紅外分光光度法中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范2010年版

1、紅外分光光度法1 簡述化合物受紅外輻射照射后， 使分子的振動和轉(zhuǎn)動運動由較低能級向較高能級躍遷， 從而導(dǎo)致對特定頻率紅外輻射的選擇性吸收，形成特征性很強(qiáng)的紅外吸收光譜，紅外光譜又稱振-轉(zhuǎn)光譜。紅外光譜是鑒別物質(zhì)和分析物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的有效手段，已被廣泛應(yīng)用于物質(zhì)的定性鑒別、 物相分析和定量測定， 并用于研究分子間和分子內(nèi)部的相互作用。習(xí)慣上，往往把紅外區(qū)分為3 個區(qū)域，即近紅外區(qū)（ 128004000cm ，0.78 2.5m ） 。其中中紅外區(qū)是藥物分析中最常用的區(qū)域。紅外吸收與物質(zhì)濃度的關(guān)系在一定范圍內(nèi)服從于朗伯-比爾定律，因而它也是紅外分光光度法定量的基礎(chǔ)。紅外分光光度計分為色散型和傅里葉變

2、換型兩種。前者主要由光源、單色器（通常為光柵） 、樣品室、檢測器、記錄儀、控制和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。 以光柵為色散元件的紅外分光光度計，以波數(shù)為線性刻度，以棱鏡為色散元件的儀器，以波長為線性刻度。波數(shù)與波長的換算關(guān)系如下：波數(shù)（cm-1）= 104波長m傅里葉變換型紅外光譜儀 （簡稱 ft-ir） 則由光學(xué)臺（包括光源、干涉儀、樣品室和檢測器） 、記錄裝置和處理系統(tǒng)組成，由干涉圖變?yōu)榧t外光譜需經(jīng)快速傅里葉變換。該型儀器現(xiàn)已成為最常用的儀器。2 紅外分光光度計的檢定所用儀器應(yīng)按現(xiàn)行國家質(zhì)量與核查技術(shù)監(jiān)督局“色散型紅外分光光度計檢定規(guī)程”、“傅里葉變換紅外光譜儀檢定規(guī)程” 和 中國藥典附錄規(guī)定，并參

3、考儀器說明書，對儀器定期進(jìn)行校正檢定。2.1 波數(shù)準(zhǔn)確度2.1.1波數(shù)準(zhǔn)確度的允差范圍傅里葉變換紅外光譜儀在3000cm-1附近的波數(shù)誤差應(yīng)不大于 5cm-1，在 1000cm-1附近的波數(shù)誤差應(yīng)不大于1cm-1。2.1.2 波數(shù)準(zhǔn)確度檢定方法2.1.2.1以聚苯乙烯膜校正按儀器使用說明書要求設(shè)置參數(shù)，以常用的掃描速度記錄厚度為50 m 的聚苯乙烯膜紅外光譜圖。 測量有關(guān)譜帶的位置，其吸收光譜圖應(yīng)符合藥品紅外光譜集所附聚苯乙烯圖譜的要求，并與參考波數(shù)（表1）比較，計算波數(shù)準(zhǔn)確度。表 1 聚苯乙烯吸收譜帶常用的波數(shù)值波數(shù)（ cm-1）波數(shù)（ cm-1）3027.1 1583.1 2850.7 1

4、154.3 1944.0 1028.0 1801.6 906.7 1601.4 2.1.2.2以液體池用液體茚校正液體茚在 3900690cm-1范圍內(nèi)有較多的吸收峰可資比較， 適于測定中等分辨率的儀器。一般需用適當(dāng)液層厚度的固定厚度密封液體池， 選用液體池的窗片材料應(yīng)能保證在測量波數(shù)范圍內(nèi)有良好的紅外光透過率，窗片應(yīng)有良好的光潔度和平面平行度，注樣品時將液體池放在一楔形板上，打開2 個進(jìn)樣孔塞，把樣品用專用注射器從下部進(jìn)樣孔緩緩注入。同時觀察池內(nèi)液面緩緩上升而不夾帶氣泡，至液體在上進(jìn)樣孔內(nèi)接近滿溢時，取下注射器，先蓋好下進(jìn)樣孔塞， 再蓋上上進(jìn)樣孔塞， 吸去外溢液體后即可在儀器上測定吸收光譜，

