熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)老年人外周血淋巴細(xì)胞β1和β2腎上腺素能受體基因mRNA表達(dá)

1、熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)老年人外周血淋巴細(xì)胞1和2腎上腺素能受體基因mRNA表達(dá)【摘要】 目的建立熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)老年人外周血淋巴細(xì)胞1和2腎上腺素能受體(AR)基因mRNA表達(dá)。方法隨機(jī)選擇ASA級(jí)老年患者30例，分離外周靜脈血淋巴細(xì)胞，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)1和2AR基因mRNA表達(dá)，并與半定量PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果30例患者外周血淋巴細(xì)胞熒光實(shí)時(shí)定量PCR均檢出1和2AR mRNA表達(dá)，不同性別組同一基因表達(dá)量無(wú)顯著差異（P>0.05）；熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)2AR mRNA表達(dá)量顯著高于1AR mRNA(P<0.001)，而半定量PCR隨著

2、循環(huán)次數(shù)增加，1和2ARmRNA表達(dá)差異減小。結(jié)論所建立的熒光實(shí)時(shí)定量PCR成功檢測(cè)老年人外周血淋巴細(xì)胞1和2AR基因mRNA表達(dá)，有較高的靈敏性及特異性；半定量PCR擴(kuò)增平臺(tái)期影響試驗(yàn)結(jié)果判斷。 【關(guān)鍵詞】 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 腎上腺素能受體mRNA 淋巴細(xì)胞 老年人Abstract： ObjectiveTo establish a realtime quantatitive polymerase chain reaction (PCR) method for the detection of 1and 2AR mRNA expression in elderly patientsperip

3、heral lymphocytes. MethodsThirty elderly patients with ASA grade2 / 17-were recruited. Their blood was collected and the lymphoctes were isolated. The expressions of 1and 2AR mRNA were detected with fluorescent quantitative realtime PCR and semiquantitive PCR.ResultsThere were expressions of 1 and 2

4、AR mRNA in all the subjects with realtime PCR, and the latter was significally more abundant than the former (P<0.001). Also, there was no difference between different genders (P>0.05). With semiquantive PCR, the ratio of 2AR mRNA/1AR mRNA decreased when the cycles increased (P<

5、0.05).ConclusionSemiquantatitive PCR is not perfect at the platform stage, but fluorescent realtime quantitative PCR is more accurate and sensitive than semiquantitive PCR for the detection of 1 and 2AR mRNA expressions in elderly patientsperipheral lymphocytes.Key words： realtime polymerase chain r

6、eaction (PCR); adrenergic receptor; lymphocyte; elderly patient人外周血淋巴細(xì)胞與心肌細(xì)胞表面AR密度成顯著正相關(guān)1。以淋巴細(xì)胞為模型，間接反應(yīng)各種病理生理狀態(tài)下心肌細(xì)胞AR表達(dá)變化，被多數(shù)研究所證實(shí)。然而，淋巴細(xì)胞AR亞型分布存在較大爭(zhēng)議：早期研究認(rèn)為，淋巴細(xì)胞僅表達(dá)2AR2。最新研究發(fā)現(xiàn)，人外周血淋巴細(xì)胞存在1、2和3AR三種亞型，且1和2AR mRNA豐度相近3。既往檢測(cè)淋巴細(xì)胞AR基因表達(dá)多采用半定量PCR，該方法屬終點(diǎn)檢測(cè)法，比較目的基因起始拷貝量準(zhǔn)確度較低。本研究采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)老年人外周血淋巴細(xì)胞1和2AR

