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1、體外體外PD-1/PD-L1PD-1/PD-L1通路封閉實(shí)驗(yàn)步驟通路封閉實(shí)驗(yàn)步驟1)每個(gè)樣本留取5x106個(gè)PBMC,在T25的培養(yǎng)瓶中懸浮于3ml的完全培養(yǎng)基中;2)每個(gè)培養(yǎng)瓶加入10g Purified anti-PD-L1;3)在37、5%CO2孵箱中孵育6天;4)6天后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無菌的流式管中,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板顯微鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài),計(jì)活細(xì)胞的數(shù)目;5)用R10調(diào)整細(xì)胞濃度至1x107/ml;6)ICS檢測(cè)阻斷后細(xì)胞免疫功能特征。封閉階段封閉階段1 )在無菌的96孔板中,建立 ICS 實(shí)驗(yàn)(每份標(biāo)本 3 孔),每孔包括包括以下試劑: PBMC: 1 x 107/ml in R10,100
2、l1l CD28-Pure (BD Pharmingen) 1l CD49d-Pure (BD Pharmingen) Monensin ( Golgistop , 0.7ul/ml ; BD Biosciences ) FITC-CD 107a (10 l/test;BD Biosciences) 同時(shí)建立陰性對(duì)照、陽性對(duì)照,以及實(shí)驗(yàn)組(HIV-1肽庫)陰性對(duì)照:無刺激原陽性對(duì)照:Staphylococcus enterotoxin B ( SEB,1g/ml,sigma-Aldrich) HIV-1肽庫:Gag Nef Env Pol VVVRT 各2 l 刺激階段刺激階段2 )在 37C
3、、5% CO2 孵箱中孵育1小時(shí);3 )每孔細(xì)胞中加入 10 l brefeldinA ( 10 g/ml;sigma-Aldrich),繼續(xù)在 37、5% CO2孵箱中孵育 5 小時(shí); 4 )取出細(xì)胞,放入 4 C 冰箱中過夜或直接繼續(xù)下列步驟。下列所有步驟均要求避光,因此孵育過程必須使用錫箔紙覆蓋細(xì)胞。 1 )將 96 孔板中的刺激后的 PBMC 轉(zhuǎn)移到流式管中; 2 )在細(xì)胞管中加入 PBS,約 2/3 管,離心 1500 rpm x 10 分鐘; 3 )將上清倒到廢液缸,用紗布或吸水紙除去殘留液; 4 )加入表面抗體:Anti-CD3-ECD ( 5 l) Anti-CD4-A PC-
4、Cy7 (2.5 l)Anti-CD8-PerCP-Cy5.5 (10 l) Anti-PD-1-APC (10 l)染色分析階段染色分析階段5)以錫箔紙覆蓋細(xì)胞后,在4 冰箱中孵育30分鐘。 6)用PBS洗滌后,加入250 l Fixation/perm ( BD Biosciences ) ,充分混勻后在4冰箱中孵育20分鐘;7) 1 x Perm/Washbuffe(BD Bioscienccs )洗滌兩次,每次加入 2 ml 的洗液。離心 1500 rpm x 10 分鐘; 8)加入抗細(xì)胞因子抗體:anti-IFN-PE-Cy7 mAb (10l Biolegend);9)以錫箔紙覆蓋細(xì)胞后,在生物安全柜中室溫孵育 20 分鐘 ;10)用 PBS 洗滌一遍,離心1500 rpm x 10分鐘(室溫);11)以 300 l 2多聚甲醛
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