5、其主要譜帶見表2。表 2 茚主要吸收譜帶的波數(shù)值（50 m 液層， cm-1）3926.5 3139.5 2771.0 1915.3 1553.2 1361.1 1205.1 1018.5 830.5 590.8 2.2 波數(shù)重現(xiàn)性用與 2.1 波數(shù)準(zhǔn)確度測量相同的儀器參數(shù)， 對同一張聚苯乙烯膜進(jìn)行反復(fù)重疊掃描。一般掃描35 次。從掃描所得光譜測定波數(shù)的重現(xiàn)性。 測得的各吸收峰的重現(xiàn)性應(yīng)符合現(xiàn)行國家技術(shù)監(jiān)督局的要求。2.3 分辨率 以聚苯乙烯膜檢定。色散型紅外儀用常規(guī)狹縫程序，通常的掃描速度， 或以較窄的狹縫程序用較慢的掃描速度，記錄聚苯乙烯的圖譜。傅里葉紅外儀設(shè)置于2cm-1分辨率和適宜的掃

6、描次數(shù)，依法記錄光譜圖。在 31102850cm-1范圍內(nèi)，應(yīng)能顯示 7 個吸收帶，其中峰 2851cm-1與谷 2870cm-1之間的分辨深度應(yīng)不小于18% 透光率；又峰 1583cm-1與谷 1589cm-1之間的分辨深度應(yīng)不小于12% 透光率。儀器的標(biāo)稱分辨率，應(yīng)不低于2 cm-1。2.4 100% 線平直度調(diào)節(jié) 100% 控制旋鈕，使記錄筆置于 95% 透光率處，以快速掃描速度掃描全波段，其100% 線的偏差應(yīng)小于 1% 透光率。2.5 噪聲 調(diào)節(jié) 100% 控制旋鈕，使記錄筆置于95% 透光率處，在1000cm-1處定波數(shù)連續(xù)掃描5min，其最大噪聲（峰 - 峰值）應(yīng)小于 1%透光率

7、。2.6 其他 雜散光水平和透光率準(zhǔn)確度檢查，因需要特殊器件，且對藥品測定影響不大，故不作硬性要求。3 紅外光譜測定操作方法紅外光譜測定技術(shù)分兩類。一類是指檢測方法，如透射、衰減全反射、漫反射、光聲及紅外發(fā)射等；另一類是指制樣技術(shù)。在藥物分析中，通常測定的都是透射光譜，采用的制樣技術(shù)主要有壓片法、糊法、膜法、溶液法、衰減全反射法和氣體吸收池法等。3.1 壓片法 取供試品約 11.5mg，置瑪瑙研缽中，加入干燥的溴化鉀或氯化鉀細(xì)粉約200300mg （與供試品的比約為200：1）作為分散劑，充分研磨混勻， 置于直徑為 13mm 的壓片模具中， 使鋪展均勻，抽真空約 2min，加壓至（0.8 10

8、6）kpa（約 810t/cm2）, 保持壓力2min，撤去壓力并放氣后取出制成的供試片，目視檢測，片子應(yīng)呈透明狀，其中樣品分布應(yīng)均勻，并無明顯的顆粒狀樣品。亦可采用其他直徑的壓模制片， 樣品與分散劑的用量需相應(yīng)調(diào)整以制得濃度合適的片子。3.2 糊法 取供試品約 5mg ，置瑪瑙研缽中，粉碎研細(xì)后，滴加少量液狀石蠟或其他適宜的糊劑， 研成均勻的糊狀物， 取適量糊狀物夾于兩個窗片或空白溴化鉀片（每片約150mg ）之間，作為供試片，另以溴化鉀約 300mg制成空白作為補(bǔ)償。 亦可用專用裝置夾持糊狀物。 制備時應(yīng)注意盡量使糊狀樣品在窗片間分布均勻。3.3 膜法 參照上述糊法所述的方法，將能形成薄膜

