圓二色譜CD原理教學資料

1、圓二色譜CD原理光學活性分子對光學活性分子對左、右圓偏光左、右圓偏光的吸收率的差值的吸收率的差值 （1）高亮度的點光源；）高亮度的點光源； （2）日光色日光色。色溫接近。色溫接近6000K；（3）在可見光區(qū)連續(xù)光譜在可見光區(qū)連續(xù)光譜；（4）高顯色性，顯色指數(shù)）高顯色性，顯色指數(shù)95；（5）在整個壽命期內(nèi)維持光色特性；）在整個壽命期內(nèi)維持光色特性；（6）高電弧穩(wěn)定性；）高電弧穩(wěn)定性；（7）熱重啟能力熱重啟能力；（8）啟動后即能達到接近最大光輸出啟動后即能達到接近最大光輸出；（9）電弧光斑小、易聚光。）電弧光斑小、易聚光。超高壓短弧超高壓短弧氙燈氙燈: 在高壓純凈氙氣中放電發(fā)光。在高壓純凈氙氣中放

2、電發(fā)光。自然光自然光雙折射現(xiàn)象雙折射現(xiàn)象： 一束光射入一束光射入各向異性晶體各向異性晶體后有兩束折射光。后有兩束折射光。 尼科耳棱鏡。尼科耳棱鏡。 2、光的偏振、光的偏振 在生物樣品中，肌肉纖維、骨骼和牙齒等具有各在生物樣品中，肌肉纖維、骨骼和牙齒等具有各向異性，淀粉粒、染色體和紡錘體等具有雙折射性，向異性，淀粉粒、染色體和紡錘體等具有雙折射性，因此被用于組織細胞的化學研究。因此被用于組織細胞的化學研究。名稱名稱折射定律折射定律折射率折射率傳播方向傳播方向?qū)こ９鈱こ９猓╫光光）遵守遵守對于晶體一切方向都對于晶體一切方向都具有相同的折射率具有相同的折射率在入射面內(nèi)在入射面內(nèi)非常光非常光（e光光）

3、不遵守不遵守折射率隨方向而變化折射率隨方向而變化不一定在入射面不一定在入射面內(nèi)內(nèi)o o光和光和e e光：頻率相同、振動方向相互垂直、光：頻率相同、振動方向相互垂直、平面偏振光平面偏振光自然光入射到某些晶體（電氣石、硫酸金雞鈉堿晶體等）時，自然光入射到某些晶體（電氣石、硫酸金雞鈉堿晶體等）時，晶片吸晶片吸收振動面與晶軸垂直的光收振動面與晶軸垂直的光，而只允許振動面平行于晶軸的光通過。，而只允許振動面平行于晶軸的光通過。自然光自然光平面偏振光平面偏振光起偏器起偏器檢偏器檢偏器晶軸晶軸相互平行相互平行時，時，透射光強度透射光強度最大最大；晶軸晶軸相互垂直相互垂直時，時，透射光強度透射光強度為零為零；

4、晶軸晶軸夾角為夾角為時，時，透射光強度透射光強度與與coscos2 2成正比成正比。. . . . .也稱線（完全）偏振光，簡稱偏振光。也稱線（完全）偏振光，簡稱偏振光。它的振動面稱為其偏振面。它的振動面稱為其偏振面。振動方向保持不變振動方向保持不變振幅發(fā)生周期性變化振幅發(fā)生周期性變化E E之端點在空間的軌跡為一平面正弦曲線之端點在空間的軌跡為一平面正弦曲線投影到垂直于光傳播方向的平面上為一直線段投影到垂直于光傳播方向的平面上為一直線段3 3、平面偏振光（、平面偏振光（Plane polarized light）4、布儒斯特角、布儒斯特角當入射光射到兩種介質(zhì)界面上時，反射光和折射光的偏振情況與

