乳腺生物反應(yīng)器ppt課件

1、動動 物物 乳乳 腺腺 生生 物物 反反 應(yīng)應(yīng) 器器 1;.2轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)加快家畜品種的改良速度，提高肉、加快家畜品種的改良速度，提高肉、奶、蛋的產(chǎn)量和品質(zhì)，生產(chǎn)珍貴的藥奶、蛋的產(chǎn)量和品質(zhì)，生產(chǎn)珍貴的藥用蛋白用蛋白,為大量患者造福。為大量患者造福。 轉(zhuǎn)基因動物最誘人的前景是作為轉(zhuǎn)基因動物最誘人的前景是作為生物反應(yīng)生物反應(yīng)器器，利用它生產(chǎn)人類所需要的生物活性產(chǎn)，利用它生產(chǎn)人類所需要的生物活性產(chǎn)品或藥物，其常用方法是把目的基因在血品或藥物，其常用方法是把目的基因在血液循環(huán)系統(tǒng)、唾液腺或乳腺等器官或組織液循環(huán)系統(tǒng)、唾液腺或乳腺等器官或組織中表達(dá)，從而獲得人類需要的目的產(chǎn)物。中表達(dá)，從

2、而獲得人類需要的目的產(chǎn)物。 根據(jù)目的蛋白表達(dá)部位的根據(jù)目的蛋白表達(dá)部位的不同可分為不同可分為乳腺生物反應(yīng)乳腺生物反應(yīng)器器、血、血 液生物液生物 反反 應(yīng)應(yīng) 器器 、卵卵 生生 物物 反反 應(yīng)應(yīng) 器器 、尿、尿 生生 物物 反反 應(yīng)器、精囊腺生物反應(yīng)應(yīng)器、精囊腺生物反應(yīng)器、唾液腺生物反應(yīng)器等。器、唾液腺生物反應(yīng)器等。3乳腺生物反應(yīng)器的原理及步驟乳腺生物反應(yīng)器的原理及步驟乳腺生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展乳腺生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展乳腺生物反應(yīng)器的存在的問題乳腺生物反應(yīng)器的存在的問題乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及其應(yīng)用乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及其應(yīng)用4原理原理: 應(yīng)用重組應(yīng)用重組 DNA技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將目的基因轉(zhuǎn)移到尚

3、處于原核階段的動物胚胎技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將目的基因轉(zhuǎn)移到尚處于原核階段的動物胚胎中，經(jīng)胚胎移植得到轉(zhuǎn)基因乳腺表達(dá)多肽藥物、工業(yè)酶、疫苗和抗體等蛋白的技術(shù)。中，經(jīng)胚胎移植得到轉(zhuǎn)基因乳腺表達(dá)多肽藥物、工業(yè)酶、疫苗和抗體等蛋白的技術(shù)。 外源基因在乳腺特異性表達(dá)需要乳蛋白基因的一個(gè)啟動子和調(diào)控區(qū)，即需要一個(gè)引外源基因在乳腺特異性表達(dá)需要乳蛋白基因的一個(gè)啟動子和調(diào)控區(qū)，即需要一個(gè)引導(dǎo)泌乳期乳蛋白基因表達(dá)的序列，這樣才能將外源基因置于乳腺特異性調(diào)節(jié)序列控制導(dǎo)泌乳期乳蛋白基因表達(dá)的序列，這樣才能將外源基因置于乳腺特異性調(diào)節(jié)序列控制之下，使其在乳腺中表達(dá)再通過回收奶獲得具有生物活性的目的蛋白。之下，使其在乳腺

4、中表達(dá)再通過回收奶獲得具有生物活性的目的蛋白。乳腺生物反應(yīng)器的原理及步驟乳腺生物反應(yīng)器的原理及步驟5步驟6轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)紅細(xì)胞生成素（轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)紅細(xì)胞生成素（ EPO ）將將EPO DNA分別以分別以Hind和和BamHI酶切，回收酶切，回收5.4kb的的Hind/BamHI片段，插片段，插入入pGEM-7zf(+)載體，再將載體，再將867bp的的BLG啟動子插入啟動子插入EPO基因之前基因之前EcoR、ClaI位點(diǎn)，位點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)載體pGEM-3zf(+)-LG-EPO。通過顯微注射方法得到轉(zhuǎn)基因小鼠，其。通過顯微注射方法得到轉(zhuǎn)基因小鼠，其乳腺中的乳腺中的EPO含量可達(dá)含量