7、基因mRNA表達(dá)，并與半定量PCR結(jié)果比較。1材料與方法1.1試驗(yàn)對(duì)象隨機(jī)選擇擬全麻下行擇期手術(shù)的老年患者30例，其中男、女各15例，年齡6580歲（平均73.2歲），ASA級(jí)，既往無(wú)心血管系統(tǒng)及血液系統(tǒng)疾病。1.2主要試劑及儀器人淋巴細(xì)胞分離液（美國(guó)Sigma公司）、 TrizolTMRNA Isolation Reagent(美國(guó)Invitrogen公司)，G.oTaq、Reverse Transcription System (美國(guó)Promega公司)， SYBR Green (日本Takara公司)。BIORAD iCycler iQ Muhicolor Realtime PCR De

8、tection System(美國(guó)BioRad公司)； GeneAmp PCR System 2400(美國(guó)ABI公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)；DNA電泳儀(Hoefer公司)；FluorS凝膠成像儀(美國(guó)BioRad公司)；紫外分光光度計(jì)UV240(日本)。1.3引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBI Genbank中人類1AR、2AR和actin mRNA全長(zhǎng)序列（登錄號(hào)：NM000684、NM000024和NM001101）采用Primer 3軟件(http：//cgibin/primer3/primer3wwwcgi)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)。引物由上

9、海生工生物工程有限公司合成。引物合成后用超純水溶解，每條引物濃度均為20 mol，等比例混合后-20 保存?zhèn)溆谩１?1AR、2AR、actin cDNA的引物序列（略）1.4總RNA提取與cDNA合成1.4.1外周血淋巴細(xì)胞分離術(shù)晨8：009：00抽取所選病例靜脈肝素抗凝血5ml，Boyum法分離淋巴細(xì)胞（參照人淋巴細(xì)胞分離液使用說明）。1×PBS液調(diào)整細(xì)胞濃度為（58）×106cell/ml，經(jīng)Gimsa Wright和Trypan blue染色鑒定，淋巴細(xì)胞純度>90%，活力>98%。本過程均于采血后2 h 內(nèi)完成。1.4.2總RNA提取與定

10、量Trizol法提取5×106個(gè)淋巴細(xì)胞總RNA（參照TrizolTMRNA Isolation Reagent使用說明）。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，可見明亮的28S、18S及較淡5S三條帶，無(wú)DNA污染條帶；紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度，OD260/2801.782.0；所提取RNA-70 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.4.3cDNA 的合成采用Oligo(dT)15引物，參照Reverse Transcription System說明書進(jìn)行操作，所得 cDNA-20 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.5半定量PCR檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)50 l的反應(yīng)體系組分為：5×green Go Ta

11、q Flexi Buffer 10 l，MgCl2(25 mmol)3 l，dNTP 1 l，上、下游引物（10 mol）各0.5 l，Go Taq DNA聚合酶(5 U/l)0.25 l，cDNA2 l，雙蒸去離子水補(bǔ)足至總體系。1AR、2AR和actin PCR反應(yīng)條件相同：95 預(yù)變性3 min，然后95 30 s，57 40 s， 72 45 s，分別進(jìn)行30、35和40個(gè)循環(huán)，最后72 延伸6 min。各取10 l PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定（100 V×30 min），F(xiàn)LUORS凝膠儀成像。圖像經(jīng)Quantity One軟件計(jì)算各區(qū)帶灰度值，公式如下：目的基

12、因mRNA相對(duì)含量=目的基因區(qū)帶灰度值內(nèi)參基因區(qū)帶砂度值·100%。半定量PCR重復(fù)2次。1.6熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)1.6.11、2AR和actin的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：采用TakaRa公司的SYBRR Premix ExTaqTM熒光定量PCR試劑盒，取一提取的cDNA樣品，分別作cDNA樣品原液的1/8、1/4、1/2、1和1.5倍五個(gè)cDNA含量的1、2AR和actincDNA的PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，以判斷熒光定量PCR的擴(kuò)增效率。在12.5 l 反應(yīng)體系中，其中前三個(gè)倍比稀釋濃度的cDNA樣品和原液各加入1 l，1.5倍含量的則加入原液1.5 l，加