5、入當入射光射到兩種介質(zhì)界面上時，反射光和折射光的偏振情況與入射光不同。射光不同。5 5、四分之一波片、四分之一波片l使使o o光和光和e e光的光程相差光的光程相差1/41/4波長的晶片。此時，相位差為波長的晶片。此時，相位差為/2/2，透射的合成光是長軸與晶軸重疊的透射的合成光是長軸與晶軸重疊的正橢圓偏振光正橢圓偏振光。朝光源看，朝光源看， 電場矢量方向按電場矢量方向按順時針順時針方向旋轉(zhuǎn)的，稱為方向旋轉(zhuǎn)的，稱為右圓偏振光右圓偏振光； 電場矢量方向按電場矢量方向按逆時針逆時針方向旋轉(zhuǎn)的，稱為方向旋轉(zhuǎn)的，稱為左圓偏振光左圓偏振光。l若入射平面偏振光的電矢量與晶體晶軸的夾角若入射平面偏振光的電矢

6、量與晶體晶軸的夾角4545，則則Eo Eo = = EeEe，合成光是合成光是圓偏振光圓偏振光（Circular polarized light）。6、光的疊加、光的疊加一束一束自然光自然光可以看作是兩束相互垂直而沒可以看作是兩束相互垂直而沒有相位關(guān)系的有相位關(guān)系的平面偏振光平面偏振光的加和。的加和。旋轉(zhuǎn)方向相反的旋轉(zhuǎn)方向相反的左、右圓偏光左、右圓偏光透過一光學透過一光學活性物質(zhì)后活性物質(zhì)后透過的左、右圓偏光透過的左、右圓偏光振幅振幅相位相位矢量和矢量和相等相等相同相同平面偏振光平面偏振光相等相等不同不同平面偏振光，方向改變平面偏振光，方向改變不等不等相同相同橢圓偏振光橢圓偏振光不等不等不同不

7、同橢圓偏振光，方向改變橢圓偏振光，方向改變振幅相等、振動方向相互垂直、相位相差振幅相等、振動方向相互垂直、相位相差1/4波長波長的的兩平面偏振光合成圓偏振光兩平面偏振光合成圓偏振光右旋右旋7、旋光色散（、旋光色散（Optical rotatory dispersion，ORD）l旋光性旋光性：光學活性分子對左、右圓偏光的光學活性分子對左、右圓偏光的折射率折射率不同，透射光雖然仍不同，透射光雖然仍然為平面偏振光，但其偏振面旋轉(zhuǎn)了一定的角度。然為平面偏振光，但其偏振面旋轉(zhuǎn)了一定的角度。 l旋光物質(zhì)又稱為光學活性物質(zhì)旋光物質(zhì)又稱為光學活性物質(zhì)。l旋光度旋光度：偏振面旋轉(zhuǎn)的角度：偏振面旋轉(zhuǎn)的角度l 旋

8、光色散旋光色散：不同波長的偏振光的旋轉(zhuǎn)角度不同。：不同波長的偏振光的旋轉(zhuǎn)角度不同。l 旋光儀是測量旋光性與波長的函數(shù)關(guān)系，從而得到一個旋光色散譜。旋光儀是測量旋光性與波長的函數(shù)關(guān)系，從而得到一個旋光色散譜。圓雙折射圓雙折射：某個物質(zhì)對于左、右圓偏光的折射率分別為：某個物質(zhì)對于左、右圓偏光的折射率分別為nL和和nR， 若若 nL = nR，則為光學各向同性物質(zhì)；則為光學各向同性物質(zhì)； 若若 nL nR，則為光學各向異性物質(zhì)；左、右圓偏光的相位改變，則為光學各向異性物質(zhì)；左、右圓偏光的相位改變， 若若nLnR，透射光的偏振面右旋。透射光的偏振面右旋。 若若nLnR，透射光的偏振面左旋。透射光的偏振

9、面左旋。l旋光現(xiàn)象是圓雙折射的一種特殊形式。旋光現(xiàn)象是圓雙折射的一種特殊形式。l旋光物質(zhì)使左、右圓偏振光的速度不同，即其色散大小的折射率不同，旋光物質(zhì)使左、右圓偏振光的速度不同，即其色散大小的折射率不同，l旋光現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于光學各向異性物質(zhì)的折射率旋光現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于光學各向異性物質(zhì)的折射率nLnR的結(jié)果。的結(jié)果。化合物在正常情況下，處于低能的基態(tài)，化合物在正常情況下，處于低能的基態(tài)，電子占據(jù)所有的成鍵軌道（電子占據(jù)所有的成鍵軌道（、n n軌軌道）。如果電子吸收了外界的能量，它就道）。如果電子吸收了外界的能量，它就從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)能級。從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)能級。如果所有的躍遷僅在基態(tài)的最低振