5、可達(dá)0.5g/ml。7 20 20世紀(jì)世紀(jì)8080年代末提出動物乳腺生物反應(yīng)器的設(shè)想年代末提出動物乳腺生物反應(yīng)器的設(shè)想 1987 1987年，年，GordonGordon等首次報(bào)道在小鼠的乳腺中表達(dá)了人的組織纖溶酶原激活劑等首次報(bào)道在小鼠的乳腺中表達(dá)了人的組織纖溶酶原激活劑(tPA)(tPA)基因?；?。 1991 1991年，年，WrightGWrightG等培育成乳腺特異表達(dá)人抗胰蛋白酶轉(zhuǎn)基因綿羊，表達(dá)水平高達(dá)等培育成乳腺特異表達(dá)人抗胰蛋白酶轉(zhuǎn)基因綿羊，表達(dá)水平高達(dá)35g/L35g/L，在世界范圍內(nèi)引起了極大的轟動。在世界范圍內(nèi)引起了極大的轟動。 1991 1991年，年，BremBrem

6、等報(bào)道乳腺表達(dá)牛凝乳酶的轉(zhuǎn)基因兔，表達(dá)等報(bào)道乳腺表達(dá)牛凝乳酶的轉(zhuǎn)基因兔，表達(dá) 水平達(dá)到水平達(dá)到1 110g/L10g/L。 1992 1992年，年，Ve-landeVe-lande：等報(bào)道了乳腺表達(dá)人：等報(bào)道了乳腺表達(dá)人C C蛋白的轉(zhuǎn)基因豬，表達(dá)水平達(dá)到蛋白的轉(zhuǎn)基因豬，表達(dá)水平達(dá)到1g/L1g/L以上。以上。 目前，從轉(zhuǎn)基因動物乳汁中提取的抗人胰蛋白酶、抗凝血酶目前，從轉(zhuǎn)基因動物乳汁中提取的抗人胰蛋白酶、抗凝血酶和人和人C C蛋白等基因工程產(chǎn)品已蛋白等基因工程產(chǎn)品已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，并已初步形成以轉(zhuǎn)基因動物乳腺為主要生產(chǎn)手段的醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)。進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，并已初步形成以轉(zhuǎn)基因動物乳腺為主要生產(chǎn)

7、手段的醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)。乳腺生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展乳腺生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展國外研究進(jìn)展國外研究進(jìn)展820世紀(jì)世紀(jì)80年代初，施履吉院士就提出乳腺生物反應(yīng)器的構(gòu)年代初，施履吉院士就提出乳腺生物反應(yīng)器的構(gòu) 想想 ，并成功獲得表達(dá)乙肝病毒，并成功獲得表達(dá)乙肝病毒表面抗原的轉(zhuǎn)基因兔表面抗原的轉(zhuǎn)基因兔 ，為，為 我國通過轉(zhuǎn)基因動物的途徑獲得珍貴藥物奠定了基礎(chǔ)。我國通過轉(zhuǎn)基因動物的途徑獲得珍貴藥物奠定了基礎(chǔ)。1995年，我國首次在小鼠乳腺中成功地表達(dá)了人的基因；年，我國首次在小鼠乳腺中成功地表達(dá)了人的基因；1996年年10月上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所與復(fù)旦大學(xué)合作研制成功的能在乳腺中表達(dá)人凝血因子月上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所與復(fù)旦

8、大學(xué)合作研制成功的能在乳腺中表達(dá)人凝血因子的轉(zhuǎn)基因羊。的轉(zhuǎn)基因羊。2005年，國家年，國家 “ “863”計(jì)劃組利用轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù)計(jì)劃組利用轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù) ，分別獲得了，分別獲得了 轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白、轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白、轉(zhuǎn)人溶菌酶、轉(zhuǎn)乳清白蛋白等轉(zhuǎn)人基因轉(zhuǎn)人溶菌酶、轉(zhuǎn)乳清白蛋白等轉(zhuǎn)人基因 蛋白，其中人乳蛋白，其中人乳 鐵蛋白和人鐵蛋白和人-乳清白蛋白是乳清白蛋白是國際上首次國際上首次 利用轉(zhuǎn)基因克隆牛而獲得的。利用轉(zhuǎn)基因克隆牛而獲得的。 雖然我國在該項(xiàng)技術(shù)上取得了較大進(jìn)展，雖然我國在該項(xiàng)技術(shù)上取得了較大進(jìn)展，但還處于探索階段，與國外還有一定的差距。但還處于探索階段，與國外還有一定的差距。 自