9、的液體樣品鋪展于適宜的鹽片中，使形成薄膜后測定。若為高分子聚合物，可先制成適宜厚度的高分子薄膜， 直接置于樣品光路中測定。 熔點較低的固體樣品可采用熔融成膜的方法制樣。3.4 溶液法 將供試品溶于適宜的溶劑中，制成1%10% 濃度的溶液，灌入適宜厚度的液體池中測定。常用溶劑有四氯化碳、三氯甲烷、二硫化碳、己烷、 環(huán)己烷及二氯乙烷等。選用溶液應(yīng)在被測定區(qū)域中透明或僅有中至弱的吸收，且與樣品間的相互作用應(yīng)盡可能小。3.5 氣體吸收池法測定氣體樣品需使用氣體吸收池，常用氣體吸收池的光路長度為 10cm。通常先把氣體吸收池抽空，然后充以適當(dāng)壓力（約 50mmhg）的供試品測定。也可用注射器向氣體吸收池

10、內(nèi)注入適量的樣品，待樣品完全氣化后測定。3.6 衰減全反射法（ atr ） 取供試品適量，均勻地鋪展在衰減全反射棱鏡的底面上，使緊密接觸，依法錄制反射光譜圖。 本法適用于纖維、高分子聚合物等難粉碎的樣品。3.7 試樣的制備方法除另有規(guī)定外，用作鑒別時應(yīng)按照藥典委員會編訂的藥品紅外光譜集 第一卷（1995 年版） 、第二卷（2000年版） 、第三卷（ 2005 年版）和第四卷（ 2010 年版）收載的各光譜圖所規(guī)定的制備方法制備。具體操作技術(shù)可參見藥品紅外光譜集的說明。當(dāng)新卷收載舊卷相同譜號的光譜圖時，舊卷圖譜作廢。用作晶型、 異構(gòu)體限度檢查或含量測定時，試樣制備和具體測定方法均按藥典各品種項下

11、有關(guān)規(guī)定操作。4 供試品的測定4.1 原料藥的鑒別采用固體制樣技術(shù)時，最常碰到的問題是多晶型現(xiàn)象，固體樣品的晶型不同，其紅外光譜往往也會產(chǎn)生差異。當(dāng)供試品的實測光譜與藥品紅外光譜集所收載的對照圖不一致時，在排除各種可能影響光譜的外在或人為因素后，應(yīng)按該藥品光譜圖中備注的方法或各品種項下規(guī)定的方法進(jìn)行預(yù)處理，再繪制光譜，進(jìn)行比對。如未規(guī)定該品種供藥用的晶型或預(yù)處理方法，則可使用對照品， 并采用適當(dāng)?shù)娜軇┰嚻放c對照品在相同的條件下同時進(jìn)行重結(jié)晶，然后依法繪制光譜，進(jìn)行比對。如已規(guī)定特定的藥用晶型，則應(yīng)采用相應(yīng)晶型的對照品依法進(jìn)行比對。當(dāng)采用固體制樣技術(shù)不能滿足鑒別需要時，可改用溶液法繪制光譜后

