分子印跡聚合物簡介PPT課件

1、主要內(nèi)容一 、分子印跡基礎(chǔ)知識二 、文獻(xiàn)介紹三、最近實驗情況第1頁/共27頁一、分子印跡基礎(chǔ)知識1、分子印跡技術(shù) 分子印跡技術(shù)是當(dāng)前發(fā)展高選擇性材料的主要方法之一，其原理是模仿自然界抗原-抗體反應(yīng)機(jī)理，在聚合物材料中引入分子識別位點，制備在空間和結(jié)合位點上與特定目標(biāo)分子相匹配的、具有特定預(yù)定選擇性的高分子化合物分子印跡聚合物。第2頁/共27頁2 、分子印跡技術(shù)基本原理 分子印跡就是將模板分子與功能單體通過共價、非共價或金屬協(xié)同作用形成預(yù)聚合物，在交聯(lián)劑的作用下功能單體發(fā)生聚合，將模板分子固定在聚合物中，最后脫除模板分子，即聚合物材料上留下與模板分子在大小、形狀和官能團(tuán)的方向上都互補(bǔ)的空穴結(jié)構(gòu)。

2、空穴不僅保留了與模板分子化學(xué)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的官能團(tuán)的有序排列，也維持了它的整個空間構(gòu)象，所以當(dāng)材料再次遇到模板分子時，可發(fā)生特異性的結(jié)合。第3頁/共27頁3、分子印跡聚合物制備方法3.1 整體印跡 將印跡分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑按一定比例溶解在惰性溶劑中，然后移入一玻璃安培瓶中，采用超聲波脫氣，然后通入氮氣以除氧，在真空下密封安培瓶，經(jīng)加熱或紫外光照射引發(fā)聚合得到塊狀聚合物。塊狀聚合物經(jīng)粉碎、研磨、篩選等過程獲得合適大小的粒子，洗脫除去模板分子。 Hawkin等以異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) 標(biāo)記的白蛋白為模板蛋白, 丙烯酰胺和N, N

3、-亞甲基雙丙烯酰胺分別為功能單體和交聯(lián)劑, 用整體印跡法制備印跡材料。共聚焦顯微鏡圖片顯示, 標(biāo)記了熒光的模板蛋白均勻分布于分子印跡凝膠骨架材料中, 材料經(jīng)10% 十二烷基硫酸鈉(sodiu dodecylsulfate, SDS)/10% 醋酸溶液洗滌后熒光消失，證明SDS溶液可以使印跡蛋白變性并將其脫除。 Ye等設(shè)計了新型功能單體，可以通過金屬協(xié)同作用與模板蛋白的特定氨基酸序列結(jié)合，以此構(gòu)造更均一的結(jié)合位點，并在一定程度上減少非特異性吸附。N-(4-乙烯基）-苯甲基亞胺基雙醋酸（N-（4-vinyl)-benzyl iminodiacetic acid,VBIDA)是一種金屬螯合單體，它可

4、與二價銅離子螯合作為橋梁，再通過銅離子與蛋白表面暴露的組氨酸相互作用形成復(fù)合物。用EDTA將模板蛋白脫除，從而在材料上留下結(jié)合位點。 第4頁/共27頁 Qin等以溶菌酶為模板蛋白，N-異丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺和VBIDA為功能單體，用冷凍聚合法制得印跡溶菌酶的熱敏大孔水凝膠。這種智能水凝膠對模板蛋白表現(xiàn)出很強(qiáng)的吸附能力，印跡因子可達(dá)7.87，并在多種蛋白的混合溶液中對模板蛋白實現(xiàn)成功分離。第5頁/共27頁 Brown等用溶膠-凝膠法制備無定形聚硅氧烷印跡材料，用無定形硅印跡溶菌酶多肽序列（16-residue peptide lysozyme C,1.8 kDa)識別位點實際就相當(dāng)于識別整個分

