最新電鏡目前的技術(shù)難點(diǎn)及未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)

1、5冷凍電鏡目前的技術(shù)難點(diǎn)及未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)與其他的結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物物理學(xué)研究方法類似，冷凍電子顯微學(xué)在硬件設(shè)備上的長(zhǎng)足進(jìn)展解決了很多關(guān)鍵性的技術(shù)難點(diǎn)，使該方法的應(yīng)用普及成為趨勢(shì)。同時(shí)，一些其他的技術(shù)難點(diǎn)凸顯出來(lái)，成為結(jié)構(gòu)解析中的瓶頸，需要更多的關(guān)注與投入。5.1 樣品制備技術(shù)樣品制備一直是冷凍電子顯微學(xué)研究的關(guān)鍵步驟。對(duì)于生物大分子結(jié)構(gòu)研究來(lái)說(shuō)，需要保證單顆粒分子以合適的密度均勻分布于厚度合適的無(wú)序冰中，才有可能獲得良好的電子顯微數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。由于不同的生物大分子與樣品支持膜的相互作用及在水溶液中的性質(zhì) 各不相同，分子在樣品中的分布狀態(tài)各異。目前普遍采用的冷凍制樣技術(shù)在基本原理上仍然采用30年

2、前發(fā)明的方法，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性、操作可移植性、通用性等都很差。樣品制備已經(jīng) 成為冷凍電子顯微學(xué)結(jié)構(gòu)解析的限速步驟。冷凍電子顯微學(xué)要想成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的主要應(yīng)用手段，必須在樣品制備這一步驟取得重要的突破。類似的，對(duì)于細(xì)胞結(jié)構(gòu)研究來(lái)說(shuō)，將 本身很厚的細(xì)胞樣品進(jìn)行減薄處理，才適合冷凍電鏡觀察。 在過(guò)去的十多年里， 冷凍切片技術(shù)一直在穩(wěn)步發(fā)展，至今已經(jīng)成為相對(duì)成熟的技術(shù)，但是對(duì)該技術(shù)的熟練掌握仍然需要長(zhǎng)期的培訓(xùn)與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。最近發(fā)展起來(lái)的聚焦離子束減薄技術(shù)在未來(lái)可能會(huì)對(duì)冷凍細(xì)胞樣品的結(jié) 構(gòu)研究帶來(lái)新的契機(jī)。5.2 高分辨率結(jié)構(gòu)的分析與建模應(yīng)用冷凍電子顯微學(xué)技術(shù)在過(guò)去的兩年里所獲得的近原子分辨率（4?以上）

3、三維結(jié)構(gòu)的數(shù)目幾乎超過(guò)了前面幾十年所獲得的高分辨率結(jié)構(gòu)數(shù)目之和。更多的在48?分辨率范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)在很短時(shí)間內(nèi)被解析出來(lái)，不同的分辨率結(jié)構(gòu)可以揭示出的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)亦不同。而與晶體學(xué)手段不同，冷凍電子顯微學(xué)單顆粒重構(gòu)無(wú)法通過(guò)對(duì)晶格衍射點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)判斷分辨 率。因此，如何客觀地對(duì)三維重構(gòu)的結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)、明確結(jié)構(gòu)解析的分辨率是目前高分辨率冷凍電鏡研究中的一個(gè)重要問(wèn)題。在此基礎(chǔ)上，需要對(duì)不同分辨率水平的三維重構(gòu)進(jìn)行原子模型的構(gòu)建，從而實(shí)現(xiàn)在原子水平上對(duì)分子功能的解釋。對(duì)于分辨率在 4?以上的三維重構(gòu) 基本可以應(yīng)用X射線晶體學(xué)現(xiàn)有的方法進(jìn)行建模；對(duì)分辨率在4?以下的三維結(jié)構(gòu)如何建立 較為可信的模型，則仍缺少