10、動能級如果所有的躍遷僅在基態(tài)的最低振動能級和第一激發(fā)態(tài)之間，吸收光譜將是很狹窄和第一激發(fā)態(tài)之間，吸收光譜將是很狹窄而不連續(xù)的譜線。而不連續(xù)的譜線。由于分子的由于分子的價電子躍遷總伴隨著振動和轉(zhuǎn)價電子躍遷總伴隨著振動和轉(zhuǎn)動能級的躍遷動能級的躍遷，所以，紫外分光光度計測，所以，紫外分光光度計測定物質(zhì)的吸收光譜，雖然有一最大吸收峰定物質(zhì)的吸收光譜，雖然有一最大吸收峰值，但都是具有一定波長寬度并相對平滑值，但都是具有一定波長寬度并相對平滑的曲線。的曲線。8、光的吸收和圓二色性光的吸收和圓二色性（circular dichroism, CD）若溶液中的溶質(zhì)對某一波長的入射光有吸收，則透射光的若溶液中的溶

11、質(zhì)對某一波長的入射光有吸收，則透射光的光強度小于入射光。光強度小于入射光。 圓二色性的存在將通過該物質(zhì)傳播的圓二色性的存在將通過該物質(zhì)傳播的左、右圓偏光左、右圓偏光變成變成橢橢圓偏振光圓偏振光。并且只在發(fā)生吸收的波長處才能觀察到。并且只在發(fā)生吸收的波長處才能觀察到。理論計算的圓二色性與該橢圓偏振光的摩爾橢圓率的關(guān)系：理論計算的圓二色性與該橢圓偏振光的摩爾橢圓率的關(guān)系： = 100/（c l） = 3300（ L-R）：介質(zhì)對圓偏振光的摩爾消光系數(shù)，介質(zhì)對圓偏振光的摩爾消光系數(shù)， c ：樣品摩爾濃度，：樣品摩爾濃度， l ：樣品厚度（：樣品厚度（cm ），）， 單位：單位：/（mol cm） 或

12、或 cm2/dmol。圓二色性的表示圓二色性的表示吸收（率）差吸收（率）差 = L - R A = AL AR 橢圓度橢圓度 ，摩爾，摩爾橢圓度橢圓度 = 2.303（AL AR）/4 = 3298（ L - R） 3300 （ L - R） 在蛋白質(zhì)研究中，常用在蛋白質(zhì)研究中，常用平均殘基摩爾平均殘基摩爾橢圓度橢圓度9、ORD與與CD光譜光譜同時產(chǎn)生，同時產(chǎn)生，包括同樣的分子結(jié)構(gòu)信息：光學活性物質(zhì)分包括同樣的分子結(jié)構(gòu)信息：光學活性物質(zhì)分子中的不對稱生色團。子中的不對稱生色團。CD反映光與分子間能量的交換，反映光與分子間能量的交換，旋光性旋光性則則是與分子中電子的運動有關(guān)。是與分子中電子的運動

13、有關(guān)?？梢杂煽梢杂蒏ronig-Krammers轉(zhuǎn)換方程相互轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換方程相互轉(zhuǎn)換。換。CD譜的極值處與吸收峰一致（科譜的極值處與吸收峰一致（科頓效應，頓效應，cotton effect），），因而因而分子中不同生色團對于譜的貢獻分子中不同生色團對于譜的貢獻比在比在ORD中更容易分辨。中更容易分辨。ORD是漸近線，兩端不回歸是漸近線，兩端不回歸ORDCD吸收帶附近，旋光度由負到正吸收帶附近，旋光度由負到正正正Cotton效應效應正正CD帶帶吸收帶附近，旋光度由正到負吸收帶附近，旋光度由正到負負負Cotton效應效應負負CD帶帶CDCD比比ORDORD容易辨別重疊峰容易辨別重疊峰CDCD比比ORDO

14、RD弱帶易檢測弱帶易檢測CDCD比比ORDORD更容易擬合更容易擬合CDCD比比ORDORD提供較多意義明確的信息提供較多意義明確的信息表明有三個生色團，其中兩個有光學活性表明有三個生色團，其中兩個有光學活性primary structure, secondary structuretertiary structureAlpha-helix,beta-sheet肽鏈骨架的構(gòu)象變化肽鏈骨架的構(gòu)象變化蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜主要有兩個峰：蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜主要有兩個峰：190-250nm：肽鍵肽鍵280-290nm：酪氨酸酪氨酸t(yī)yr，色氨酸色氨酸t(yī)rp10、 J-810圓二色光譜儀圓二色光譜儀C