12、對比。4.2 制劑的鑒別4.2.1 分類4.2.1.1不加輔料的制劑如無菌原料直接分裝的注射用粉針劑及不加輔料的凍干劑和膠囊劑等其他成品，可直接取內(nèi)容物繪制光譜圖進(jìn)行鑒別。4.2.1.2單方制劑一般采取簡單的提取分離手段就能有效去除輔料，可根據(jù)不同劑型的特點選擇不同的分離提取方法，取干燥后的提取物繪制光譜圖進(jìn)行鑒別。4.2.1.3復(fù)方制劑一般情況比較復(fù)雜，根據(jù)具體問題具體分析。4.2.2 前處理4.2.2.1 預(yù)處理 對可能影響樣品紅外光譜的部分，在提取前應(yīng)盡量去除，如對于包衣制劑應(yīng)先去除包衣，雙層片將二層分開等。4.2.2.2 提取 一般按各品種項下規(guī)定的方法對待測成分進(jìn)行分離提取。如品種項

13、下未規(guī)定提取方法，對國外藥典已收載有紅外光譜鑒別的制劑或有其他相關(guān)文獻(xiàn)資料的品種，可參考相關(guān)文獻(xiàn)方法進(jìn)行處理。對于無文獻(xiàn)資料的藥物制劑， 可根據(jù)活性成分和輔料的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)奶崛》椒?。首選易揮發(fā)、非極性的有機(jī)溶劑為提取溶劑，如乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚、乙醇、甲醇等；如標(biāo)準(zhǔn)光譜集中有轉(zhuǎn)晶方法， 或可獲得原料藥的精制溶劑， 最好選用與轉(zhuǎn)晶方法相同的溶劑或精制溶劑。若首選溶劑不適用， 可考慮混合溶劑。一般所選溶劑為無水溶劑， 提取時有機(jī)層可加無水硫酸鈉除去水分。根據(jù)活性成分和輔料的溶解度不同，通過選擇適合的溶劑即能提取活性成分又能去除輔料，則采用直接提取法。對于多數(shù)藥品，一般

14、選用的常用溶劑如水、甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醚、 石油醚等就能基本達(dá)到分離效果， 非極性溶劑的效果比極性的好。一般非電離有機(jī)物質(zhì) （不是有機(jī)酸或有機(jī)堿的鹽） 采用此法可獲得滿意的結(jié)果。如凍干制劑常用輔料均不溶于乙醇和甲醇，用醇提取均能獲得滿意結(jié)果；輔料只有水的液體制劑， 可蒸干水分后繪制紅外光譜。對于液體或半固體制劑宜選擇萃取法，可根據(jù)活性成分和輔料性質(zhì)選用直接萃取法，當(dāng)有機(jī)酸或有機(jī)堿的鹽類藥物經(jīng)直接提取法不能夠獲得滿意的光譜圖時，一般采用經(jīng)酸化（或堿化）后再萃取的方法，但需與活性物質(zhì)（基）的紅外光譜進(jìn)行比對。含有待測成分的提取溶液經(jīng)過濾后，可選擇析晶、蒸干、揮發(fā)等方法獲得待測

15、成分；必要時可經(jīng)洗滌、重結(jié)晶等方法純化。4.2.3 干燥 可根據(jù)藥品紅外光譜集 備注中的干燥方法對待測成分進(jìn)行干燥，也可采用各種項下規(guī)定的干燥失重方法或參考（中國藥典2010 年版二部附錄l）干燥失重測定法項下的方法進(jìn)行干燥，可視待測成分情況適當(dāng)增減干燥時間。4.2.4 圖譜對比4.2.4.1輔料無干擾， 待測成分的晶型不變化， 此時可直接與對照品圖譜或?qū)φ請D譜進(jìn)行比對。4.2.4.2 輔料無干擾，但待測成分的晶型有變化，此種情況可用對照品經(jīng)同法處理后的圖譜比對。4.2.4.3 待測成分的晶型不變化，而輔料存在不同程度的干擾，此時可參照原料藥的對照圖譜， 在指紋區(qū)內(nèi)選擇35 個不受輔料干擾的待