5、子，與傳統(tǒng)的有機(jī)材料相比，首先小段多肽與單體材料有更強(qiáng)和更具特異性的相互作用，以此減少非特異性吸附并增強(qiáng)材料對模板的親和力，其次，小段多肽在有機(jī)試劑中相對穩(wěn)定，因而其有機(jī)試劑也可作為聚合的介質(zhì)對模板蛋白結(jié)合力強(qiáng)，選擇性好，蛋白進(jìn)出材料骨架速度快，此種方法相當(dāng)于抗原決定基法。第6頁/共27頁 整體印跡法工藝雖然簡單，但后續(xù)處理復(fù)雜耗時，所得材料需經(jīng)研磨和過篩才能得到所需粒徑范圍的顆粒，并不適合工業(yè)化生產(chǎn)。另外，此種方式制得的材料外形不規(guī)則，限制了其在色譜和固相萃取領(lǐng)域的應(yīng)用。最重要的是，整體聚合時不可避免地會有大量的印跡位點分布于材料內(nèi)部，不利于蛋白質(zhì)的進(jìn)出。第7頁/共27頁3.2 表面印跡 在

6、聚合物的表面或近表面構(gòu)造模板蛋白的結(jié)合位點稱為“表面印跡”。與整體印跡旨在構(gòu)造蛋白特異性三維結(jié)構(gòu)不同的是，表面印跡的特點是在材料的表面構(gòu)建蛋白的“二維印跡”。這樣的二維陰極材料從某種程度上解決了生物大分子難以進(jìn)出聚合物材料的問題，可大大縮短蛋白擴(kuò)散進(jìn)入材料并達(dá)到平衡的時間。然而，與“三維印跡”材料性比，“二維印跡”材料可能會出現(xiàn)對模板蛋白選擇性降低的問題。第8頁/共27頁 El kirat 等首先對玻璃板進(jìn)行硅烷化，用雙功能交聯(lián)劑將模板蛋白接枝與其上，繼而在表面進(jìn)行單體材料丙烯酰胺的聚合，由此制得二維結(jié)構(gòu)印跡材料。該研究小組首次用AFM對材料進(jìn)行表征。AFM對材料表面的局部圖像顯示，印跡薄膜上

7、分布有許多與模板蛋白大小形狀互補(bǔ)的小孔穴，而非印跡薄膜圖像模糊，無明顯凹痕。小組以細(xì)胞色素c為模板，并將模板蛋白細(xì)胞色素c共價結(jié)合與AFM的探針上，借助力-距離曲線探測出其在納米尺度的范圍內(nèi)與印跡材料的特異性結(jié)合力在8595pN之間。將非模板蛋白牛血清白蛋白共價結(jié)合與探針上作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)探針與印跡材料沒有特異性相互作用。將連接了模板單板的探針與非印跡材料相互作用也得到同樣地結(jié)果。證明模板與印跡位點具有特異性親和力。第9頁/共27頁 Su等選用甲基丙烯酸為功能單體，聚乙二醇400二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，用微接觸印跡法制備了卵清蛋白印跡薄膜。印跡薄膜的AFM圖像顯示，材料上分布有直徑約34nm

8、的空穴，材料經(jīng)蛋白重結(jié)合后圖像表明卵清蛋白以直徑為3236nm的蛋白簇形式重結(jié)合與表面的空穴中。 生物分子相互作用分析 (biomolecular interaction analysis) 中常使用一種基于表面等離子共振技術(shù)(surface plasmon resonance, SPR) 的生物傳感分析技術(shù)。實驗時先將一種生物分子固定于傳感器芯片上,使與之相互作用的另一生物分子甚至是細(xì)胞、病毒等的溶液流經(jīng)該芯片。當(dāng)兩者發(fā)生相互作用時, 芯片表面溶液會發(fā)生折射率的改變, 從而引起共振角的變化, 可實現(xiàn)實時跟蹤檢測生物分子間結(jié)合與解離過程的變化及其相互作用的強(qiáng)弱 第10頁/共27頁 Li 等將高

9、度交聯(lián)的殼聚糖微球作為“核”通過可逆的席夫堿反應(yīng)共價連接模板蛋白BSA，最后在此多糖-蛋白的界面上通過溶膠-凝膠過程覆蓋一層聚硅氧烷的“殼”。用乙二酸破壞席夫堿從而將模板蛋白從“核”上脫除，而“殼”上則將模板的大小、形狀及空間構(gòu)象保留下來。此法制備的微球表面具有較粗糙的多孔結(jié)構(gòu)。掃描電鏡圖像顯示，印跡微球表面形成大量分布均勻、網(wǎng)狀連接的空穴。BET氮氣吸附試驗結(jié)果表明，作為支撐基質(zhì)的殼聚糖微球BET表面積為41.25m2g-1平均孔徑為8.7 nm。而“核-殼”型印跡微球的BET 表面積為48.65 m2g-1,平均孔徑達(dá)43.2 nm。表面積和孔徑的增加提示了印跡位點的形成。 Tan 等19