15、CD DM ME E- -r ra ay yS SH HS1M0LSM1M2M3P1M4M5P2S3 L FS2PMO O- -r ra ay yS1-S2:S1-S2:第一級單色器；第一級單色器；S2-S3:S2-S3:第二級單色器第二級單色器; ;M M：球面反光鏡；球面反光鏡；P P：晶體石英棱鏡；晶體石英棱鏡；L:L:透鏡；透鏡；F:F:濾光器；濾光器；由由CDMCDM交互形成的左、右旋圓偏光通過光學活性物質(zhì)，交互形成的左、右旋圓偏光通過光學活性物質(zhì)，透射光強度隨時間的變化透射光強度隨時間的變化當調(diào)制電壓過其峰值（正和負）時，當調(diào)制電壓過其峰值（正和負）時，RL時，透過的時，透過的右旋

16、右旋圓偏光的光強對應于圓偏光的光強對應于最大值最大值，而左旋最?。▽嵕€）；，而左旋最小（實線）；RL時，透過的時，透過的左旋左旋圓偏光的光強對應于圓偏光的光強對應于最大值最大值，而右旋最?。ㄌ摼€）。，而右旋最?。ㄌ摼€）。PMT的輸出信號由正比于的輸出信號由正比于IA的直流分量和正比于的直流分量和正比于S的交流分量所組成。的交流分量所組成。直流成分直流成分IA=（IL+IR）/2交流成分交流成分S相相當于圓二色性當于圓二色性透射光強的變化頻率與外加調(diào)制電壓的頻率相同。透射光強的變化頻率與外加調(diào)制電壓的頻率相同。圓二色光譜儀工作原理圓二色光譜儀工作原理 用相同強度，相同頻率的左、右旋圓偏光交替照射

17、用相同強度，相同頻率的左、右旋圓偏光交替照射樣品測得樣品測得透過樣品后的強度透過樣品后的強度IR和和IL 由于由于IR和和IL十分接近，令十分接近，令I(lǐng)A=（IL+IR）/2，S= IR IL 只放大相應于只放大相應于S的的PMT輸出電壓輸出電壓Es（交流信號）交流信號），而不放而不放大相應大相應IA的輸出電壓的輸出電壓EA。（。（適當選取放大倍數(shù)適當選取放大倍數(shù)G值，使值，使ESG與與EA可比）?？杀龋?。Peltier Cell HolderCD/Total FluorescenceFMOStopped Flow-20200 The peptide bond is inherently as

18、ymmetric and is always optically active蛋白質(zhì)的光學活性蛋白質(zhì)的光學活性1、氨基酸的圓二色性、氨基酸的圓二色性 可見光區(qū)可見光區(qū)：各種氨基酸都沒有光吸收。：各種氨基酸都沒有光吸收。 紫外光區(qū)紫外光區(qū)：只有芳香族：只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸酸有吸收。有吸收。 氨基酸分子內(nèi)的氨基酸分子內(nèi)的紫外生色基團紫外生色基團：吲哚基、酚羥基、吲哚基、酚羥基、苯基、二硫鍵、咪唑基和羧基等。苯基、二硫鍵、咪唑基和羧基等。2、肽的圓二色譜、肽的圓二色譜 活性肽構(gòu)象與其生理功能的關(guān)系活性肽構(gòu)象與其生理功能的關(guān)系 肽的構(gòu)象也是蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種模型。肽的

19、構(gòu)象也是蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種模型。 肽的圓二色性為研究肽在溶液中的構(gòu)象提供了重要信息。肽的圓二色性為研究肽在溶液中的構(gòu)象提供了重要信息。Far-UV (250-170nm) Secondary Structure: -helix, -sheet, -turn, random Tertiary Structure Class: all-, +, /, all-I, all-IINear-UV (320-250nm)： aromatic side chainNear-UV Near-infrared (300-1000nm)： colored proteins苯丙氨酸（苯丙氨酸（ phenylalan