4、相對(duì)成熟并被普遍接受的方法。一些研究組正在利用同源建模、 分子動(dòng)力學(xué)模擬等手段來(lái)進(jìn)行這一分辨率水平的原子模型搭建的嘗試。5.3 生物大分子構(gòu)象不均一性的分析冷凍電子顯微學(xué)單顆粒結(jié)構(gòu)解析技術(shù)與晶體學(xué)技術(shù)的一個(gè)重要差異是不需要溶液中的生物大分子形成高度有序的晶體排列，因而可以直接獲得溶液中的生物大分子結(jié)構(gòu)。但生物大分子尤其是大分子復(fù)合體本身的構(gòu)象柔性亦因此沒(méi)有被固定在晶體結(jié)構(gòu)中，這些構(gòu)象柔性反映在電子顯微圖像中，常常是導(dǎo)致三維重構(gòu)無(wú)法獲得高分辨率結(jié)構(gòu)的根源。將不同構(gòu)象的分子分開(kāi)分析，是提高重構(gòu)分辨率的重要過(guò)程。此外，分子在溶液中的不同構(gòu)象很可能反映了分子發(fā)揮功能的不同結(jié)構(gòu)形態(tài)，理解這些構(gòu)象差異對(duì)于

5、解釋分子功能的機(jī)制非常重要。目前對(duì)生物大分子構(gòu)象不均一性的分析是冷凍電子顯微學(xué)結(jié)構(gòu)解析中的技術(shù)難點(diǎn)和熱點(diǎn)?，F(xiàn)有的一些算法通過(guò)聚類分析、最大似然法分析等對(duì)某些生物大分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析取得了重 要的發(fā)現(xiàn)，但對(duì)這個(gè)問(wèn)題的解決需要更多的新思路和新算法。5.4 電子光學(xué)新技術(shù)方法在生物樣品研究中的應(yīng)用材料科學(xué)超高分辨率研究在過(guò)去十幾年里也發(fā)生了很多重要的技術(shù)進(jìn)步，主要是電子顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的不斷完善和提高，以及新的成像手段的進(jìn)步，新的技術(shù)諸如球差矯正、色差矯正、掃描透射電子顯微鏡系統(tǒng)等都在材料科學(xué)領(lǐng)域結(jié)構(gòu)分辨率的顯著提高中發(fā)揮了重要作 用。目前，利用最新的電子光學(xué)成像系統(tǒng)，物理學(xué)和材料科學(xué)研究者已經(jīng)可以

6、獲得0.5?的分辨率。隨著對(duì)生物樣品近原子分辨率結(jié)構(gòu)解析能力的逐漸普及，更高的分辨率必然成為冷凍電子顯微學(xué)發(fā)展的下一個(gè)目標(biāo)。如何應(yīng)用材料科學(xué)領(lǐng)域證明對(duì)超高分辨成像卓有成效的電子顯微學(xué)方法來(lái)提高生物樣品的結(jié)構(gòu)解析分辨率，是擺在所有冷凍電子顯微學(xué)家面前的新機(jī)遇和挑戰(zhàn)。此外，新的技術(shù)如電子顯微鏡相位板(phase-plate)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用已經(jīng)被證明對(duì)于利用單顆粒技術(shù)解析小分子量的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及利用電子斷層掃描三維重構(gòu)技術(shù)研究細(xì) 胞結(jié)構(gòu)具有重大的促進(jìn)作用。該項(xiàng)技術(shù)很可能在未來(lái)幾年里引起冷凍電子顯微學(xué)的另一次新 的重大突破。5.5 體內(nèi)結(jié)構(gòu)的研究自從上世紀(jì)中期建立以來(lái)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)主要是通過(guò)對(duì)分離純化至體