10、用微乳液聚合法制備超順磁性亞微粒。預(yù)先制備Fe3O4 磁性納米粒, 將功能單體甲基丙烯酸甲酯和交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸分散在油相中, 用微乳液聚合法制備表面印跡核糖核酸酶A(ribonuclease A, RNase A) 的亞微粒。與非印跡材料相比, 印跡材料在混合蛋白溶液中對模板蛋白有很好的選擇性。第11頁/共27頁 Tan 等以甲基丙烯酸甲酯為功能單體, 乙二醇二甲基丙烯酸為交聯(lián)劑, 用微乳液 (W/O/W 復(fù)乳)聚合法制備了印跡RNase A 的納米粒。該法中使用了較高濃度的SDS 和聚乙烯醇作為乳化劑。作者認(rèn)為, 當(dāng)兩親性的蛋白被加入預(yù)聚合微乳液后, 蛋白會吸附于表面活性劑形成的膠束

11、中并被分配到油-水兩相的界面上。聚合反應(yīng)引發(fā)后,蛋白便被“束縛”在膠束的表面了。研究表明, 蛋白和表面活性劑的相互作用有助于蛋白停留在納米粒表面, 然而太劇烈的作用卻會導(dǎo)致蛋白明顯的構(gòu)象變化, 甚至變性, 造成錯誤的印跡。印跡納米粒 Hoshino 等用沉淀聚合法制備兩親性多肽蜂毒肽為模板的聚合物納米粒。沉淀聚合法制備條件溫和，材料聚合過程中無需有機(jī)試劑或加熱過程。由于Mel具兩親性，傾向于停留在聚合物-水相的界面上，在此位點上，Mel既能輔助材料的聚合，又能在材料上創(chuàng)建與之互補(bǔ)的特異性結(jié)合位點，在一定程度上達(dá)到“表面印跡”的效果。第12頁/共27頁二 文獻(xiàn)介紹（一）、氨基硅球表面印跡牛血清白

12、蛋白分離條件的初步探索 文獻(xiàn)探討了識別蛋白質(zhì)分子過程中是何種作用力起主導(dǎo)作用。選擇無機(jī)前驅(qū)體、氨基硅烷和烴基硅烷為功能單體，牛血清白蛋白為模板分子，牛血紅蛋白和溶菌酶為競爭蛋白，采用固定模板蛋白表面印跡的方法在氨丙基衍生的硅球表面制備了溶膠-凝膠的MIPs。 第13頁/共27頁1、印跡聚合物對不同蛋白質(zhì)分離選擇性的評價 取M IPs和N IPs各0. 1 g置于離心管中, 分別加入1mL 0. 5 g /L各蛋白質(zhì)溶液( pH 7. 0, 0. 01mo l/L磷酸鹽緩沖液), 室溫下振蕩吸附3 h。將離心管于離心機(jī)中4000 r /m in離心3m in后, 取上層清液用紫外吸收法測定蛋白質(zhì)

13、的含量, 根據(jù)吸附前后蛋白質(zhì)濃度的變化、溶液體積和聚合物的質(zhì)量計算吸附量(Q )。Q 定義為每單位質(zhì)量( g )聚合物的吸附量: Q = (C0 - C t ) V /m ( 1) C0 為初始蛋白質(zhì)濃度( g /L), C t 為上清液中蛋白質(zhì)濃度( g /L), V 為蛋白質(zhì)溶液體積(mL) , m 為印跡聚合物質(zhì)量( g)。 印跡聚合物對不同蛋白質(zhì)分離選擇性用印跡因子()和選擇因子()來評價。定義為 = QM IP /QN IP ( 2) QM IP和QN IP分別為印跡聚合物和非印跡聚合物對蛋白質(zhì)的吸附容量。 定義為: = 模板蛋白/ 競爭蛋白 ( 3) 模板蛋白和/ 競爭蛋白分別為模

