘后，放置在多孔滲水屏的適當(dāng)位 置。4）蓋上塑膠屏，蓋上外框，扣上鎖。5）將膠的多余部分切除，切后的膠四邊緣要能蓋過塑膠屏孔，并至少蓋過邊緣 約2mm以防止漏氣。6）將膠小心放置在膜的上面，膜與膠之間不

6、能有氣泡。7）打開真空泵，使壓強(qiáng)維持在5058mbar;立即將transfer buffer加到膠面和四周。每隔10min在膠面加上1ml transfer buffer,真空轉(zhuǎn)移2小時(shí)。8）轉(zhuǎn)膜后，用銀子夾住膜,于1x MOPS Gel Running buffer 中輕輕泡洗10秒, 去除殘余的膠和鹽。9）用吸水紙吸取膜上多余的液體后，將膜置于UV交聯(lián)儀中自動(dòng)交聯(lián)。10）將膠和紫外交聯(lián)后的膜,在紫外燈下檢測轉(zhuǎn)移效率。（避免太長的紫外曝 光時(shí)間）12）將膜在-20c保存。7 .探針的制備1）在1.5ml離心管中配制以下反應(yīng)液：模板 DNA（25 ng） 1ulRandom Primer 2u

7、l滅菌水11ul總體積:14ul2） 95 0 C加熱3分鐘后，迅速放置于冰冷卻5min。3）在離心管中按下列順序加入以下溶液：10X Buffer 2.5uldNTP Mixture 2.5ul111 TBq/mmola-32PdCTP 5 ulExo-free Klenow Fragment 1 ul4)混勻后(25ul),37 °C下反應(yīng)30分鐘。短暫離心，收集溶液到管底。5) 65 ° C加熱5min使酶失活。8.探針的純化及比活性測定：1)準(zhǔn)備凝膠：將1g凝膠加入30ml的DEPCK中，浸泡過夜。用DEPCK洗滌膨 脹的凝膠數(shù)次，以除去可溶解的葡聚糖。換用新配制的

8、TE(PH7.6)。2)取1ml 一次性注射器，去除內(nèi)芯推桿,將注射器底部用硅化的玻璃纖維塞住 在注射器中裝填Sephadex G-50凝膠。3)將注射器放入一支15ml離心管中，注射器把手架在離心管口上。1600g離 心4分鐘，凝膠壓緊后，補(bǔ)加Sephadex G-50凝膠懸液，重復(fù)此步直至凝膠柱高度達(dá) 注射器0.9ml刻度處。4) 100ul STE 緩沖液洗柱,1600g離心4min。重復(fù)3次。5)倒掉離心管中的溶液后，將一去蓋的1.5ml離心管置于管中，再將裝填了 Sephadex G-50凝膠的注射器插入離心管中，注射器口對準(zhǔn)1.5ml離心管。6)將標(biāo)記的DNA羊品加入25 ul S

9、TE,取出0.5ul點(diǎn)樣于DE8paper上，其余 上樣于層析柱上。7 ） 1600g離心4min,DNA將流出被收集在去蓋的離心管中,而未摻入DNA勺 dNTP則保留在層析柱中。取0.5ul己純化的探針點(diǎn)樣于DE8-paper。8）測比活性（試劑比活要求：106cpm/ml）。9 .預(yù)雜交：1）將預(yù)雜交液在雜交爐中68c預(yù)熱，并漩渦使未溶解的物質(zhì)溶解。2）加入適當(dāng)?shù)腢LRAhy倒雜交管中（以100cm頌面積加入10mlULRAhybfe交 液）,42 C預(yù)雜交4 hr。10 .探針變性：1）用10 mM EDTA等探針稀釋10倍。2） 90 C熱處理稀釋后探針10min后，立即放置于冰上5m

10、in。3）短暫離心，將溶液收集到管底。11 .雜交：1）加入0.5ml ULTRAhyb到變性的探針中，混勻后，將探針加到預(yù)雜交液中。2） 42 C雜交過夜（1424hr）。雜交完后，將雜交液收集起來于-20C保存。12 .洗膜：1）低嚴(yán)緊性洗膜：加入 Low Stringency Wash Solution#1 （100cm2膜面積加 入20ml洗膜溶液）,室溫下，搖動(dòng)洗膜5min兩次2）高嚴(yán)緊性洗膜：加入 High Stringency Wash Solution#2 （100cm2 膜面積 加入20ml洗膜溶液）,42 C搖動(dòng)洗膜20min兩次。13 .曝光：1）將膜從洗膜液中取出，用保鮮膜包住，以防止膜干燥。2）檢查膜上放射性強(qiáng)度，估計(jì)曝光時(shí)間3）將X光底片覆蓋與膜上，曝光4）沖洗X光底片，掃描記錄結(jié)果。14 .去除膜上的