7、外的生物大分子結(jié)構(gòu) 進(jìn)行解析。至今解析出來(lái)的多達(dá)10萬(wàn)的生物大分子結(jié)構(gòu)對(duì)于我們理解生物學(xué)過(guò)程的分子機(jī)制發(fā)揮了重要的作用。但迄今為止，我們?nèi)詿o(wú)法通過(guò)直接觀察獲得細(xì)胞內(nèi)乃至體內(nèi)的生物大 分子的原子分辨率結(jié)構(gòu)。冷凍電子顯微學(xué)尤其是三維斷層掃描重構(gòu)的發(fā)展給我們提供了這樣 的契機(jī)。通過(guò)更穩(wěn)定的電子顯微鏡系統(tǒng)、更高效的數(shù)據(jù)采集裝置、更強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)處理工具， 三維斷層掃描重構(gòu)將有可能幫助我們對(duì)細(xì)胞內(nèi)的特定分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行重構(gòu)和統(tǒng)計(jì)分析，從而獲得它們的高分辨率結(jié)構(gòu)。如何對(duì)細(xì)胞中特定分子的標(biāo)定則是目前冷凍電子顯微學(xué)細(xì)胞結(jié)構(gòu)研 究面臨的一個(gè)主要技術(shù)問(wèn)題。如果能實(shí)現(xiàn)以上目標(biāo)，冷凍電子顯微學(xué)將可能真正填補(bǔ)結(jié)構(gòu)生 物學(xué)與細(xì)

8、胞生物學(xué)之間的空隙，使得我們從不同空間與時(shí)間尺度上對(duì)生物體的理解更加完 整。6個(gè)人感悟與結(jié)論縱觀整個(gè)冷凍電鏡的工作流程，我們發(fā)現(xiàn)冷凍電鏡的基本工作原理其實(shí)不難以理解，但整個(gè)冷凍電鏡的結(jié)構(gòu)非常的龐大與復(fù)雜，目前可以生產(chǎn)并且銷售這種昂貴的冷凍電鏡的公司也只有美國(guó)FEI等少數(shù)幾家專業(yè)的顯微鏡制造公司，顯然目前我國(guó)還并沒(méi)有掌握這種高精尖儀器的生產(chǎn)制造技術(shù)，我國(guó)整體的科學(xué)儀器制造水平與美國(guó)等西方發(fā)達(dá)國(guó)家相比仍然是存在 較大的差距。結(jié)合儀器專業(yè)的角度來(lái)看冷凍電鏡的結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)冷凍電鏡技術(shù)其實(shí)在很多方面與我們儀器專業(yè)密切相關(guān)，比如說(shuō)冷凍電鏡的一大優(yōu)點(diǎn)就是樣品臺(tái)穩(wěn)定，普通的電鏡穩(wěn)定工作臺(tái)需要10分鐘，而最好

9、的冷凍電鏡工作臺(tái)的穩(wěn)定時(shí)間已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)在20秒左右，效率至少是普通電鏡的30倍，如何設(shè)計(jì)這樣一種需要很快時(shí)間穩(wěn)定下來(lái)且精度要求很高的工作臺(tái)就是 我們儀器專業(yè)領(lǐng)域所要研究的問(wèn)題，我們可以遵循粗精結(jié)合、基面合一、變形最小等基本的儀器設(shè)計(jì)原則對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行設(shè)計(jì)，在設(shè)計(jì)的過(guò)程當(dāng)中可以借助計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行仿真，例如我們可以利用ANSYS軟件，運(yùn)用有限元的思想仿真工作臺(tái)在受力情況下的變形程度以及計(jì)算 工作臺(tái)受外界擾動(dòng)后再次達(dá)到穩(wěn)定所需的時(shí)間，優(yōu)化設(shè)計(jì)工作臺(tái)的設(shè)計(jì)參數(shù)。而對(duì)于冷凍電鏡自動(dòng)換樣品、自動(dòng)換氮、自動(dòng)維持清潔功能的實(shí)現(xiàn)，結(jié)合我們儀器專業(yè)分析，自動(dòng)化功能 的實(shí)現(xiàn)首先是需要設(shè)計(jì)一系列的傳動(dòng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)，有了傳

