液體發(fā)酵技術(shù)

1、液體發(fā)酵技術(shù) 1. 液體發(fā)酵技術(shù)簡(jiǎn)介液體發(fā)酵的概念液體發(fā)酵技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)之一， 它是指在生化反應(yīng)器中， 模仿自然界將食藥用菌在 生育過(guò)程中所必需的糖類(lèi)、 有機(jī)和無(wú)機(jī)含有氮素的化合物、 無(wú)機(jī)鹽等一些微量元素以及其它 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溶解在水中作為培養(yǎng)基， 滅菌后接入菌種， 通入無(wú)菌空氣并加以攪拌， 提供食用菌 菌體呼吸代謝所需要的氧氣， 并控制適宜的外界條件， 進(jìn)行菌絲大量培養(yǎng)繁殖的過(guò)程。 工業(yè) 化大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)即為發(fā)酵生產(chǎn)， 亦稱深層培養(yǎng)或沉沒(méi)培養(yǎng)。 工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)必需采用發(fā) 酵罐， 而實(shí)驗(yàn)室中發(fā)酵培養(yǎng)多采用三角瓶。 得到的發(fā)酵液中含有菌體、 被菌體分解及未分解 的營(yíng)養(yǎng)成分、 菌體產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物

2、。 發(fā)酵液直接供作藥用或供分離提取， 也可以作液體菌種。液體發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史液體深層發(fā)酵技術(shù)這一概念是 20世紀(jì) 40 年代由美國(guó)弗吉尼亞大學(xué)生物工程專(zhuān)家 Elmer L， 設(shè)計(jì)出培養(yǎng)微生物系統(tǒng)的生物反應(yīng)器， 成為該項(xiàng)技術(shù)的創(chuàng)始人。 據(jù)資料報(bào)道， 液體深層發(fā)酵 技術(shù)應(yīng)用于食藥用菌方面的研究始于美國(guó)。 1948 年，用深層發(fā)酵來(lái)培養(yǎng)蘑菇 (Agaricus campestris) 菌絲體，并首先提出了用液體發(fā)酵來(lái)培養(yǎng)蕈菌的菌絲體。從此食藥用菌的發(fā)酵 生產(chǎn)在世界范圍內(nèi)興起； 1953 年，美國(guó)的博士用廢苷汁深層培養(yǎng)了野蘑菇 (Agaricus arvensis) ； 1958 年第一個(gè)用發(fā)酵罐培

3、養(yǎng)了羊肚菌 (Morchella esculenta) 。從此，食藥用 菌的生產(chǎn)漸漸跨入了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的領(lǐng)域。日本的杉森恒武等于1975、1977 年用 1%的有機(jī)酸和 %的酵母膏組成液體培養(yǎng)基， 取得了大量香菇菌絲體。 我國(guó)是在 1958 年開(kāi)始研究蘑 菇、側(cè)耳等的深層發(fā)酵的。 1963 年羊肚菌液體發(fā)酵開(kāi)始工業(yè)化生產(chǎn)試驗(yàn)。自此以后，大規(guī) 模采用液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)食藥用菌逐漸展開(kāi)。當(dāng)時(shí)主要研究靈芝 (Ganoderma lucidum) 、蜜環(huán)菌 (Armillariella mellea) 、銀耳 (Tremella fuciformis) 等的液體發(fā)酵應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)。 70 年代開(kāi)始研究香

4、菇(Lentin ulaedodes)、冬蟲(chóng)夏草(Cordyceps sinen sis)、黑木耳(Auricularia auricula) 、金針菇 (Flammulina velutipes) 、猴頭 (Hericium erinaceus) 、 草菇 (Volvariella volvacea) 等的液體發(fā)酵。2 液體發(fā)酵培養(yǎng)的特點(diǎn)原料來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉食藥用菌的液體培養(yǎng)所需的碳源可用工業(yè)葡萄糖、 工業(yè)淀粉及山芋粉等； 氮源可采用黃豆餅 粉、蠶蛹粉、 麩皮粉等。 為了降低成本， 通常還取用部分工業(yè)廢水為代用品， 如糖蜜廢母液、 木材水解液、各種大豆深加工廢水、玉米深加工廢水及淀粉廢水等