9、國家自國家“863”計(jì)劃對計(jì)劃對 “ “動物乳腺生物動物乳腺生物反應(yīng)器應(yīng)用研究反應(yīng)器應(yīng)用研究”立項(xiàng)后，逐步受到有關(guān)部門和企業(yè)界的重視，研究和開發(fā)的力度加立項(xiàng)后，逐步受到有關(guān)部門和企業(yè)界的重視，研究和開發(fā)的力度加 強(qiáng)，前景非常樂觀。強(qiáng)，前景非常樂觀。國內(nèi)研究進(jìn)展國內(nèi)研究進(jìn)展9表達(dá)產(chǎn)物能充分修飾且具有穩(wěn)定的生物活性表達(dá)產(chǎn)物能充分修飾且具有穩(wěn)定的生物活性 利用DNA重組技術(shù)的微生物來生產(chǎn)的藥用蛋白,由于細(xì)菌等微生物不能進(jìn)行蛋白質(zhì)合成后的加工, 因而生物活性低, 并且具有免疫原性。產(chǎn)品成本低產(chǎn)品成本低,可以大規(guī)模生產(chǎn)可以大規(guī)模生產(chǎn) 藥物其效率是利用以大腸桿菌和動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的100倍產(chǎn)品質(zhì)量高產(chǎn)品質(zhì)

10、量高,易提純易提純 生物活性與天然蛋白幾乎完全一樣,極易提純。乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及其應(yīng)用乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及其應(yīng)用10應(yīng)用應(yīng)用組織纖溶酶原激活劑組織纖溶酶原激活劑(TPA)：由美國遺傳技術(shù)公司開發(fā)的血栓溶解劑，：由美國遺傳技術(shù)公司開發(fā)的血栓溶解劑，1987 年年11月經(jīng)聯(lián)邦月經(jīng)聯(lián)邦食品及藥物管理局食品及藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)上市。批準(zhǔn)上市。1988年的銷售額為年的銷售額為1.51.6億美元，億美元，1989年為年為1.81.9億美元。今后每年的市場銷售額約為億美元。今后每年的市場銷售額約為22.5億美元。億美元。 重組人抗凝血酶重組人抗凝血酶ii:世界上第一個(gè)動物乳腺生物反映器重組蛋白藥

11、物。重組人抗凝血酶世界上第一個(gè)動物乳腺生物反映器重組蛋白藥物。重組人抗凝血酶iii具具有抑制血液中凝血酶活性，預(yù)防和治療急慢性血栓血塞形成，對治療抗凝血酶缺失癥有抑制血液中凝血酶活性，預(yù)防和治療急慢性血栓血塞形成，對治療抗凝血酶缺失癥有顯著效果。有顯著效果。2010年，轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)品銷售額達(dá)到年，轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)品銷售額達(dá)到350 億美元，生產(chǎn)的藥物將占整個(gè)基億美元，生產(chǎn)的藥物將占整個(gè)基因工程藥物種類的因工程藥物種類的90%以上。以上。11目的基因在動物基因中的整合問題目的基因在動物基因中的整合問題 由于目的基因在動物基因中的整合是隨機(jī)的，因此包括整合位點(diǎn)、整合的由于目

12、的基因在動物基因中的整合是隨機(jī)的，因此包括整合位點(diǎn)、整合的拷貝數(shù)等機(jī)制還不清楚。所以易發(fā)生調(diào)節(jié)失控、遺傳不穩(wěn)定、表達(dá)率不高等問題?？截悢?shù)等機(jī)制還不清楚。所以易發(fā)生調(diào)節(jié)失控、遺傳不穩(wěn)定、表達(dá)率不高等問題。乳腺生物反應(yīng)器的存在的問題乳腺生物反應(yīng)器的存在的問題12轉(zhuǎn)基因動物的成活率低轉(zhuǎn)基因動物的成活率低 在目的基因的分離和改造，乳腺特異表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的關(guān)鍵在目的基因的分離和改造，乳腺特異表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的關(guān)鍵性技術(shù)上存在缺陷，無法保證對基因的定點(diǎn)整合，因此轉(zhuǎn)基因動物常會出現(xiàn)繁殖力下性技術(shù)上存在缺陷，無法保證對基因的定點(diǎn)整合，因此轉(zhuǎn)基因動物常會出現(xiàn)繁殖力下降、胚胎早期死亡等各種生理及病理缺陷降、胚胎早期死亡等各種生理及病理缺陷 。13安全性安全性 動物體內(nèi)雖然可以對外源蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，但由于牛、羊等家畜存在動物體內(nèi)雖然可以對外源蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，但由于牛、羊等家畜存在自身機(jī)體保護(hù)系統(tǒng)可對所有外源性物質(zhì)產(chǎn)生排斥反應(yīng)，如出現(xiàn)蛋白質(zhì)水解等問題。自身機(jī)體保護(hù)系統(tǒng)可對所有外源性物質(zhì)產(chǎn)生排斥反應(yīng)，如出現(xiàn)蛋白質(zhì)水解等問題。 此此外乳汁中可能含有的微生物及不完全修飾的多肽都對產(chǎn)品的安全性構(gòu)成了極大的威脅，外乳汁中可能含有的微生物及不完全修飾的多肽都對產(chǎn)品的安全性構(gòu)成了極