14、板蛋白和競爭蛋白的印跡因子。第14頁/共27頁2、烴基硅烷單體的種類對MIP選擇性的影響 分別比較了PTMOS、HTMOS、PhTMOS、OTMOS為單體的MIP 的分離選擇性。單體PhTMOS主要以-作用和蛋白結(jié)合，而PTMOS、HTMOS及OTMOS是通過疏水力與模板分子作用。實驗結(jié)果顯示，無論以何種單體為材料制備的MIP都對模板蛋白具有選擇性吸附，這說明無論是疏水力還是-作用在識別蛋白中都有一定貢獻(xiàn)。制備MIP的分離選擇性的強(qiáng)弱順序為OTMOSHTMOS PTMOS,這說明碳鏈的長度越長，疏水性越大，對模板的分離選擇性就越強(qiáng)。 然而當(dāng)由眾多弱作用力總體產(chǎn)生的強(qiáng)作用被幾個強(qiáng)的結(jié)合點代替時M

15、IP的特異性會降低。實驗中，由PhTMOS制備的MIPs選擇性優(yōu)于PTMOS，但不如HTMOS和OTMOS制備的MIPs,說明疏水作用比-作用對MIPs特異性作用貢獻(xiàn)大。原因可能有a. PhTMOS與蛋白質(zhì)上的芳香族氨基酸發(fā)生-作用，而多數(shù)蛋白含有的芳香族氨基酸很少，對于含有上百個氨基酸的蛋白質(zhì)來說，不可避免會造成一定程度的非特異性結(jié)合;b. -作用是一種短程作用力，只有在蛋白質(zhì)與MIPs近距離接觸時才會產(chǎn)生；而疏水力無方向性，作用快速，對結(jié)合蛋白質(zhì)這種體積龐大的分子更有利。第15頁/共27頁3、氨基硅烷單體種類對MIPs選擇性的影響 APTMS同APTES做功能單體相比，對模板蛋白的印跡效果

16、好，且對競爭蛋白的Q值小。溶膠凝膠是以硅原子為中心，經(jīng)過雙原子親核取代反應(yīng)形成的。在雙原子親核取代反應(yīng)中，官能團(tuán)-OC2H5同-OCH3相比反應(yīng)活性更大，從而加速水解和縮聚步驟，使形成的溶膠凝膠MIP結(jié)構(gòu)更規(guī)則，識別位點更有序。MIPs對模板分子的選擇性和親和性不僅是因為MIPs中含有可以進(jìn)行專一反應(yīng)的結(jié)合位點，更為重要的是功能單體在MIPs上形成了高度有序的結(jié)構(gòu)。第16頁/共27頁4、硅烷單體的比例對MIPs吸附性能的影響 實驗中選擇烴基硅烷、氨基硅烷和無機(jī)前驅(qū)體四乙氧基硅烷( TEOS) 3種單體。氨基硅烷主要通過氫鍵與模板蛋白作用, 烴基硅烷主要通過疏水力與模板蛋白作用, 通過優(yōu)化二者的

17、比例發(fā)揮疏水力和氫鍵的協(xié)同作用, 產(chǎn)生對模板分子最好的特異性識別; 并且在制備M IPs時加入15% TEOS, 此功能單體起一定的交聯(lián)作用, 使制備過程形成極有規(guī)則又適宜結(jié)合模板蛋白的孔穴。實驗考察了不同比例的氨基硅烷與烴基硅烷對模板蛋白QM IP的影響。結(jié)果顯示, 隨著氨基硅烷比例的增加, 模板蛋白的QM IP減小。這是因為氨基硅烷本身帶有的氨基會與硅球表面的醛基反應(yīng)形成亞胺鍵, 阻止了模板蛋白與醛基的進(jìn)一步結(jié)合, 使得QM IP減小; 而隨著烴基硅烷比例的增加, 模板蛋白的QM IP逐漸增大, 當(dāng)二者之比為1. 5 /1時, QM IP達(dá)到最大值。 綜合考慮上面兩種因素對于M IPs吸附

18、性能的影響, 在實驗中選擇烴基硅烷單體與氨基硅烷單體的比例為1.1, M IPs配方為OTMOS.APTES.TEOS摩爾比是 42. 5 ： 42. 5：15。第17頁/共27頁5、合成條件的酸度( pH)對MIPs選擇性的影響 當(dāng)選擇了適宜的硅烷單體類型, 烴基硅烷、氨基硅烷的種類, 及各單體間適宜的比例, 又繼續(xù)研究合成條件的酸度( pH )對M IPs選擇性的影響。pH 分別為4. 9, 7. 0, 9. 0時聚合物對模板蛋白BSA及競爭蛋白HB、Lysozym e吸附的柱狀圖。通過比較不同pH下的競爭吸附實驗可知, 當(dāng)pH= 7. 0時, 模板蛋白與MIPs間的疏水力, 氫鍵作用,