5、，原料來(lái)源相當(dāng)廣泛。菌絲體生長(zhǎng)快速在液體培養(yǎng)中， 液體培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分分布均勻， 有利于菌類(lèi)營(yíng)養(yǎng)體的充分接觸和吸收。 菌 絲細(xì)胞能在反應(yīng)器內(nèi)處于最適溫度、pH、氧氣和碳氮比的條件下生長(zhǎng)，能及時(shí)排放呼吸作用產(chǎn)生的代謝廢氣， 因此新陳代謝旺盛， 菌絲生長(zhǎng)分裂迅速， 能在短時(shí)間內(nèi)積累大量的菌絲體 和多糖、多肽等具有生理活性的代謝產(chǎn)物。生產(chǎn)周期短通過(guò)食藥用菌液體發(fā)酵培養(yǎng)獲得大量的菌絲體和生理活性物質(zhì)一般僅需要2-7 天的時(shí)間，且菌齡整齊，而固體培養(yǎng)需要 30-60 天。能有效降低菌種污染率液體菌種接入固體培養(yǎng)料時(shí)，具有流動(dòng)快，易分散、發(fā)菌點(diǎn)多、萌發(fā)快等特點(diǎn)，能有效 地降低袋栽食用菌在接種過(guò)程中的污染。

6、工廠化生產(chǎn)、無(wú)季節(jié)性生產(chǎn)中的食用菌液體發(fā)酵是在發(fā)酵罐內(nèi)、 控制最佳條件來(lái)培養(yǎng)菌體的， 因此不受季節(jié)性 限制。而固體培養(yǎng)往往需要有很大的培養(yǎng)空間，條件難以控制，且受季節(jié)影響較大3 食藥用菌液體發(fā)酵的培養(yǎng)基在食藥用菌的液體培養(yǎng)中， 影響發(fā)酵成敗的關(guān)鍵因素有兩個(gè)： 第一是菌種， 第二是培養(yǎng) 基。優(yōu)良的培養(yǎng)基應(yīng)該具備以下特點(diǎn)： 目的物產(chǎn)生率高； 產(chǎn)生目的物的菌絲體生長(zhǎng)良好， 發(fā)酵周期短；培養(yǎng)基成本低、原料來(lái)源廣；培養(yǎng)基對(duì)目的物的提取干擾少，目的物后處理工藝簡(jiǎn)單、得率高。液體培養(yǎng)基的組成根據(jù)培養(yǎng)基中組成的不同， 可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。 天然培養(yǎng)基的組成均為天 然有機(jī)物。合成培養(yǎng)基則是采用些已知化

7、學(xué)成分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作培養(yǎng)基。在生產(chǎn)上， 還根據(jù)工藝將培養(yǎng)基分為孢子培養(yǎng)基、 種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基。 但無(wú)論如 何劃分，每一種培養(yǎng)基的組成中都離不開(kāi)碳、氮、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、維生素和生長(zhǎng)素等。（一） 碳源碳源的含義為營(yíng)養(yǎng)物化學(xué)成分中必需含有大量的“C'元素，即含有“碳水化合物”。碳源主要用于供應(yīng)菌株生命活動(dòng)所需要的能量， 構(gòu)成菌體細(xì)胞及代謝產(chǎn)物， 是食藥用菌液體培 養(yǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)成分。碳源包括糖類(lèi) （單糖、 雙糖、 多糖） 、脂肪和某些有機(jī)酸。雙糖及多糖首先由菌體產(chǎn)生的 酶分解為單糖后再被利用。食藥用菌利用單糖、一般通過(guò)有氧分解、最終產(chǎn)物是二氧化碳、 水和能量。為降低培養(yǎng)基成本， 藥用真菌

8、的發(fā)酵常用些粗糧、 雜糧或糧食加工之后的下腳料作為 原料， 如玉米粉、蔗糖糖蜜、甜菜糖蜜等。還可利用野生植物淀粉的水解產(chǎn)物代替糧食作發(fā) 酵原料。不同的菌種對(duì)碳源種類(lèi)的要求及利用亦不樣，但絕大多數(shù)藥用真菌都能利用葡萄糖、 麥芽糖、蔗糖和淀粉。實(shí)際生產(chǎn)時(shí)，首先要通過(guò)實(shí)驗(yàn)了解菌株所能利用的幾種碳源是什么， 然后選出利用最好、來(lái)源較廣、成本較低的原料作碳源。必須指出，同一菌種在固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)時(shí)，所能利用的碳源是不同的。例如香菇、 金針菇、 鳳尾菇等在固體培養(yǎng)時(shí)可利用木質(zhì)素、 半纖維素及纖維素作為碳源， 而在液體培養(yǎng) 時(shí)就不宜用這些碳源。（二）氮源氮源指營(yíng)養(yǎng)物化學(xué)成分中必需大量含“N”的物質(zhì)。氮源主