16、測成分的特征譜帶作為鑒別的依據(jù)。鑒別時，實測譜帶的波數(shù)誤差應(yīng)小于規(guī)定值的 0.5%。4.2.4.4 待測成分的晶型有變化，輔料也存在干擾，此種情況一般不宜采用紅外光譜鑒別。4.3 多組分原料藥的鑒別不能采用全光譜對比，可借鑒4.2.4.3的方法，選擇主要成分的若干個特征譜帶，用于組成相對穩(wěn)定的多組分原料藥的鑒別。4.4 晶型、異構(gòu)體的限度檢查或含量測定供試品制備和具體測定方法均按各品種項下有關(guān)規(guī)定操作。5 測量操作注意事項5.1 環(huán)境條件紅外實驗室的室溫應(yīng)控制在1530，相對濕度應(yīng)小于65%，適當(dāng)通風(fēng)換氣，以避免積聚過量的二氧化碳和有機(jī)溶劑蒸氣。供電電壓和接地電阻應(yīng)符合儀器說明書要求。5.2

17、背景補(bǔ)償或空白校正記錄供試品光譜時，雙光束儀器的參比光路中應(yīng)置相應(yīng)的空白對照物（空白鹽片、溶劑或糊劑等）；單光束儀器（常見的傅里葉變換紅外儀）應(yīng)先進(jìn)行空白背景掃描，掃描供試品后扣除背景吸收，即得供試品光譜。5.3 采用壓片法時，以溴化鉀最常用。若供試品為鹽酸鹽，可比較氯化鉀壓片和溴化鉀壓片法的光譜，若二者沒有區(qū)別，則使用溴化鉀。所使用的溴化鉀或氯化鉀在中紅區(qū)應(yīng)無明顯的干擾吸收；應(yīng)預(yù)先研細(xì)，過 200 目篩，并在 120干燥 4h 后分裝并在干燥器中保存?zhèn)溆?。若發(fā)現(xiàn)結(jié)塊，則須重新干燥。5.4 供試品研磨應(yīng)適度， 通常以粒度 25 m 為宜。供試品過度研磨有時會導(dǎo)致晶格結(jié)構(gòu)的破壞或晶型的轉(zhuǎn)化。粒度

18、不夠細(xì)則易引起光散射能量損失，使整個光譜基線傾斜，甚至嚴(yán)重變形。該現(xiàn)象在40002000cm-1高頻端最為明顯。 壓片法及糊法中最易發(fā)生這種現(xiàn)象。5.5 壓片法制成的片厚在0.5mm 左右時，常可在光譜上觀察到干涉條紋，對供試品光譜產(chǎn)生干擾。一般可將片厚調(diào)節(jié)至0.5mm 以下即可減弱或避免。也可用金相砂紙將片稍微打毛以去除干擾。5.6 測定樣品時的掃描速度應(yīng)與波長校正的條件一致（快速掃描將使波長滯后）。制成圖譜的最強(qiáng)吸收峰透光率應(yīng)在10%以下，圖譜的質(zhì)量應(yīng)符合藥品紅外光譜集的要求。5.7 使用預(yù)先印制標(biāo)尺記錄紙的色散型儀器，在制圖時應(yīng)注意記錄筆在紙上縱橫坐標(biāo)的位置與儀器示值是否相符，以避免因圖紙對準(zhǔn)不良而引起的誤差。5.8 壓片模具及液體吸收池等紅外附件，使用完后應(yīng)及時擦拭干凈，必要時清洗，保存在干燥器中，以免銹蝕。5.9 關(guān)于樣品的純度提取后活性成分的純度在90%95% 的范圍內(nèi)就能基本滿足制劑紅外鑒別的要求。5.10 建立自己的光譜庫不同儀器間峰波數(shù)和峰的強(qiáng)弱會有微小差別，建議各實驗室建立自己的光譜庫，用儀器自帶軟件計算與參考圖譜的一致性。導(dǎo)數(shù)光譜能夠極大的增強(qiáng)判斷的準(zhǔn)確性。5.11 波數(shù)的偏差低于 1000cm-1波數(shù)的偏差不超過0.5%，其他波數(shù)