19、靜電力及印跡孔穴等的協(xié)同作用使得此時的吸附選擇性最佳。第18頁/共27頁 較高的pH 值加速溶膠-凝膠形成過程中水解和縮合步驟, 增加二氧化硅粒子的溶解, 同時還將導(dǎo)致粒子的去質(zhì)子化程度增加和表面電荷的增多, 從而延長了團(tuán)聚和凝膠化過程。因此在高pH環(huán)境的溶膠凝膠體系中可以制得高孔隙率、大孔徑及高比表面積的產(chǎn)物。第19頁/共27頁6.優(yōu)化洗脫固定模板蛋白的方法 為了進(jìn)一步改善制備的MIPs各方面性能, 本實驗將本體系與以溶膠-凝膠為材料印跡蛋白的相關(guān)工作進(jìn)行比較。文獻(xiàn)工作中同被固定的模板蛋白相比僅有少量的蛋白質(zhì)(約15% )被洗脫, 大量的識別位點沒有暴露出來, 這大大限制了MIPs的吸附量及

20、選擇性。因此, 有效地將固定的模板蛋白去除是改善本方法制備的MIPs性能的關(guān)鍵。鍵。第20頁/共27頁 氨基硅球表面印跡牛血清白蛋白分離選擇性優(yōu)化條件的總結(jié) 由以上的實驗可知, 對于氨基硅球表面印跡牛血清白蛋白體系, 選擇烴基硅烷為OTMOS、氨基硅烷為APTES、無機(jī)前驅(qū)體為TEOS制備MIPs, 它們的摩爾比為42. 5：42. 5：15, 合成條件的酸度為pH 7. 0,并采用0. 1mo l/L NaOH與10% ( V /V) HAc-10% (m /V) SDS聯(lián)用的方法洗脫固定的模板蛋白, 由此制備的M IPs的分離選擇性能最佳。 本體系中采用溶膠.凝膠印跡蛋白質(zhì), MIPs與模

21、板分子間主要通過疏水力和氫鍵相互作用。 疏水作用是一種非短程作用力, 當(dāng)模板蛋白與MIPs較遠(yuǎn)時就產(chǎn)生，眾多疏水力的總體作用使模板蛋白逐漸靠近與模板分子表面形成互補(bǔ)的“印跡孔穴”。在模板蛋白進(jìn)入“印跡孔穴”時會產(chǎn)生類似于抗體與抗原之間的 “誘導(dǎo)契合”, 這種“誘導(dǎo)契合”是蛋白質(zhì)分子與印跡孔穴產(chǎn)生“近接觸”的基礎(chǔ)。隨著“近接觸”的發(fā)生, 氫鍵、-作用等短程作用力才發(fā)揮作用, 它們和疏水力協(xié)同產(chǎn)生強(qiáng)的整體作用力與模板蛋白結(jié)合, 使得MIPs對模板蛋白質(zhì)具有較高的分離選擇性。競爭蛋白因大小和形狀與模板蛋白質(zhì)不同, 與 “印跡孔穴”的構(gòu)象不匹配, 無法產(chǎn)生“誘導(dǎo)契合”, 也就不具備產(chǎn)生眾多弱鍵協(xié)同作用

22、所需的前提條件“近接觸”, 因而無法形成整體強(qiáng)的結(jié)合作用, MIPs對其分離選擇性就會比較低。同樣NIPs因不具有可產(chǎn)生“誘導(dǎo)契合”的“印跡孔穴”, 故對模板蛋白和競爭分子均無選擇性吸附, 相應(yīng)也就不具備分子識別能力。 MIPs識別蛋白質(zhì)機(jī)理的初步討論識別蛋白質(zhì)機(jī)理的初步討論第21頁/共27頁2、Composite of CdTe quantum dots and molecularly imprinted polymer as a sensing material for cytochrome c 在CdTe量子點表面包裹分子印跡聚合物特異性識別模板分子細(xì)胞色素c，印跡過程采用溶膠-凝膠法反應(yīng)，印跡過程中提