9、要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)和含氮代謝物，是食藥用菌液體培養(yǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)成分。常用的氮源可分為有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源兩大類(lèi)。黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米 漿、蛋白胨、酵母粉、魚(yú)粉、蠶蛹粉、麥麩、酒糟、菌絲體等屬于有機(jī)氮源；氨水、硫酸銨、 尿素、硝酸銨、 硝酸鈉、磷酸氫二銨、 氯化銨等為無(wú)機(jī)氮源。 有機(jī)氮源除含有豐富的蛋白質(zhì)、 多肽和游離氨基酸之外，往往還含有少量糖、脂肪、微量元素及維生素、生長(zhǎng)素等。對(duì)絕大 多數(shù)食藥用菌，有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源更適合菌體的生長(zhǎng)。某些菌則只能利用銨鹽和硝酸鹽。一般，銨鹽能較快被菌體利用，NH44進(jìn)入細(xì)胞中可直接摻入有機(jī)化合物中；而N03被細(xì)胞吸收后，先還原成 NH4+,才用

10、于合成有機(jī)化合物。NH4或NO3-被吸收后會(huì)引起培養(yǎng)基酸化或堿化，因此在配制這類(lèi)培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)在培養(yǎng)基中加入少量緩沖物質(zhì)。不同菌種對(duì)氮源種類(lèi)的要求及利用程度亦不一致， 因此在確定培養(yǎng)基前應(yīng)在實(shí)驗(yàn)中設(shè)法 找到菌種所能利用的幾種較好氮源及最佳氮源， 然后根據(jù)成本、 原料來(lái)源是否容易等因素確 定氮源組成。同菌種在固體培養(yǎng)及液體培養(yǎng)時(shí)，可利用的最佳氮源不同三）碳、氮比 （C/N）碳、氮比指碳源及氮源在培養(yǎng)基中的含量比。 構(gòu)成菌絲細(xì)胞的碳、 氮比通常是： 812:1 。由于菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中，一般需50%的碳源作為能量供給菌絲呼吸，另50%的碳源組成菌體細(xì)胞。因此培養(yǎng)基中理想碳、氮比的理論值為1624:1 。

11、多數(shù)食藥用菌的固體培養(yǎng)，在營(yíng)養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)階段，含氮量以為宜，即C:N = 20:1 ;在子實(shí)體生長(zhǎng)階段以 %為宜，即 C:N=3040:1 為好。因此，降低培養(yǎng)基中的氮源是產(chǎn)生子 實(shí)體的前體。但在液體培養(yǎng)中就不存在這個(gè)問(wèn)題， 以菌絲增殖為目的的培養(yǎng)，通常碳、 氮比 以 20:1 為宜。雖然藥用真菌的液體培養(yǎng)一般要求較高的碳與氮比，即C:N= 20:1左右生長(zhǎng)較好，但許多菌種也能在較寬的碳、 氮比范圍內(nèi)生長(zhǎng)。不同的菌種所要求合適的碳、氮比，可通過(guò)實(shí)驗(yàn) 求得。（四）無(wú)機(jī)鹽與微量元素許多無(wú)機(jī)鹽及微量元素對(duì)菌種的生理過(guò)程的影響與其濃度有關(guān)。 不同的菌種， 對(duì)無(wú)機(jī)鹽 及微量元素要求的最適濃度也不同。1磷

12、磷是細(xì)胞中核酸、 核蛋白等重要物質(zhì)的組成部分， 又是許多輔酶 （ 或輔基 ）高能 磷酸鍵的組成部分。磷是食藥用菌液體發(fā)酵不可缺少的物質(zhì)，常加入磷酸二氫鉀以提供磷， 加入量大約為 %。2鎂 鎂在細(xì)胞中起著穩(wěn)定核蛋白、 細(xì)胞膜和核酸的作用， 而且是些重要酶的活化 劑，是藥用真菌液體培養(yǎng)中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分。 一般通過(guò)加入硫酸鎂以提供鎂， 濃度通常 是%。3鉀、鈣、鈉 鉀不參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的構(gòu)成， 但控制原生質(zhì)的膠態(tài)和細(xì)腦膜的透性。 鈣離子與細(xì)胞透性有關(guān)。 鈉離子能維持細(xì)胞滲透壓， 鈉離子可以部分代替鉀離子的作用。 三 種物質(zhì)需求量甚微，若采用天然培養(yǎng)基，可不必另加。4硫、鐵 硫是菌體細(xì)胞蛋白質(zhì)的組