20、ine， Phe）：255、261和和268nm附近；附近；酪氨酸（酪氨酸（ tyrosine， Tyr） ：277nm左右；左右；色氨酸（色氨酸（ tryptophan， Trp） ： 279、284和和291nm附近；附近；二硫鍵的變化反映在整個近紫外區(qū)。二硫鍵的變化反映在整個近紫外區(qū)。 芳香氨基酸殘基芳香氨基酸殘基及及二硫鍵二硫鍵處于不對稱微環(huán)境時，處于不對稱微環(huán)境時，在在近紫外區(qū)近紫外區(qū)表現(xiàn)出表現(xiàn)出CD信號信號Far UV CD spectra of poly-L-Lys1、100% -螺旋螺旋2、100% -折疊折疊3、100%無規(guī)卷曲無規(guī)卷曲- band (nm)+ band (n

21、m)-helix 222208192-sheet216195-turn220-230 (weak)180-190 (strong)205polypro II helix190210-230 weakRandom coil200212Main CD features of protein 2ndary structures 3 3、估算蛋白質(zhì)、估算蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)含量含量僅適合僅適合 含量較高的蛋白質(zhì)！含量較高的蛋白質(zhì)！將測得的將測得的CDCD曲線與標準曲線擬合。曲線與標準曲線擬合。x + xb b + xc = 1.0 t = x + xb b b b + xc c改變改變x、xb和和x

22、c，使使t與樣本曲線最佳擬合（最小二乘法，與樣本曲線最佳擬合（最小二乘法，least squares minimization ）未知結(jié)構(gòu)的蛋白的未知結(jié)構(gòu)的蛋白的CDCD信號信號myoglobin t = x + xb b b b + xc cfits best with x = 80% xb = 0%xc = 20% agrees well with structure 78% helix, 22% coilFor further details: /cd/cdtutorial.htmGCN4-p1 0oC：100% helix75oC：0% he

23、lixwhat about 50oC? t = xoo + x7575fits best with xo = 50% x75= 50%Shows that at 50oC1/2 of peptide -helix dimer1/2 of peptide random coil monomerCD signals for GCN4-p1OShea et al. Science (1989) 243:538figure 3: 34M GCN4-p1 in 0.15M NaCl, 10mM phosphate pH 7.0wavelength in nm19020021022023024025026

24、0 in 1000 deg cm2dmol-1-40-30-20-10010203040506070800 OC50 OC75 OCfit to GCN4-p1 50OC datawavelength in nm200210220230240250MRE in 1000 degs cm2mol-1-25-20-15-10-50510original databest fit with mix of 0OC and 75OC spectra Lau, Taneja and Hodges (1984) J.Biol.Chem. 259:13253-13261螺旋二聚體分解為單螺旋螺旋二聚體分解為單

25、螺旋三氟乙醇三氟乙醇 （trifluoroethanol，TFE）誘導肽鏈形成螺旋誘導肽鏈形成螺旋Effect of 50% TFE on a monomeric peptidewavelength in nm200210220230240MRE-35-30-25-20-15-10-50peptide in waterpeptide in 50% TFETFEEffect of 50% TFE on a coiled-coilwavelength in nm200210220230240MRE-35-30-25-20-15-10-50TM-36 aqueousTM-36 + TFETFETFE

26、對卷曲螺旋對卷曲螺旋（coiled-coil）的影響的影響 chymotrypsin (all b) lysozyme ( + b) triosephosphate isomerase(/b) myoglobin (all )CD signal of a protein depends on its 2ndary structurepHpH變化引起的變化引起的肌球素變性前后肌球素變性前后CDCD譜的動力學變化譜的動力學變化稀釋前后的熒光和稀釋前后的熒光和CDCD譜譜從伸展到折疊從伸展到折疊螺旋含量的變化的動螺旋含量的變化的動力學檢測力學檢測Kinetic Trace at 222nm(seco

27、ndary structure region)Unfolding state (random)Refolding state (-Helix)Kinetic traces at 289nm (Aromatic side chain region)細胞色素細胞色素c c伸展和折疊狀態(tài)的伸展和折疊狀態(tài)的CDCD和熒光光譜和熒光光譜反映了芳環(huán)側(cè)鏈（色氨酸殘基）的變化反映了芳環(huán)側(cè)鏈（色氨酸殘基）的變化鹽酸胍鹽酸胍中的細胞色素中的細胞色素c c(伸展狀態(tài)伸展狀態(tài)) 與與PBSPBS混合后的混合后的CDCD和熒光光譜和熒光光譜6、磁圓二色譜、磁圓二色譜（ Magnetic Circular Dichroi