10、動(dòng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的配合，儀器才可能完成一系列把樣品自動(dòng)送出、送入，自動(dòng)維持自身清潔等智能化的動(dòng)作，如何設(shè)計(jì)出這樣一整套既能夠?qū)崿F(xiàn)預(yù)期的功能，又要保證整個(gè)儀器的工作可靠性的系統(tǒng)，是我們?cè)趦x器設(shè)計(jì)的時(shí)候需要認(rèn)真去考慮的問(wèn)題。 光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)同樣也是儀器設(shè)計(jì)當(dāng)中一個(gè)重要的技術(shù)難點(diǎn)，對(duì)這些復(fù)雜、龐大的顯微儀器而言， 光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)就顯得尤為重要。顯微儀器設(shè)計(jì)的目的就是為了幫助人們更好地去認(rèn)識(shí)微觀世界，判斷顯微儀器的好壞最直接的方法就是看其成像的質(zhì)量，成像是否清晰，是否可以突破衍射極限，達(dá)到原子分辨率量級(jí)，而這又與光學(xué)有著直接的聯(lián)系。我們?cè)谠O(shè)計(jì)儀器光路系統(tǒng)的時(shí)候，如何能夠?qū)崿F(xiàn)光路的最優(yōu)化，如何可以消除球差、慧

11、差、像差、畸變、色散等一系列的像差問(wèn)題（借助專業(yè)的光學(xué)軟件Zemax、Code V等），如何選擇透鏡的面型 （結(jié)合透鏡的加工難度、價(jià)格等因素），如何盡可能用最少數(shù)量的透鏡達(dá)到光路的設(shè)計(jì)要求，如何在保證質(zhì)量要求的前提下盡可能減少系統(tǒng)的成本等等，這些都是我們?cè)陲@微儀器（包括冷凍電鏡這種高精尖儀器）光路系統(tǒng)設(shè)計(jì)過(guò)程當(dāng)中所要面臨的問(wèn)題，都與我們平時(shí)所學(xué)習(xí)的儀器專業(yè)基礎(chǔ)知識(shí)緊密結(jié)合。冷凍電子顯微學(xué)從 20世紀(jì)中葉開(kāi)始，經(jīng)歷了 80年代到90年代的技術(shù)方法建立時(shí)期， 21世紀(jì)初的技術(shù)成熟期，在過(guò)去的兩年里發(fā)生了革命性的技術(shù)進(jìn)步，進(jìn)入了快速發(fā)展期。結(jié)構(gòu)生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究者如何抓住這個(gè)契機(jī)，如何盡快適應(yīng)新

12、的局面，掌握新的技術(shù)，充分發(fā)揮該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)從而更加深入地研究生命現(xiàn)象，將是未來(lái)幾年里的一個(gè)主題。 冷凍電鏡技術(shù)是一個(gè)多學(xué)科交叉的技術(shù)，數(shù)學(xué)、物理學(xué)、計(jì)算機(jī)、材料、化學(xué)等自然科學(xué)將在未來(lái) 冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展中扮演重要的角色，未來(lái)冷凍電鏡是否能夠取代X射線晶體學(xué)，成為今后結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的主要工具，這一切都還是一個(gè)未知數(shù)。我國(guó)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)和儀器制造工作者應(yīng)該抓住冷凍電鏡所帶來(lái)的全新機(jī)遇，不斷縮小自身與世界先進(jìn)水平的差距，努力贏得新技術(shù)變革所帶來(lái)的挑戰(zhàn)。親愛(ài)的用戶：1、只要朝著一個(gè)方向努力，一切都會(huì)變得得心應(yīng)手。20.6,286.28,202015:2415:24:26Jun-2015:24春妻春密畫(huà)刎新桃換恒符帝那桃花盛并28地方，在3、有勇氣承擔(dān)命運(yùn)這才是英雄好漢。15:246.28.202015:246.28.202015:2415:24:266.28.202015:246.28.2020這醉火軻W坤節(jié)愿你嚏酒像春次554樣艷光，心情像桃5、閱讀使人充實(shí)，會(huì)談使人敏捷，寫(xiě)作使人精確。Sunday, June 28, 2020June 2