13、成部分 （胱氨酸、半胱氨酸及蛋氨酸中皆含硫 ） ，鐵是細(xì)胞色素、 細(xì)胞色素氧化酶和過(guò)氧化氫酶的組成部分， 亦是菌體有氧代謝中不可缺少的5鋅、錳、鈷、銅鋅、錳、鈷等離子是某些酶的輔基或激活劑。銅是多元酚氧化酶的活性基。在配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意， 鎂和磷的添加不宜過(guò)多， 否則會(huì)帶來(lái)危害。 菌體對(duì)鋅、 錳、鈷、 銅等微量元素的需求量甚少，一般天然有機(jī)原料中均有，不必另加。碳酸鈣本身不溶于水，但可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)其中的酸堿度。磷酸鹽與碳酸鈣不宜混合滅菌， 否則會(huì)形成不溶于水的磷酸鹽， 使可溶性的磷酸鹽濃度 大大降低。（五）維生素與生長(zhǎng)素維生素在細(xì)胞中作為輔酶的成分， 具有催化功能。 大多數(shù)藥用真菌的培養(yǎng)都與 B

14、 族維生 素有關(guān)，而與維生素 A、K 關(guān)系不大。水溶性維生素對(duì)菌體的影響比脂溶性維生素大。維生 素B1是目前已知對(duì)絕大多數(shù)藥用真菌生長(zhǎng)有利的維生素。其適宜濃度在501000卩g/L之間。由于藥用真菌對(duì)維生素的需求量甚微， 因此在使用天然有機(jī)原料為培養(yǎng)基時(shí)般不需另 加。有時(shí)也可加入少量維生素B1。生長(zhǎng)素包括三十烷醇、吲哚乙酸、赤霉素、a-萘乙酸、激動(dòng)素等，在植物細(xì)胞的組織培養(yǎng)中用的較多。 在食用菌的固體栽培中， 目前還用一些菌絲生長(zhǎng)促進(jìn)劑及子實(shí)體增產(chǎn)促進(jìn) 劑等但在食藥用真菌的液體培養(yǎng)中應(yīng)用較少。六） 化合物利用食藥用菌具有生物轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)， 在培養(yǎng)基中加入某種化合物， 經(jīng)過(guò)生物合成后成為 我們所需

15、要的化合物。在合成甾體激素 （ 如可的松 ）時(shí)，利用某些食藥用真菌進(jìn)行氧化， 往往能在專(zhuān)一位置上導(dǎo) 入所需要的含氧基團(tuán)， 大大縮減了合成步驟， 并加快合成速度。 利用藥用真菌的生物氧化作 用合成藥物， 是一廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域。 這一應(yīng)用的前提是必須搞清藥用真菌的生物合成特性及 生物轉(zhuǎn)化的能力。具有生物合成能力的藥用真菌， 目前已知的多是些黑曲霉、 黃曲霉、 華根霉及酵母菌等， 而非一些能產(chǎn)生子座及子實(shí)體的子囊菌或擔(dān)子菌。這方面的工作還有待深入研究。在液體培養(yǎng)基中加入些藥性基質(zhì)， 經(jīng)過(guò)藥用真菌發(fā)酵后觀察藥性基質(zhì)的變化， 這是一 個(gè)新開(kāi)拓的講究領(lǐng)域，其發(fā)展前景十分遠(yuǎn)大。4 食藥用菌的搖瓶培養(yǎng)藥用真菌的

16、液體培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行， 一般通過(guò)搖瓶培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)。 即將藥用真菌試管母種 接入滅過(guò)菌的三角瓶培養(yǎng)液中，然后置于往復(fù)式或旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)搖床培養(yǎng)的菌絲體呈球狀、絮狀等多種形態(tài)。培養(yǎng)液可呈黏稠狀，清液狀等狀態(tài)， 并可有清香味或其他異味。 因菌液中有菌株發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物， 可呈不同顏色。 在實(shí) 驗(yàn)室中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)可摸索菌株液體發(fā)酵的適宜生長(zhǎng)條件及生理生化變化等。工廠化生產(chǎn) 時(shí)，先進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)作為接入種子罐的菌種。 搖瓶培養(yǎng)的菌絲體也可作為液體菌種接入固體 培養(yǎng)料中。搖瓶培養(yǎng)的有關(guān)參數(shù)：影響搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵質(zhì)量的諸因素有： 培養(yǎng)溫度、搖床的振蕩頻率、 瓶子的裝料系數(shù)， pH 值、菌齡、接種量、培