28、sm ，MCD） 磁性材料對左、右圓偏光的吸收不同而產(chǎn)生的二色磁性材料對左、右圓偏光的吸收不同而產(chǎn)生的二色性現(xiàn)象。性現(xiàn)象。 利用法拉第效應，在外加磁場的作用下，許多原來利用法拉第效應，在外加磁場的作用下，許多原來沒有光學活性的物質(zhì)也具有了光學活性，原來可測沒有光學活性的物質(zhì)也具有了光學活性，原來可測得得CD譜的，在磁場中譜的，在磁場中CD信號可增大幾個數(shù)量級。信號可增大幾個數(shù)量級。 7000 Gauss 實驗要點實驗要點Sample concentration A good suggestion is to run in advance an absorption UV-VIS spectra

29、. CD spectroscopy calls for same requirements as UV-VIS: best S/N is obtained with absorbance level in the range 0.6 to 1.2. Its usually difficult to get proper data when absorbance (of sample + solvent) is over 2 O.D. 樣品杯：高度均勻的熔融石英，不會帶來附加的圓二色性。樣品杯：高度均勻的熔融石英，不會帶來附加的圓二色性。 光程：光程：0.01cm-1cm，為了降低溶劑影響，一般

30、提高樣品濃為了降低溶劑影響，一般提高樣品濃度，用短光程。度，用短光程。cell pathlengthNitrogen flushingFlushing the optics with dry nitrogen is a must: Xe lamp has a quartz envelope, so if operated in air itll develop a lot of ozone, harmful for the mirrors below 195nm oxygen will absorb radiationHT plot The HT plot is very important,

31、 since readings above 600-650V mean that not enough light is reaching the detector so a sample dilution or the use of shorter path cell are required. the HT plot is in realty a single beam spectra of our sample, since there is a direct relation between HT and sample absorbance. By data manipulation

32、HT conversion into absorbance and buffer baseline subtraction is possible. Alternatively single beam absorbance scale can be used already in CH2 during data collection, loosing however a bit the alerting functions of this channel.Bandwidth (SBW) selectionSetting of slits should be as large as possib

33、le (to decrease noise level), but compatible to the natural bandwidth (NBW) of the bands to be scanned.As a rule SBW should be kept at least 1/10 of the NBW, otherwise the band will be distorted.If NBW is not known a series of fast survey spectra at different SBW will help proper selection. Trade in

34、 of accuracy versus sensitivity (i.e. the use of larger than theoretical SBW) is occasionally required.2 nm in the far UV region1 nm in the aromatic region (where fine structures may be present), optimal band-pass (as large as possible, but not loosing information) can be determined after a trial 標準

35、操作時譜帶寬度選為標準操作時譜帶寬度選為1nm； 高分辨率測量用較窄的狹縫寬度，此時高分辨率測量用較窄的狹縫寬度，此時PMT電壓較高，電壓較高，信噪比差；信噪比差； 當樣品的光密度很高、當樣品的光密度很高、CD很小時，就要保持測試很小時，就要保持測試CD峰多需要的足夠濃度，并用較寬的狹縫寬度。此時，峰多需要的足夠濃度，并用較寬的狹縫寬度。此時，由于樣品由于樣品OD值過高，可能存在有熒光或雜散光引起的值過高，可能存在有熒光或雜散光引起的某些假象。某些假象。Number of data point data pitch, i.e. number of data points per nm, wil

36、l not directly influence the noise level. However if post run further data processing will be applied to reduce the noise, its advisable to collect as many data points as possible to increase the efficiency of the post run filtering algorithmAccumulation another way to improve S/N is to average more

37、 spectra. Here too the S/N will improve with the square root of the number of accumulations. Averaging is very effective since it compensates short term random noise, but itll not compensate long term drifts (mainly of thermal origin). So if long accumulations are used we recommend a suitable long warm-up of the system and/or the use of a sample alternator (to collect sequentially sample and blank and average their subtracted values). For long overnight accumulations its