13、入SYBR熒光定量PCR混合試劑6.25 l 及上、下游引物混合液0.25 l，最后各加滅菌超純水補(bǔ)足至12.5 l。PCR反應(yīng)條件均為：94 預(yù)變性10 s；94 變性45 s，57 退火45 s，72 延伸45 s 的條件下循環(huán)45次，95 保溫1 min 后制作熔點(diǎn)曲線，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。1.6.2熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析分別測(cè)定每個(gè)樣品1、2AR和actin mRNA的Ct值，每個(gè)樣品均作復(fù)孔以減少操作誤差。Ct值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。采用相對(duì)定量方式表示各樣品1、2

14、AR的Ct，Ct= Ct目的基因Ct內(nèi)參基因。再依據(jù)Ct=Ct目的基因Ct參照因子，計(jì)算2-Ct。當(dāng)目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率接近時(shí)，2-Ct表示所檢測(cè)樣品相對(duì)于作為參照因子樣品的目的基因的表達(dá)倍數(shù)。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，計(jì)量資料以x±s表示，組間差異比較用ANOVE及t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.11和2AR mRNA表達(dá)半定量PCR結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。35和40個(gè)PCR循環(huán)組所有樣品均可見一特異性條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片斷大小相符，無(wú)引物二聚體及非特異性條帶。30個(gè)PCR循環(huán)組部分樣品未見1ARmRNA擴(kuò)

15、增條帶。FluorS凝膠呈像系統(tǒng)掃描區(qū)帶灰度值，統(tǒng)計(jì)圖見圖2。3個(gè)循環(huán)組1AR mRNA/2AR mRNA比值均數(shù)兩兩比較均有差別（P<0.05），30個(gè)循環(huán)組檢出1和2AR mRNA表達(dá)差異較其他兩組大，隨著PCR循環(huán)次數(shù)增加，表達(dá)差異減小。2.21和2AR mRNA表達(dá)熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果見圖37。actin、1和2AR mRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖可見相關(guān)系數(shù)及擴(kuò)增效率分別為0.986、91.6%；0.989、112.4%；0.973、98.0%，基本符合熒光實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)優(yōu)化指標(biāo)。擴(kuò)增曲線圖可見，2AR擴(kuò)增平臺(tái)期為3040個(gè)循環(huán)，而該循環(huán)次數(shù)仍為1AR指數(shù)增長(zhǎng)期。熔點(diǎn)曲線可見

16、三簇波峰， actin、1和2AR Tm值分別為89 、94 和85.5 。統(tǒng)計(jì)分析見表2，所有樣品均檢出1和2AR mRNA表達(dá)，不同性別組同一基因表達(dá)量無(wú)顯著差別（P>0.05）。老年人外周血淋巴細(xì)胞2AR mRNA表達(dá)顯著高于1mRNA （Ct=8.10±0.73，18.61±1.69； n=30，P<0.001）。表2老年人外周血淋巴細(xì)胞1和2AR mRNA表達(dá)（略）3討論熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)即是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。確定樣品起始模板拷貝數(shù)的方法

17、包括絕對(duì)定量及相對(duì)定量。與絕對(duì)定量不同，相對(duì)定量不關(guān)心每個(gè)樣品中目的基因表達(dá)產(chǎn)物（mRNA）的具體拷貝數(shù)，而關(guān)注目的基因在不同的細(xì)胞類型、不同的發(fā)育周期等條件下不同的轉(zhuǎn)錄效率，即基因的差異化表達(dá)。就研究目的而論，該方法比絕對(duì)定量的應(yīng)用范圍更廣泛、更符合研究的目的4。熒光實(shí)時(shí)定量PCR按熒光產(chǎn)生的原理分為染料法（SYBR Green法）及探針法。染料法的優(yōu)點(diǎn)：(1)無(wú)需設(shè)計(jì)、合成探針，實(shí)驗(yàn)成本低；(2)使用方便，與常規(guī)PCR的操作幾乎相同。由于SYBR Green和雙鏈DNA是非特異性結(jié)合，反應(yīng)過程中如產(chǎn)生非特異產(chǎn)物、引物二聚體將影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，反應(yīng)時(shí)要設(shè)定熔解曲線分析?！叭埸c(diǎn)曲線”基于