17、養(yǎng)液的粘度、光照等。（一） 溫度藥用真菌菌絲的增殖及次級(jí)謝產(chǎn)物的產(chǎn)生都在各種酶的催化下進(jìn)行， 而酶的催化反應(yīng)需 要適宜的溫度，不同的菌種有不同的適宜溫度。絕大多數(shù)藥用真菌菌絲生長(zhǎng)的適宜溫度在 2230C的范圍內(nèi)。以產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物為目的培養(yǎng)，其最適溫度出可能與菌絲生長(zhǎng)的最適 溫度不同。（二） 搖床的振蕩頻率和瓶子的裝料系數(shù)食藥用菌的液體培養(yǎng)使用的搖床有兩種： 旋轉(zhuǎn)式和往復(fù)式。 旋轉(zhuǎn)式搖床的偏心距可不同， 轉(zhuǎn)速可調(diào)或不可調(diào)； 往復(fù)式搖床的振幅可不同，其每分鐘的往返次數(shù)（震蕩頻率） 多是固定 的。搖床的振蕩頻率和瓶子的裝料系數(shù)關(guān)系到搖瓶中培養(yǎng)基的溶氧量，另外震蕩頻率還影響菌絲體所受的機(jī)械刺激。 食

18、藥用菌的液體培養(yǎng)多為好氧發(fā)酵， 要求有足夠的氧氣， 因此要求 有較高的搖床震蕩頻率。 然而振蕩頻率過(guò)快又會(huì)引起培養(yǎng)液的飛濺， 弄濕棉花塞。 所以振蕩 頻率要有一定的限度。（三）pH值食藥用真菌的液體培養(yǎng)時(shí)，要求有合適的pH值（即氫離子濃度），這是因?yàn)椋?. 培養(yǎng)基中pH值的變化，會(huì)影響到細(xì)胞內(nèi)pH值的變化，而細(xì)胞內(nèi)pH值合適與否，會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性，大多數(shù)酶催化反應(yīng)的最適pH值為48。2. pH值對(duì)一些微量元素的利用有影響一些金屬離子形成的復(fù)合物在某pH值下是不溶的。如鎂離子與磷酸在酸性條件下呈游離狀態(tài)， pH 升高會(huì)形成不可溶的復(fù)合物，不能被 菌體吸收利用。鐵離子在堿性培養(yǎng)基中形成不可溶的

19、復(fù)合物。鈣與鋅離子也有類(lèi)似現(xiàn)象。3. pH 值影響細(xì)胞的滲透性 在酸性條件下，細(xì)胞質(zhì)膜被氫離子飽和，限制了陽(yáng)離子 的通行；在堿性條件下，細(xì)胞質(zhì)膜被氫氧根離子飽和，限制了陰離子的通行。大多數(shù)藥用真菌的液體發(fā)酵，多采用自然pH或控制在pH值的范圍內(nèi)。如果需要對(duì)培養(yǎng)液的pH進(jìn)行調(diào)節(jié)時(shí)?？刹捎玫蜐舛鹊臍溲趸c及鹽酸進(jìn)行。菌液的pH值是各種生化反應(yīng)的綜合結(jié)果。一般發(fā)酵培養(yǎng)到了中期，pH值開(kāi)始下降；到了發(fā)酵后期，有的菌種菌液中pH會(huì)回升。發(fā)酵過(guò)程中由于加糖太多而又供氧不足時(shí)，碳源氧化不完全導(dǎo)致有機(jī)酸積累，引起pH下降。一些無(wú)機(jī)鹽，如碳酸銨被菌絲利用后會(huì)引起pH下降。葡萄糖作為碳源時(shí)，因丙酮酸迅速積累，會(huì)引

20、起pH下降；而以乳糖為碳源時(shí)因乳糖的吸收較緩慢，pH值下降較慢。因此，測(cè)定不同菌齡時(shí)培養(yǎng)液中的pH值，對(duì)了解菌絲的生長(zhǎng)、代謝、生理生化反應(yīng)等是一重要因素。要精確測(cè)定pH值，可用酸度計(jì)進(jìn)行，也可用 pH試紙先進(jìn)行粗測(cè)。搖瓶培養(yǎng) 的pH測(cè)定必須將菌液倒出測(cè)定。（四）菌齡所謂菌齡就是指菌株液體培養(yǎng)的時(shí)齡、是菌種接入培養(yǎng)液后開(kāi)始計(jì)算的累積發(fā)酵時(shí)間。 食藥用菌的液體發(fā)酵也要經(jīng)歷延滯期、生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期及衰亡期等。不同的菌株，隨著菌齡的增加，這幾個(gè)時(shí)期的劃分也不一樣（五）接種量搖瓶培養(yǎng)的接種量指一級(jí)搖瓶種子對(duì)二級(jí)搖瓶所接入菌液量與培養(yǎng)液的比值。如對(duì)二級(jí)搖瓶 1000ml 的培養(yǎng)液中接人 50ml 的菌液，稱接種量為 5%。這種接種量的計(jì)量方法比較粗 糙，并不精