18、如下原理：不同的PCR擴(kuò)增片段（dsDNA）具有不同的Tm值，Tm值由擴(kuò)增片斷大小及堿基構(gòu)成共同決定5。本試驗(yàn)中1和2AR擴(kuò)增片段均為209 bp，而Tm值分別為94 和85.5 ，與該理論相符合。本組圖7示熔點(diǎn)曲線均為單一波峰，并且形狀銳利，表明相關(guān)基因擴(kuò)增產(chǎn)物具有特異性。此外，實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)通過2-Ct 方法分析相對(duì)基因表達(dá)差異6，必須使標(biāo)準(zhǔn)曲線中相關(guān)系數(shù)接近1、擴(kuò)增效率為90%110%7。本試驗(yàn)actin、1和2AR mRNA相關(guān)系數(shù)及擴(kuò)增效率分別為0.986、91.6%；0.989、112.4%； 0.973、98.0%，基本符合熒光實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)優(yōu)化指標(biāo)。PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)

19、生的DNA拷貝數(shù)最初呈指數(shù)方式增加，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終經(jīng)線性期進(jìn)入平臺(tái)期。半定量PCR在擴(kuò)增結(jié)束后利用EB等染料染色來判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的多少，屬終點(diǎn)檢測(cè)法，間接判斷目的基因起始拷貝量，準(zhǔn)確度較低。熒光實(shí)時(shí)定量PCR采用參數(shù)Ct值，定量的根本原理是Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)成線性反比關(guān)系。由于Ct值是反映實(shí)際PCR反應(yīng)過程中擴(kuò)增即將進(jìn)入指數(shù)期的參數(shù)，該參數(shù)幾乎不受試劑消耗等因素的影響，因此利用Ct值可精確判斷起始模板拷貝數(shù)。文獻(xiàn)報(bào)道3，半定量PCR檢測(cè)的外周血淋巴細(xì)胞2和1AR mRNA豐度相近（采用40個(gè)循環(huán)）。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)2和1AR mRNA表達(dá)差異顯著（

20、P<0.001），而半定量PCR檢測(cè)2AR mRNA/1AR mRNA比值大小與循環(huán)次數(shù)成負(fù)相關(guān)。本組圖6可見，3540個(gè)循環(huán)為2AR擴(kuò)增平臺(tái)期，而該循環(huán)范圍仍為1AR指數(shù)增長(zhǎng)期，到達(dá)平臺(tái)期所需的循環(huán)次數(shù)取決于樣品中目的基因的起始拷貝數(shù)。結(jié)果提示，半定量PCR擴(kuò)增平臺(tái)期影響試驗(yàn)判斷，而熒光實(shí)時(shí)定量PCR具有更高的準(zhǔn)確性及靈敏度?？傊夏耆送庵苎馨图?xì)胞存在1AR mRNA低豐度表達(dá)，不同性別組間無(wú)顯著差異。本試驗(yàn)成功建立熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)1和2AR mRNA基因表達(dá)，將為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。第3期熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)老年人外周血淋巴細(xì)胞1和2腎上腺素能受體基因mRNA表達(dá)

21、吳壇光，等【參考文獻(xiàn)】 1Nduna D，Chona B, Azadali M,et al. Characterization of lymphocyte 2adrenoceptor signaling in patients with ventricular volume overload diseaseJ. Clin Exp Pharmacol, 2002,29:181-188.2Brodde OE, Kretsch R, Ikezono K,et al. Human betaadrenoceptors: relation of myocardial and lymphocyte betaadrenoceptor densityJ.Science,1986,231:1584-1585.3Yu XiYong, Lin ShuGuang, Wang Xia